MALDI-TOFMS病原体鉴定质量保证专家共识

MALDI—TOFMS病原体鉴定质量保证专家共识基质关心激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorptionionizationtime —of—flightmassspectrometry,MALDI—TOFMS)作为一种兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物试验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。任何兴技术应用于临床都需要建立标准的质量保证体系，以确保检测质量。本专家共识将对开展MALDI—TOFMS用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与力量评估、MALDI-TOFMS病原体设施与安全要求•风险评估：MALDI—TOFMS病原体检测的试验室需在风险评估根底上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。•安全防护：任何操作临床病原体样本或病原体的试验活动至少需要在二级生物安全试验室(BSL2)中进展。MALDITOFMSMALDI—TOFMS检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要留意化学试剂的潜在风险。人员培训与力量评估各试验室应具备MALDI—TOFMS检测过程中涉及的全部操作人员的初次培训和定期力量评估的程序文件，对涉及的全部操作人员应进展初次和定期〔至少6个月一次〕的培训以及力量评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或试验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。此外，还应承受一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进展人员比对和 /或考核，以确保全部操作者鉴定结果的全都性。通过培训，要求每位操作人员对每种病原体的鉴定结果必需达到本试验室设定的每种病原体的最小结果阈值。保存全部培训、考核和能力评估记录。建议1对于临床常见细菌〔非高致病〕，操作人员的个人防护应按标准预防要求，其病原体分别培育、蛋白提取及靶板点样时应在生物安全柜内进展，点样后的靶板转移至 MALDI—TOFMS分析过程中也需留意生物安全防护；对潜在的含生物危害二类及以上的高致病病原体如布鲁菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌等的临床样本，试验室人员应请示医院感染治理部门并尽量避开培育检测，必要状况下需要在生物安全柜内承受经灭活程序灭活后再进展质谱分析。2前期的样本处理过程中将会使用一些有机溶剂如乙醇、甲酸、乙腈、三氟乙酸和基质液等，这些溶剂具有腐蚀性或可燃性，可引起人体皮肤黏膜腐蚀、呼吸及循环系统功能紊乱、多脏器损伤，因此在试验的过程中使用此类有机溶剂试剂时建议有一个良好的通风环境，同时需加强操作人员的呼吸道、皮肤黏膜尤其是眼面部的个人防护。MALD—TOFMS病原体鉴定过程的质量保证质量保证可确保MALD—TOFMS病原体鉴定结果的准确性和准时性，其内容涵盖分析前、分析中和分析后。〔一〕分析前•菌株预备：全部菌株均承受颖培育〔16 48h〕的单个菌落，推举细菌承受血琼脂平板培育，真菌承受沙保罗平板培育，冻存菌株传代两次后使用。•靶板点样：先将质控菌株/蛋白标准品点在靶板相应孔位，再点待测菌落。点样时应留意菌量适当、厚度均匀，不行带有琼脂成分。•加基质液：点样后参加基质液，应自然凉干。•特别病原体：如分枝杆菌、丝状真菌和诺卡菌等需要通过蛋白提取法进展提取前处理，包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂耗材。具体处理过程建议参考制造商供给的SOP进展操作。•样本预备留意事项：(1)靶板点样参加基质液后，需完全枯燥形成结晶方可进展检测。

(2)靶板预备完成后，如为细菌或酵母菌，需在

48h内完成检测；如为分枝杆4h内完成检测；如曲霉菌等丝状真菌，需马上完成检测。((二)分析中一般状况MALDTOFMS检测可以得到以下几种鉴定结(1)咼置信的鉴定结果；(2)多个鉴定结果，且每个结果的置信度相像；定结果。下，果：无鉴•结果推断：当MALDI—TOFMS供给了高置信的结果时，无需对图谱进展检查和复核；而当消灭多个鉴定结果或无鉴定时，可能消灭以下问题： (1)低质量的图谱导致无鉴定结果：需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及具体操作环节；(2)图谱质量较好而不符合预期的鉴定、多个鉴定结果或者无鉴定结果：应检查样本是否分纯、是否污染或数据库不包含待检菌种。•结果阈值：MALD—TOFMS的结果阈值通常分为两种：一种以置信度为阈值，置信度＞90%的单一结果为优质鉴定结果，60%-90%且具有多个鉴定结果为低区分结果(需要补充试验进展分类)，＜60%为不能鉴定；另一种则以分值为阈值，质谱评分>2分〔9.5分〕的结果可以鉴定到种，1.72.0分〔9.09.5分〕之间可以鉴定到属〔需要补充试验进展分类〕<1.7 分〔9.0分〕为不能鉴或可能鉴定到属。〔三〕分析后•结果复核：鉴定结果的复核是分析后质量治理的重要组成局部，是保证检验结果鉴定结果的复核是分析后质量治理的重要组成局部，是保证检验结果准确的一个重要环节。MALDTOFMS鉴定结果为以下病原体时，需通过相应的补充试验进展进一步鉴别。•仪器维护及保养：依据制造商要求定期进展维护及保养。•化学试剂：必需使用仪器制造商要求纯度的化学试剂。质量掌握〔一〕室内质控3需血清学试验确认的病原体：大肠埃希菌〔疑似志贺菌属和大肠埃希菌0157〕、沙门菌属等；需要其他确认试验进展鉴定的病原体：烟曲霉复合群、黄曲霉复合群、肺炎链球菌和缓症链球菌群等；需要测序鉴定或报告到群：蜡样芽抱杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌、无色杆菌属、弗劳地柠檬酸杆菌复合群和阴沟肠杆菌复合群等。试验室需依据MALDITOFMS制造商的推举及相关治理指南制定质控程序。依据制造商要求评估质量分析器、相关系统

〔软件和数据库〕、化学试剂、靶板和用户的操作〔靶板点样、有条件时萃取〕。•质控菌株：质控阳性比照菌株种类应依据试验室拟开展的鉴定病原体范围进展选择，质控菌株可承受制造商建议的标准菌株或经试验室测序等方法确认的临床菌株。全部质控阳性比照菌株进展质控操作时需承受颖培育

〔16 48h〕的单个菌落，推举细菌承受血琼脂平板培育，真菌承受沙保罗平板培育，冻存菌株传代两次后使用。•质控操作及频率：依据制造商的SOP文件要求，在靶板清洗、基质溶液及标准品溶液配制后需每次进展阴性及阳性比照的质量掌握，每次病原体鉴定时亦应如此。•仪器校准：检测前仪器需进展自身校准，校准通过前方可进展后续鉴定。•阳性比照：使用大肠埃希菌标准菌株 〔ATCC8739〕鉴定分值必需到达制造商要求；如使用标准蛋白测试品，在分子量大于12000以上的区域必需消灭校准峰，应明确检测到m/z13683和16952两个峰，确保高分子量端的准确性。•阴性比照：检测结果应为“Nopeakfound“或者“无鉴定结果“。阴性比照需使用空白试剂，用于排解可能由试剂污染或重复性靶板清洗不当造成的假阳性结果。

〔阴性比照应为任意孔位〕当质控结果失控或校准未通过时，应从各环节分析缘由并予以订正。常见缘由包括：质控菌株 /蛋白标准品污染、使用错误的质控菌株 /蛋白标准品、使用错误的试剂、操作人员的操作失误等。记录分析失控缘由并归档。假设未觉察上述明显的缘由可重复测定质控菌株 /蛋白标准品，结果在控，可直接进展后续检测；假设不能订正，应联系制造商实行相应的措施。〔二〕室间质评4其他质控困株〔标准困株或阅历证的临床困株〕，包括革兰阴性杆菌〔建议米用产气肠杆菌〕、革兰阳性球菌〔建议米用粪肠球菌〕和念珠菌〔建议承受光滑念珠菌〕。室间质评：全程参与由组织方供给的室间质评打算。当消灭室间质评不符时，准时找到失控缘由并订正。保存每次室间质评信息，包括结果反馈、订正措施等。无第三方组织的室间质评打算时，试验室应定期自行组织与其他试验室同类检测方法的室间比对。检验程序性能验证MALDI—TOFMS性能验证包括准确度和周密度。通过 MALDI—TOFMS和现用方法或参考方法〔如测序方法〕获得的病原体鉴定结果进展比较以实现准确度验证。准确度估批内、批间，操作者之间以及连续几天的重复性或再现性。在适用的状况下，还应评估病原体MALDI—TOFMSLIS或其他仪器系统之间接口的正常运行。〔一〕适用范围SFDAMALDITOFMS22MALDITOFMS时，假设对病原体种类、试剂、数据库、分析软件和硬件等进展更换或升级以及扩大检测范围谱根底上增加的病原体〕后，应进展局部验证。〔即在原有检测病原5性能验证符合要求后投入临床常规使用，在设备状态、环境、检测方法、人员等维持稳定的状况下，可承受文件和数据审核等定期评审分析系统状态，无需每年实施性能验证。〔二〕验证方案MALDI-TOFMS验证所用菌株按优先挨次依次选择标准菌株、质控菌株或经参考方法确认的临床菌株，选择的菌种应尽量掩盖 MALDI-TOFMS制造商公布的可鉴定菌谱，包括革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、厌氧困、酵母困、苛养困、分枝杆困等，同时还应掩盖验证本地区、本实验室以往检出的特别病原体种类。1.全面验证:准确度：常见病原体如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌每种类别至少验证30株，厌氧菌、苛养菌、分枝杆菌 〔如开展〕、丝状真菌状真菌〔如开展〕10株，并掩盖本地区、本试验室检出的重要病原MALDITOFMS鉴定结果与试验室现用方法或参考方法法〕之间的符合率。周密度：选择〔如测序方10株代表性菌株，每天重复检测 3次，.局部验证:1。适用范围扩大病原谱

举例补充某一种病原体

推举方案10株以上该方法〔如测序方法〕比较周密度：13次试剂种类转变设备重大修理1常见状况下验证方案

商品化试剂改为自配试剂更换离子检测器或激光源 依据上述方案进展检测性LIS数据传输验证〔三〕可承受标准严格依据制造商使用说明的要求进展结果判读果阈值〕0

〔参考环节掌握中的结1.准确度要求:验证的标准/质控菌株符合率应为100%临床菌株的符合率应在上。

90%以2•周密度要求：菌株鉴定结果符合率应为 100%。

MALDI—TOFMS不能通过验证。制造商和/或使用者须实行相应措施，修正后的检测系统应再次进展验证。以上专家共识内容仅限于 MALDI—TOFMS用于临床病原体鉴定的质量保证要求，MALDI-TOFMS作为蛋白质组学争论的支柱技术，在医学及生命科学领域有更多的应用前景和价值，其他相关领域的应用的质量保证要求不包括在本次专家共识中。编写组成