第二节蛋白质一级结构的测定方法课件

第二节蛋白质一级结构的测定方法第二节蛋白质一级结构的测定方法1一、蛋白质一级结构定义(primarystructure)

在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结构。核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包括二硫键的位置。意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功能的必要基础。一、蛋白质一级结构定义(primarystructure)2蛋白质序列测定的基本战略和步骤一蛋白质序列测序的基本战略1、直接法（测蛋白质的序列）对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。

2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（databaseordatabank）可以在AltasofProteinSequenceandStructure(.1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列信息都是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。蛋白质序列测定的基本战略和步骤一蛋白质序列测序的基本战略3

由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比较有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation（国家生物医学研究基金会）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白质信息库或ProteinIdentificationResouece蛋白质鉴定库）,美国政府支持的GeneBank[GeneSequenceDataBank（基因序列数据库）]，还有欧洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学实验室数据库）。

由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信4PDB(ProteinDataBank):蛋白质结构数据库PDB原来有由美国Brookhaven国家实验室负责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作研究协会（ResearchCollaboratoryforStructureBioinformatics,RCSB）PDB由RCSB管理。PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库第二节蛋白质一级结构的测定方法课件5二、蛋白质一级结构的测定方法研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构从氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。二、蛋白质一级结构的测定方法研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋6但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱(GCMS)等方法的相继出现。使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大减少。当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综述及专著文献较多。但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色7一般用5mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，1100C煮沸10-20小时。第二节蛋白质一级结构的测定方法N末端的氨基酸从肽段上裂解下来后，生成的颜色明显的DABITH—AA。二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)Asp–Asn、Glu-Gln然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次方向成直角。分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。单用凝胶过滤法分离肽段一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用Dowex-50等树脂。⑤2－硝基－5－硫氰苯甲酸（NTCB）和2－甲基－N－1－苯磺酰－N－4－（溴乙酰）醌二亚酰胺（也称Cyssor，专切半胱氨酸）（5）

测定多肽链的氨基酸组成。98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.在pH=6.（5）

测定多肽链的氨基酸组成。再气态条件下完成Edman降解，反应室内引入携带体polybrene与多肽片段结合，防止样品流失。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。赖氨酸氨基端参与形成的肽键。还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成－氨基醇。由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个人电脑可以方便利用。（A）烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物三测定前的准备工作测序前的准备工作：

蛋白质的纯度鉴定要求：纯度97%以上，均一。鉴定方法：

⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带，双向电泳。

⑵DNS—Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸。

(3)亲和层析(4)western印迹法等测定蛋白质的分子量估算氨基酸残基数，确定肽链数 方法：SDS，凝胶过滤法，沉降系数法一般用5mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，11008及测定的一般步骤

蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及－S－S－定位等。

及测定的一般步骤

蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽9（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)改良对角线技术可以确定二硫键的存在。Asp–Asn、Glu-Gln3特殊氨基酸的测定苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。（一）液相序列仪：自旋式反应器，使用微量样品测定大片断，不适于小肽片段。需要有氨基酸自动分析仪。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。氨基酸的分离和含量测定（二）DNS—Edman序列分析法（四）DABITC/PITC双耦联法此法样品用量少，检出灵敏，可分析超过2000肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)（四）DABITC/PITC双耦联法尿素，SDS，盐酸胍，高浓度的盐支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。蛋白质测序的一般步骤（1）

测定蛋白质分子中多肽链的数目。（2）

拆分蛋白质分子中的多肽链。（3）

断裂链内二硫键。（4）分析多肽链的N末端和C末端。（5）

测定多肽链的氨基酸组成。（6）

多肽链部分裂解成肽段。（7）

测定各个肽段的氨基酸顺序（8）

确定肽段在多肽链中的顺序。（9）

确定多肽链中二硫键的位置。（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)蛋白质测序的一般10一级结构的测定方法

1.多肽链的分离1）肽链的拆开蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链，采用的化学处理方法有：

一级结构的测定方法1.多肽链的分离11①过甲酸氧化

①过甲酸氧化12②巯基乙醇还原

②巯基乙醇还原13③Cleland‘s试剂的还原作用

③Cleland‘s试剂的还原作用14稳定SH基的方法：

（A）烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物

稳定SH基的方法：（A）烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫15稳定SH基的方法：

（B）氨乙基化

稳定SH基的方法：

（B）氨乙基化16非共价结合尿素，SDS，盐酸胍，高浓度的盐非共价结合172）末端分析

（1）N-末端测定A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)2）末端分析（1）N-末端测定18第二节蛋白质一级结构的测定方法课件19（1）N-末端测定

B.氰酸盐法

异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的α－氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱酸中自发环化转变成PTH－衍生物。该试剂称为Edman试剂。

由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋白质的一级结构。

（1）N-末端测定

B.氰酸盐法

异硫氰酸苯酯（PTC20第二节蛋白质一级结构的测定方法课件21当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。至今已完成近千种蛋白质的一级结构分析。然后与PITC试剂反应。这些数据库中比较有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation（国家生物医学研究基金会）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白质信息库或ProteinIdentificationResouece蛋白质鉴定库）,美国政府支持的GeneBank[GeneSequenceDataBank（基因序列数据库）]，还有欧洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学实验室数据库）。（9）

确定多肽链中二硫键的位置。2）酶解法

（1）赖氨酸的修饰

蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解98）洗脱的顺序又如何呢?苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减弱了树脂对氨基酸的吸引力。在生物化学和分子生物学领域此法常用于分离蛋白质、核酸等生物大分子。Asp–Asn、Glu-Gln肽的顺序分析

2）酶解法肽谱重迭法由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的含二硫键肽的检出方法98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。（一）液相序列仪：自旋式反应器，使用微量样品测定大片断，不适于小肽片段。Edman化学降解的图示近年来用4mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应用。（1）N-末端测定

C.需要有氨基酸自动分析仪。2测定每个肽段的氨基酸顺序。目前倾向于采用这种裂解方式。（1）N-末端测定

C.二甲基氨基萘磺酰氯法

在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-肽。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持22第二节蛋白质一级结构的测定方法课件23氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向242）末端分析

（2）C-末端分析A.肼解法

无水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、Cys（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产生游离的羧基末端aa。2）末端分析

（2）C-末端分析A.肼解法无水肼NH2NH25第二节蛋白质一级结构的测定方法课件26（2）C-末端分析

B.羧肽酶水解法

羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

（2）C-末端分析

B.羧肽酶水解法27羧肽酶法测C末端羧肽酶法羧肽酶A：除Pro、Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）外的所有C端氨基酸羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶法测羧肽酶法羧肽酶A：28胰蛋白酶Polybrene：Abbott公司商标洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包括二硫键的位置。PDB(ProteinDataBank):蛋白质结构数据库原理如（p109）所示。第三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。（酪氨酸）Tyr——X，（色氨酸）Trp——X由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世，储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个人电脑可以方便利用。2）酶解法

（3）半胱氨酸的修饰带阳离子基团的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。74）最后下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.二甲基氨基萘磺酰氯法咪唑基：His（组氨酸）,（2）

拆分蛋白质分子中的多肽链。一蛋白质序列测序的基本战略最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。蛋白质序列仪1、直接法（测蛋白质的序列）C-末端分析

C.C-端氨基酸选择性氚标记法：

使用氚标记是测定C-端氨基酸最好的办法，专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C-端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成－氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定－氨基醇的类别。胰蛋白酶C-末端分析

C.C-端氨基酸选择性氚标记法：还原29四由已知序列肽段建立蛋白质一级结构③与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白质失活。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的缺点是色氨酸被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；需要有氨基酸自动分析仪。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。DNS－AA带有荧光，鉴定氨基酸的灵敏度远远高于PTH－AA，Edman试剂可以连续降解，而不破坏肽段。俗名：hexadimethrinebromide。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。缺点是高温，酸性条件下降解，色氨酸被破坏，谷酰胺和天冬酰胺转变成谷氨酸和天冬氨酸Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val羧肽酶B：只水解Arg、Lysthermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,甲硫氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次方向成直角。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。DABITC（4－N，N－二甲氨基偶氮苯－4‘－异硫氰酸苯酯）是改进的Edman试剂。原理如（p109）所示。酸水解常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸（磺酸）在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来用4mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应用。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。-COO+3）氨基酸组成分析四由已知序列肽段建立蛋白质一级结构酸水解常用630碱水解一般用5mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件下进行，1100C煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。碱水解一般用5mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件下31

酶法裂解胰蛋白酶

（赖氨酸）Lys——X（精氨酸）Arg——X(X≠Pro)胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）

（酪氨酸）Tyr——X（色氨酸）Trp——X（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)嗜热菌蛋白酶

X--Leu（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），Val（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）Tyr（酪氨酸），Leu（亮氨酸）——X不能水解Pro羧基参与形成的肽键。Glu蛋白酶

Glu（谷氨酸）——XArg蛋白酶Arg（精氨酸）——XLys蛋白酶X——Lys（赖氨酸）Pro蛋白酶Pro——X

酶法裂解胰蛋白酶32

氨基酸的分离和含量测定氨基酸的颜色反应：紫色在570nm比色茚三酮与Pro生成黄色产物，在440nm比色氨基酸的分离和含量测定氨基酸的颜色反应：紫色在570nm33层析基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。层析基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组341多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库高效液相色谱：目前已经成为纯化蛋白质和多肽的有力工具。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。需要有氨基酸自动分析仪。1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。含二硫键肽的检出方法化学名：1，5－dimethyl－1，5－diazaundecamethylene及测定的一般步骤

蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及－S－S－定位等。（2）断裂反应：在强酸作用下，离PTC－肽最近的氨肽键断裂，形成2－苯胺－5噻唑啉酮衍生物（PTZ）,原来的肽段少一个氨基酸残基。第三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。⑥分离出含二硫键的两条短肽，测序（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)巯基：—SH,Cys（半胱氨酸）由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的第二节蛋白质一级结构的测定方法苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。③N-溴代琥珀酰亚胺法氨基酸的分离

色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。

1多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断氨基酸的分离35①薄膜层析

将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的分析术，但此方法用于定量分析尚不够准确。

①薄膜层析36②氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。②氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法离子交换色谱法：利用37氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法

若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调节水解液的pH为3，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大，pH3时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但由于谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸的β-羧基，都有不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此时，它所带的正点荷强度就更大。酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，在洗脱过程中，使用不同pH和离子强度的洗脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸，按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基酸的光吸收图谱。氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法383）氨基酸组成分析②离子交换层析法

3）氨基酸组成分析②离子交换层析法39离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异40第二节蛋白质一级结构的测定方法课件41各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸（pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如何呢?苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因素：（1）氨基酸分子所带的电荷；（2）氨基酸分子的极性；（3）氨基酸分子的形状和大小。各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交换树脂，423特殊氨基酸的测定

巯基：—SH,Cys（半胱氨酸）特性：弱酸性pKa’=10.28；具有极强的还原性，两个半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。pKa(电离程度)反应：①与卤代烃，如：苄氧、碘乙酰胺，反应生成稳定的烃基衍生物。该反应常用于对巯基的保护。②与各种金属形成稳定性不同的络合物，该反应在研究蛋白质结构，制备蛋白质晶体过程中具有重要作用。③与某些重金属生成不溶性的硫酸盐，导致蛋白质失活。④与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应，生成的产物在412nm处有强烈的光吸收，应用该反应可以用比色法测定半胱氨酸的含量。⑤在强氧化剂，如过氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巯基和胱氨酸的二硫键都可被氧化生成磺基丙氨酸。3特殊氨基酸的测定巯基：—SH,C43羟基：Ser（丝氨酸），Thr（苏氨酸），—OH特性：在一般条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中的羟基都不解离。反应：①与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质的磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。②许多种酰化剂能够与酶活性中心的丝氨酸羟基作用，导致酶失活。

③酪氨酸的酚基可与Folin反应的基础，可作为蛋白质定量。为Millon反应的基础。第二节蛋白质一级结构的测定方法课件44具有极强的还原性，两个半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成－氨基醇。2）氨基酸的修饰与保护

（2）精氨酸的修饰胰蛋白酶X衍射法测定一级结构；分析用Edman试剂降解后肽段的氨基酸组成，每一次丢失的氨基酸就是N末端的氨基酸。要求：纯度97%以上，均一。分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。X衍射法测定一级结构；3利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调节水解液的pH为3，使所有的氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大，pH3时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但由于谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸的β-羧基，都有不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此时，它所带的正点荷强度就更大。咪唑基：His（组氨酸）,裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将缺点是色氨酸被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；然后与PITC试剂反应。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽1）凝胶过滤或离子交换层析：用以分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽。各种氨肽酶的专一性+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·ValPro蛋白酶Pro——X咪唑基：His（组氨酸）,特性：在生理条件（pH7）下，组氨酸的咪唑基具有缓冲作用。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子化作用同步进行。pH6时，50％质子化，pH7时，90％去质子化。也就是说，在生理条件（pH7）下，组氨酸的咪唑基既可以作为质子的受体，也可以作为质子的供体。因此组氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。反应：Pauly反应（对氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）胍基：Arg（精氨酸）特性:具有很强的碱性。反应：与板口试剂（萘酚、次溴酸盐）反应生成红色，该反应是鉴定精氨酸存在的定性反应。也可用于定量测定具有极强的还原性，两个半胱氨酸的巯基靠近脱氢形成二硫键。45甲硫基：Met（甲硫氨酸）,－S－CH3特性：甲硫氨基酸侧链上的甲硫基是一个强的亲核中心，容易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有14C标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同位素14C标记的甲硫氨酸。甲硫基：Met（甲硫氨酸）,－S－CH3462.多肽链的降解1）化学法①溴化氢法溴化氰

Met（甲硫氨酸）——X

2.多肽链的降解1）化学法47溴化氢化学降解法其优点：①一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段②专一性强③产率高达80%以上④作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可溴化氢化学降解法其优点：①一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获481）化学法

②羟胺法

这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解Asn（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽键，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白质的分析。Asn（天冬酰胺）——Leu（亮氨酸）Asn（天冬酰胺）——Ala（丙氨酸）③N-溴代琥珀酰亚胺法主要裂解Tyr（酪氨酸）处的肽键，五十年代研究较多。但由于它也能断裂Tyr（酪氨酸）——His(组氨酸)肽键，因此应用不广。1）化学法

②羟胺法这种方法近十年来开始49④NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys（半胱氨酸）—X－Cys（半胱氨酸）键的裂解：⑤2－硝基－5－硫氰苯甲酸（NTCB）和2－甲基－N－1－苯磺酰－N－4－（溴乙酰）醌二亚酰胺（也称Cyssor，专切半胱氨酸）⑥亚碘酰基苯甲酸—Trp（色氨酸）—X—产率70-100%④NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）501）化学法

（2）部分酸水解法Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此法，即用0.1N盐酸在110℃或用6N盐酸在37℃水解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。1）化学法

（2）部分酸水解法Sange51优点：专一性高，降解后的多肽容易纯化，产率高，副作用小。注意事项：适合酶作用的温度和酸碱度（pH），反应时间。酶的用量，待裂解蛋白质的物理状态。缓冲溶液的离子强度等酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。2.多肽链的降解

2）酶解法优点：注意事项：酶裂解前需要作预备实验，掌握好各种条件。2.52胰蛋白酶Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。胰蛋白酶Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧53糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：（α糜蛋白酶）对疏水性氨基酸水解速度比较快。R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：（α糜蛋白酶54胃蛋白酶

水解专一性比较广。Pepsin：R1和/或R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快胃蛋白酶水解专一性比较广。55目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。Leu-Glx-Pro-Val肽这些数据库中比较有名的就是美国NationalBiomedicalResearshFoundation（国家生物医学研究基金会）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白质信息库或ProteinIdentificationResouece蛋白质鉴定库）,美国政府支持的GeneBank[GeneSequenceDataBank（基因序列数据库）]，还有欧洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,欧洲分子生物学实验室数据库）。方法：SDS，凝胶过滤法，沉降系数法Asp–Asn、Glu-Gln分析用Edman试剂降解后肽段的氨基酸组成，每一次丢失的氨基酸就是N末端的氨基酸。PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此法，即用0.Lys蛋白酶X——Lys（赖氨酸）这也是Edman降解的改良技术。酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。这是因为咪唑基一侧的去质子化和另一侧的质子化作用同步进行。凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。除Pro、Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）外的所有C端氨基酸在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-肽。嗜热菌蛋白酶中性金属酶它的专一性取决于氨基参与形成的肽键。thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,甲硫氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，56金黄色葡萄球菌Glu蛋白酶——Glu——X——谷氨酸羧基端参与形成的肽键。梭菌Arg蛋白酶(clostripain)——Arg——X——精氨酸羧基端参与形成的肽键。Lys蛋白酶——X——Lys——赖氨酸氨基端参与形成的肽键。小羊肾Pro蛋白酶——Pro——X——第二节蛋白质一级结构的测定方法课件57胰蛋白酶

（赖氨酸）Lys——X，（精氨酸）Arg——X(X≠Pro)胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）

（酪氨酸）Tyr——X，（色氨酸）Trp——X（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)嗜热菌蛋白酶

X--Leu（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），Val（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）2）酶解法胰蛋白酶2）酶解法58

酶法裂解胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）Tyr（酪氨酸），Leu（亮氨酸）——X不能水解Pro羧基参与形成的肽键。Glu蛋白酶

Glu（谷氨酸）——XArg蛋白酶Arg（精氨酸）——XLys蛋白酶X——Lys（赖氨酸）Pro蛋白酶Pro——X

酶法裂解胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸），Trp（色59氨基酸的修饰与保护

（1）赖氨酸的修饰——胰蛋白酶氨基酸的修饰与保护

（1）赖氨酸的修饰——胰蛋白酶602）酶解法

（1）赖氨酸的修饰

蛋白质中的赖氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解

2）酶解法

（1）赖氨酸的修饰

蛋白质中的赖612）氨基酸的修饰与保护

（2）精氨酸的修饰胰蛋白酶2）氨基酸的修饰与保护

（2）精氨酸的修饰胰蛋白酶62这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解Asn（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽键，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。带阴离子基团的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。适合酶作用的温度和酸碱度（pH），反应时间。④作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。（酪氨酸）Tyr——X（色氨酸）Trp——XChymotrypsin：（α糜蛋白酶）74）最后下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.咪唑基：His（组氨酸）,（2）氨基酸分子的极性；反应：Pauly反应（对氨基苯磺酸的重氮盐，红色产物）PTH－氨基酸的鉴定改进再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。3利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。该种产物用巯基试剂处理可以除去烷基和原有的甲基，因此与带有14C标记的碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同位素14C标记的甲硫氨酸。⑥分离出含二硫键的两条短肽，测序1）化学法

（2）部分酸水解法此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。①一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段2）酶解法

（3）半胱氨酸的修饰

这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解Asn（天冬63肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较小，造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解，采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方法一般也适用于分子量小于5万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解64

大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离肽段一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法，大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用Dowex-50等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽

3肽段的分离和纯度鉴定大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于65凝胶过滤法凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱凝胶过滤法凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离纯化蛋66离子交换层析固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱。在生物化学和分子生物学领域此法常用于分离蛋白质、核酸等生物大分子。离子交换层析固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的67支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂68蛋白质分离纯化（细分级）的方法都可以用。对角线法：双向电泳和双向层析，第一相电泳后不作任何处理进行第二相电泳，得到对角线图谱说明肽段纯度高。改良对角线技术可以确定二硫键的存在。高效液相色谱：目前已经成为纯化蛋白质和多肽的有力工具。层析和电泳游离末端鉴定纯度鉴定：蛋白质分离纯化（细分级）的方法都可以用。对角线法：双向电泳和694.肽的顺序分析

1）化学法Edman降解法

（一）Edman化学降解法：分析短肽最基本、最有效的方法Edman试剂：异硫氰酸苯酯（PITC或PTC）降解过程：（1）耦联反应：PITC与肽段N末端氨基酸的α－氨基（游离）在碱性条件下发生耦联反应，生成PTC－肽。（2）断裂反应：在强酸作用下，离PTC－肽最近的氨肽键断裂，形成2－苯胺－5噻唑啉酮衍生物（PTZ）,原来的肽段少一个氨基酸残基。（3）转化（环化）：PTZ不稳定，在酸性条件下，自发环化转变成3－苯基－2－乙内酰脲（PTH－AA）。4.肽的顺序分析1）化学法Edman降解法（一）Ed70利用Edman试剂降解一次最多可以测出多少残基，关键在于，肽片段转变为PTC－肽及随后的Edman降解反应的产率。一般来说，反应产率逐渐降低。利用Edman试剂降解一次最多可以测出多少71Edman化学降解的图示耦联断裂转化Edman化学降解的图示耦联断裂转化721）化学法Edman降解法PTH－氨基酸的鉴定改进A.1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。1）化学法Edman降解法PTH－氨基酸的鉴定改进731）化学法Edman降解法PTH－氨基酸的鉴定改进B.1970年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析超过2000肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。1）化学法Edman降解法PTH－氨基酸的鉴定改进74（二）DNS—Edman序列分析法

这是Edman降解的改良技术，此项技术将灵敏度高的DNS分析法和能够连续降解的Edman降解法结合起来。原理如（p109）所示。用DNS－Cl（丹磺酰氯）分析鉴定氨基酸的种类，用Edman试剂降解肽段。DNS－AA带有荧光，鉴定氨基酸的灵敏度远远高于PTH－AA，Edman试剂可以连续降解，而不破坏肽段。缺点是高温，酸性条件下降解，色氨酸被破坏，谷酰胺和天冬酰胺转变成谷氨酸和天冬氨酸（二）DNS—Edman序列分析法75（三）减数Edman序列分析法这也是Edman降解的改良技术。分析用Edman试剂降解后肽段的氨基酸组成，每一次丢失的氨基酸就是N末端的氨基酸。优点：快速、准确、样品需要量少。需要有氨基酸自动分析仪。（四）DABITC/PITC双耦联法DABITC（4－N，N－二甲氨基偶氮苯－4‘－异硫氰酸苯酯）是改进的Edman试剂。N末端的氨基酸从肽段上裂解下来后，生成的颜色明显的DABITH—AA。在聚酰胺薄膜上层析分离，盐酸蒸汽熏，显示红色斑点，杂质显蓝紫色。其原理与Edman降解法相同。（三）减数Edman序列分析法76（五）酶降解法进行肽段序列分析1氨肽酶法：各种氨肽酶的专一性2羧肽酶法：

3二肽酶法：每次切下两个氨基酸残基，进行分析测定。（五）酶降解法进行肽段序列分析1氨肽酶法：2羧肽酶法：77自动序列分析蛋白质序列仪（一）液相序列仪：自旋式反应器，使用微量样品测定大片断，不适于小肽片段。（二）固相序列仪：用聚苯乙烯作固相载体，近年来用微孔玻璃球，球表面连接丙氨基侧链，在丙氨基侧链后面再连接反应基团与肽片段结合，肽片段的类型（羧基端不同）不同与其连接的反应基团不同。（三）气相序列仪：也称气相－固相序列仪。再气