固相微萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的糖皮质激素

固相微萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的糖皮质激素

糖皮质激素是肾上腺分泌的一种类固醇激素。它具有抗炎、抗过敏、抗休克和抗抗菌抗抑制等作用。它也可以用作动物生长促进剂，加速动物生长，并广泛应用于动物和牲畜的生产中。糖皮质激素的检测方法主要包括气相色谱-质谱法（GC)中空纤维微萃取（HF-SPME）是一种利用中空纤维的微孔孔径较小限制样品溶液中的大分子物质进入萃取相，集萃取和净化一步完成的样品预处理技术。在环境、生物样品痕量分析中有良好使用氧化石墨烯是近年来兴起的一种新型纳米材料，具有超大的比表面积及丰富的含氧官能团，可与有机化合物形成π-π相互作用，被广泛应用于样品的前处理研究该方法采用中空纤维/氧化石墨烯用于样品前处理，并与高效液相色谱-串联质谱法相结合建立同时测定牛奶中7种糖皮质激素的分析方法。该方法简单高效，同时灵敏度也能满足日常检测需求，适合于实验室大批量检测。1材料和方法1.1可的松、加氢的松糖皮质激素标准品：倍氯米松、地塞米松、甲基泼尼松龙、氟氢可的松、氢化可的松、可的松、泼尼松龙（德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95%）；氘代氢化可的松内标物（加拿大CDN公司，纯度≥99%）。氧化石墨烯（实验室自制1.2仪器、仪器和仪器三重四级杆液相色谱/串联质谱仪（LC-MS8050，日本Shimadzu公司）；多管涡旋混合仪（DMT-2500，杭州米欧仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；超纯水机（美国Millipore公司）。1.3方法1.3.1氧化石墨烯溶液的制备将中空纤维膜剪成长度约2cm小段，用丙酮超声清洗10min，取出晾干。取50mg氧化石墨烯分散于100mLN,N-二甲基甲酰胺中，超声分散2h，制备成500mg/L氧化石墨烯溶液。将晾干的中空纤维浸入500mg/L氧化石墨烯溶液中超声2h，使氧化石墨烯完全固定在中空纤维膜的微孔中，取出用去离子水洗涤数次，除去中空纤维表面及内部多余的氧化石墨烯，晾干备用。1.3.2标准贮备液准确称取适量的标准品，用甲醇分别配制成100mg/L的标准贮备液，置于-18℃冰箱保存。使用时，用甲醇稀释成各种浓度的混合标准工作液和内标工作液，备用。1.3.3氧化石墨烯/中空纤维的制备称取5g样品于10mL离心管中，加入50μL500μg/L氘代氢化可的松同位素工作液，用0.1mol/L的NaOH溶液调至pH10，将处理好的氧化石墨烯/中空纤维放入离心管中，超声萃取10min。取出氧化石墨烯/中空纤维，滤纸擦干后放入装有1mL甲醇的小瓶中，超声解析3min，经0.22μm滤膜过滤后待测。1.3.4仪器条件1.3.4.流动相a/b分离ACQUITYUPLCHSST3色谱柱（2.1mm×100mm,1.8μm）；进样量3μL；柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸-2mmol/L水溶液，B为乙腈溶液；流速0.15mL/min；采用梯度洗脱的分离程序，洗脱程序：0～0.5min,10%B;0.5～1.5min,10%～40%B;1.5～2.5min,40%～90%B;2.5～5min,90%B;4～5min,65%～90%B;5～6min,90%～10%B。1.3.4.运行电压电喷雾离子源（ESI）：负离子模式；加热块温度400℃，毛细管电压4000V；雾化气流量3.0L/min；加热气流量10.0L/min；定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表1。2结果与分析2.1萃取条件优化2.1.1萃取效率的影响由于糖皮质激素类药物在牛奶中以痕量存在，加大样品的称样量，增加富集倍数，是提高实际检测浓度的有效手段之一。考察样品1～10g时对萃取效率的影响。结果表明（见图1），样品量增加到5g时，萃取效率没有明显变化，继续增加样品量，萃取效率逐渐减少。这可能是样品量5g时刚好达到吸附平衡，样品量继续增大，仅用2cm的氧化石墨烯/中空纤维和10min的萃取时间无法充分吸附目标化合物，致使萃取效率降低。因此，选择样品量为5g。2.1.2萃取效率的测定样品溶液pH不仅能改变目标化合物的存在形态，也会改变吸附材料表面电荷和密度，是影响萃取效率的重要因素。考察pH4～14的萃取效率。结果表明（见图2),pH4～10时，随着pH增加，萃取效率明显增大。这是由于目标化合物为碱性化合物，在碱性环境中呈分子状态，随着pH增大，与氧化石墨烯之间的疏水作用力增强，萃取效率增大；之后随着pH增大，萃取效率略有下降，这可能是氧化石墨烯絮凝沉淀的关系。因此，试验选择最佳pH10。2.1.3萃取时间的影响试验比较超声萃取和振荡萃取2种萃取方式对7种糖皮质激素类萃取效率的影响。结果表明（见图3），在相同时间下，超声萃取的萃取效率明显好于涡旋萃取。这是因为涡旋萃取时容易产生气泡附在中空纤维膜的外壁，影响目标化合物的萃取，而超声萃取时超声波辐射产生的强烈空化效应、机械效应和热效应可以加强传质过程，从而提高萃取效率。进一步考察萃取时间（4～14min）对萃取效率的影响。结果表明（见图4），萃取时间10min时萃取效率最好，萃取时间继续增加，解析效率略有下降，可能是过长的超声时间使氧化石墨烯从中空纤维壁上脱落。因此，试验选择萃取方式为超声萃取10min。2.1.4提高萃取效率在水溶液中加入适量的盐可以增加离子强度，减少目标化合物在样品中的溶解度，有助于提高萃取效率。通过在样品溶液中加入不同浓度NaCl(0～20%），考察离子强度对目标化合物萃取效率的影响。结果显示，在其他条件不变时，额外添加NaCl对目标化合物的萃取效率无显著影响。因此，试验选择不加NaCl。2.1.5解析溶剂用量及解析时间的确定萃取完成后，为了将目标化合物从氧化石墨烯/中空纤维上尽可能完全地解析，试验考察甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇4种解析溶剂的解析效率。结果表明（见图5），甲醇的解析效率最好。进一步考察解析溶剂用量为0.5～3mL时对于解析效率的影响。结果表明，随解析溶剂用量增加，解析效率逐渐变大，解析溶剂用量1mL时，解析效率达到最大；继续增加解析溶剂用量，解析效率基本不变。考察解析时间在1～5min范围内对萃取效果的影响。结果表明，解析时间在1～3min时，随着时间增加，解析效率逐渐提高；超过3min后解析效率趋于平稳，说明3min时基本能达到解析完全。因此，试验采用1mL甲醇作为解析溶剂，解析时间3min作为最佳解析条件。2.2质谱条件的评价基质效应在质谱分析中普遍存在，共流出干扰物对目标物离子造成的离子抑制或增强效应，可能严重影响定量的准确性。试验采用提取后添加法，测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度目标化合物的离子响应强度，通过二者比值来评价基质效应（ME）。如式（1）所示。结果表明（见表2），除氟氢可的松外，其余6种目标化合物基质效应影响不大，说明中空纤维的微孔结构有效限制牛奶中的蛋白质、脂肪等大分子物质进入，具有减弱基质干扰的能力。试验参照GB/T21981—2008式中：A和B分别为纯溶剂与基质溶液中目标化合物的峰面积。若ME<0.8，说明基质对目标化合物产生较强的抑制作用；ME>1.2，则说明基质增强效应；0.8<ME<1.2表明基质效应可以忽略。2.3方法学的检验2.3.1目标化合物的线性配制6点不同质量浓度的混合标准溶液，溶液中7种糖皮质激素质量浓度分别为1,5,10,25,50和100μg/L，氢化可的松同位素的质量浓度均为25μgL，以浓度（X，μg/L）为横坐标，目标化合物峰面积与内标物峰面积的比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线。从表2可以看出，7种目标化合物线性相关性良好，相关系数不低于0.99。根据检出限大于等于3倍信噪比，定量限大于等于10倍信噪比的计算方法，得出7种糖皮质激素的方法检出限为0.04～0.09μg/kg，定量限为0.12～0.30μg/kg。2.3.2计算回收率测试在空白牛奶样品中分别添加3个水平的混合标准溶液，每个水平平行测试6次，计算其平均回收率。结果表明，7种糖皮质激素的平均加标回收率范围为72.9%～89.0%，相对标准偏差（RSD）为1.1%～9.5%，符合兽药残留测定的要求。2.4实际样品测试采用该方法对市售的10种不同品牌的牛