氨化培养基的方法步骤

一、 培养基富集培养基：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.4-7.6筛选培养基:蛋白豚:5g,NaCl:0.25g,KC1:0.3g,MgS04-7H20:0.5g,FeS04*H20:O.lg,蒸憾水:1000ml,pH=7.2。奈氏试剂的配制：将10g碘化汞和7g碘化钾溶于10ml水中，另将24.4g氢氧化钾溶于内有70ml水的100ml容量瓶中，并冷却全室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液慢慢注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。试剂应保存在棕色玻璃瓶中，置暗处。二、 方法：氨化细菌检测：将待测菌接种于培养基中，28〜30°C恒温培养2d。取少量培养液，加1~2滴萘氏试剂检验培养液中NH-N4+的产生情况，如呈现黄色沉淀，表示有氨存在，可初步判定为氨化细菌。本实验筛选的9株菌株产生了黄色沉淀，因此可初步判断为氨化细菌。氨氮降解能力菌株最大吸收波长的测定将分离到的菌株转接到牛肉膏蛋白胨培养液中培养18-24h,在320-660nm的波长下测定其OD值，以未接种的培养基为空白对照，以波长为横坐标，以OD值为纵坐标作图，找出此菌株的最大吸收波长。菌株生长量及氨氮浓度随时间的变化有机氮在氨化细菌的作用下生成NH4+-N,所以有机氮的去除是用氨化细菌培养液中nh4+-n的含量来表示。用接种环挑取斜面菌种接种到活化培养基中，摇床培养18-20h后，用0.85%无菌生理盐水离心洗涤3次，最后用生理盐水制成菌液。按10%的接种量，将活化后并经过洗涤处理的菌液接入筛选培养基中作为氨氮模拟废水,30C摇床培养24h。接种后每隔2h取样1次，每次10mL，先在其最大吸收波长下测定培养液的OD值，然后离心取上清液，用纳氏试剂分光光度法测定上清液中氨氮含量，以时间为横坐标，培养液的浊度（即OD值）和氨氮含量为纵坐标作图,计算氨氮降解效率。纳氏试剂分光光度法一、 原理碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反映生成淡红棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比,通常可在波长410〜425nm范围内测其吸光度,计算其含量.本法最低检出浓度为0.025mg/L(光度法)，测定上限为2mg/L.采用目视比色法，最低检出浓度为0.02mg/L.水样做适当的预处理后,本法可用于地面水,地下水，工业废水和生活污水中氨氮的测定.二、 仪器1带氮球的定氮蒸馏装置:500mL凯氏烧瓶，氮球，直形冷凝管和导管.2分光光度计3pH计四、试剂配制试剂用水均应为无氨水1无氨水可选用下列方法之一进行制备：1.1蒸馏法:每升蒸馏水中加0.1mL硫酸，在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去50mL初馏液，按取其余馏出液于具塞磨口的玻璃瓶中，密塞保存.1.2离子交换法:使蒸馏水通过强酸型阳离子交换树脂柱.1mol/L盐酸溶液.1mol/L氢氧化纳溶液.4轻质氧化镁(MgO):将氧化镁在500°C下加热，以出去碳酸盐.50.05%漠百里酚蓝指示液:pH60.〜7.6.6防沫剂，如石蜡碎片.7吸收液：7.1硼酸溶液:称取20g硼酸溶于水,稀释至1L.7.20.01mol/L硫酸溶液.8纳氏试剂:可选择下列方法之一制备：8.1称取20g碘化钾溶于约100mL水中，边搅拌边分次少量加入二氯化汞(HgC12)结品粉末(约10g),全出现朱红色沉淀不易溶解时，改写滴加饱和二氯化汞溶液，并充分搅拌，当出现微量朱红色沉淀不再溶解时，停止滴加二氯化汞溶液.另称取60g氢氧化钾溶于水，并稀释至250mL，冷却全室温后，将上述溶液徐徐注入氢氧化钾溶液中，用水稀释至400mL，混匀.静置过夜将上清液移入聚乙烯瓶中，密塞保存.8.2称取16g氢氧化纳，溶于50mL水中，充分冷却全室温.另称取7g碘化钾和碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100mL，贮于聚乙烯瓶中，密塞保存.9酒石酸钾纳溶液:称取50g酒石酸钾纳KNaC4H4O6・4H2O)溶于100mL水中，加热煮沸以除去氨,放冷,定容至100M1.10铵标准贮备溶液:称取3.819g经100°C干燥过的优级纯氯化铵(NH4C1)溶于水中,移入1000mL容量瓶中，稀释至标线.此溶液每毫升含1.00mg氨氮.11铵标准使用溶液:移取5.00mL铵标准贮备液于500mL容量瓶中,用水稀释至标线.此溶液每毫升含0.010mg氨氮.五、测定步骤1水样预处理:取250mL水样(如氨氮含量较高，可取适量并加水至250mL，使氨氮含量不超过2.5mg)，移入凯氏烧瓶中，家数滴漠百里酚蓝指示液，用氢氧化纳溶液或演算溶液调节至pH7左右.加入0.25g轻质氧化镁和数粒玻璃珠,立即连接氮球和冷凝管，导管下端插入吸收液液面下.加热蒸馏，全馏出液达200mL时，停止蒸馏,定容至250mL.采用酸滴定法或纳氏比色法时，以50mL硼酸溶液为吸收液;采用水杨酸-次氯酸盐比色法时，改用50mL0.01mo1/L硫酸溶液为吸收液.2标准曲线的绘制:吸取0,0.50,1.00,3.00,7.00和10.0mL铵标准使用液分别于50mL比色管中，加水全标线，加1.0mL酒石酸钾溶液，混匀.加1.5mL纳氏试剂，混匀.放置10min后,在波长420nm处,用光程20mm比色皿，以水为参比，测定吸光度.由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校正吸光度,绘制以氨氮含量(mg)对校正吸光度的标准曲线.3水样的测定：3.1分取适量经絮凝沉淀预处理后的水样（使氨氮含量不超过0.1mg）,加入50mL比色管中，稀释至标线，家0.1mL酒石酸钾纳溶液.以下同标准曲线的绘制.3.2分取适量经蒸馏预处理后的馏出液，加入50mL比色管中，加一定量1mol/L氢氧化纳溶液，以中和硼酸，稀释至标线.加1.5mL纳氏试剂，混匀.放置10min后，同标准曲线步骤测量吸光度.4空白实验:以无氨水代替水样,做全程序空白测定.六、 计算由水样测得的吸光度减去空白实验的吸光度后，从标准曲线上查得氨氮量（mg）后,按下式计算：氨氮（N，mg/L）=m/Vx1