土壤微生物医学知识专家讲座

第一节、土壤是微生物大本营土壤圈是地球系统组成部分，它处于大气圈、岩石圈、水圈和生物圈界面，同其它生物圈交互作用，是含有生命活动体系和微生物生活良好环境。微生物既是土壤形成过程作用者，又是土壤主要组成部分。土壤中微生物种类繁多、数量巨大，这是其它它任何生态系统不可相比。

土壤微生物医学知识专家讲座第1页为何土壤中存在如此众多微生物？1、土壤为微生物提供了良好C,N营养。微生物生长需要最多就是C，其次是N植物根系分泌物

30-40%光合产物以分泌物形式释放到土壤脱落根毛、表皮组织植物枯枝落叶植物死亡后残体农业生产中——施肥土壤微生物医学知识专家讲座第2页2、土壤为微生物提供无机盐、微量元素土壤本身含有各种无机盐，微量元素农业生产中施肥，P,K肥等，微肥等土壤微生物医学知识专家讲座第3页土壤含有保水性，而且微生物比植物对水分要求低，植物能生长土壤，其水分必定能满足微生物要求3、土壤满足了微生物对水分要求土壤微生物医学知识专家讲座第4页4、土壤pＨ值范围5.5－8.5之间，能满足大多数微生物要求。而且微生物适应性广5、土壤中温度改变小——昼夜，季节性改变小（相对于大气、水体而言）6、土壤是不均匀介质，土壤颗粒空隙间充满着空气-好气微生物；颗粒内部厌氧-厌氧微生物土壤微生物医学知识专家讲座第5页8、土壤能保护微生物不受烈日曝晒，从而可使微生物免受各种射线伤害

7、适宜渗透压。土壤微生物医学知识专家讲座第6页第二节土壤中微生物分布一、微生物分布1、土壤剖面结构与微生物垂直分布土壤剖面能够划分为O层、A层、B层和C层。O层为有机质层，耕作土壤没有显著O层，除非在秸秆盖田情况下；许多森林土壤中O层即为枯枝落叶层。A层为淋溶层，它是土表以矿物质为主一个层次，降水和浇灌造成强烈淋溶作用。B层为淀积层，由上面层次淋洗下来物质在此大量沉积。A层和B层加在一起称为土体层C层可能有钙、镁碳酸盐累积。最下面为R层，即疏松母质层或基岩，因土壤类型不一样，层次结构及各层厚度能够有很大差异土壤微生物医学知识专家讲座第7页表层土中（20~30cm）含量最高，越往下，总微生物数量越少，但厌氧微生物数量下层土壤中多地表土受阳光直接照射，其中微生物含量较低。但藻类在表层。

采取土样时普通要刮开表土2~3cm后采样。土壤微生物医学知识专家讲座第8页2、植物根际土壤与微生物分布植物根际土壤微生物数量高于根外土壤根际土壤——离根5mm以内土壤rhizospheresoil根际微生物——rhizobacteria根/土比（R/S)：根际微生物数量和根外微生物数量之比通常为几到几十为何？土壤微生物医学知识专家讲座第9页土壤微生物医学知识专家讲座第10页土壤微生物医学知识专家讲座第11页根际微生物：

从根冠到成熟区根际微生物数量快速增加；

需要碳水化合物——有机酸和糖类较多微生物大多繁殖于禾本科植物根区，而要求氨基酸较多微生物则繁殖于豆科植物根区根际微生物特点：数量多于根外土壤，但多样性小于根外土壤土壤微生物医学知识专家讲座第12页根表微生物分布是不均匀，微菌落形式存在，根尖数量少，很多存在于根裂隙中3、根表微生物分布土壤微生物医学知识专家讲座第13页ScanningelectronmicrographofamicrocolonyofPseudomonasfluorescensstrainWCS365ontomatoroot土壤微生物医学知识专家讲座第14页ConfocalscanningmicroscopyanalysisoftomatorootcolonizationbyP.fluorescensWCS365expressingautofluorescentproteins.AmixtureoftwoWCS365derivativesexpressingeithercyanfluorescentprotein(redcells)oryellowfluorescentprotein(greencells)isshown;theoverlapoftheredandgreencoloursresultsinyellow.土壤微生物医学知识专家讲座第15页AmixtureofthreeWCS365derivatives土壤微生物医学知识专家讲座第16页主要存在于裂隙土壤微生物医学知识专家讲座第17页3、土壤团聚体与微生物分布土壤包含矿物质、有机质和各种生物，它们相互结合和作用使土壤含有结构性，尤其是土壤团聚体(团粒)，它是土壤肥沃主要原因土壤矿物质颗粒按大小分为砂粒、粉粒和粘粒。粘粒是直径小0.2um矿质颗粒，大矿质颗粒为粉粒和砂粒。粘粒理化性质最活泼，同微生物关系也最亲密。土壤微生物医学知识专家讲座第18页土壤中粘粒一些特征土壤微生物医学知识专家讲座第19页团聚体微孔与结构土壤微生物医学知识专家讲座第20页土壤团聚体之间和内部气体与水分情况差异也很大，而且是处于变动状态。土壤空隙能够完全充满水分或气体，或二者兼而有之，影响微生物不一样类群活跃程度。因为土壤结构性，即使在通气很好表土层中也存在缺氧部位。土壤微生物医学知识专家讲座第21页土壤团聚体内外CO2，O2浓度差异很大。土壤气体中CO2浓度普通比大气中含量高1—3个数量级。CO2和O2浓度改变受气体扩散和微生物呼吸作用影响。当土壤缺氧时，不但CO2浓度增高，而且N2O、N2、CH4和H2S等还原性气体含量也增加。土壤微生物医学知识专家讲座第22页土壤团聚体内外氧气分布（a)图示一个耕地粉砂壤土团聚体氧气浓度随距表面距离延伸而快速降低，至中央部位为一厌氧带；(b)等氧压线图示耕地土壤一个团聚体，在近中心部位为一厌氧带，由此向外氧气浓度逐步升高，数字示O2%。土壤微生物医学知识专家讲座第23页团聚体表面主要是好氧微生物，而且微生物之间竞争较激烈，数量和组成常有改变。生活在团聚体内部微生物主要是厌氧微生物，而且数量和组成相当稳定。以微菌落形式存在。土壤微生物医学知识专家讲座第24页土壤微生物医学知识专家讲座第25页土壤微生物医学知识专家讲座第26页二、土壤异质性与微生物分布不均匀性和动态改变由矿物质、有机质和微生物等固相及气相和液相组成土壤，是地球上异质性极显著自然体，不但含有层次性差异和复杂内部结构，即使在同一层次不一样团聚休内外微生物分布也有很大差异，造成微生物在土壤中分布不均匀性。土壤微生物医学知识专家讲座第27页耕作影响下土壤异质性尤为显著施入有机和无机肥料即使充分耕翻也不可能是均匀地分布在土层各个部位；浇灌和施用农药等农业技术办法也加剧了土壤异质性。所以，取土壤样品是非常关键，多点取样

土壤微生物医学知识专家讲座第28页三、土壤微生物季节性改变春末微生物数量开始上升，到夏季到达最高，到秋天开始又下降，冬季微生物数量最少。原因：一是温度，微生物生长需要适当温度，低温不利于微生物生长繁殖二是营养，春末开始，植物开始生长，到了夏季，各种植物生长最为旺盛，根分泌物增多，促进微生物生长土壤微生物医学知识专家讲座第29页第三节土壤中微生物数量及其活性微生物数量决定于土壤特征，各种土壤都有一定载菌量和菌容量，它决定于土壤环境理化原因微生物数量增减受各种外界原因影响。营养：当大量营养物质(如新鲜有机质)进入土壤时，异养型微生物数量急剧增加，但养料消耗后数量会下降。土壤中某种微生物能够在数量上占优势或暂时含有较多数量，但不可能连续。土壤温度：土壤微生物医学知识专家讲座第30页微生物之间是相互制约当某一类群微生物数量剧增时，其它类群微生物发展可能受到限制，甚至数量降低。微生物数量能够用细胞数量来表示，也能够用生物量来表示。土壤微生物医学知识专家讲座第31页一、土壤微生物数量细菌（bacteria）：107-9/g土放线菌（actinomyces）：106-7/g土真菌(fungi)：103-4/g土藻类(algae):５万个／克土原生动物(protozoon):３万个／克土数量：细菌＞放线菌＞真菌＞藻类＞原生动物若按生物量计算则真菌生物量最大。土壤微生物医学知识专家讲座第32页上述微生物数量是可培养微生物数量土壤中微生物绝大多数是不可培养（＞95%）不可培养微生物（unculturedmicroorganisms）土壤微生物医学知识专家讲座第33页土壤中微生物含量与土壤性状直接相关。有机质含量高土壤——微生物数量高,反之则少。中性土壤——微生物数量多酸性土壤、碱性土壤——微生物数量少干旱土壤微生物数量少耕作土壤比撂荒土壤中微生物数量多（为何？）土壤微生物医学知识专家讲座第34页

不一样类型土壤中微生物数量不一样土壤类型、肥力水平，土壤微生物数量和分布有很大差异。普通来说，我国不一样土壤微生物总数，呈以下改变趋势：黑钙土>棕壤>灰壤>水稻土>砖红壤土壤微生物医学知识专家讲座第35页二、微生物个体数量测定1、平板培养计数法制备土壤悬液，进行系列稀释后，涂布在适当培养基上培养土壤微生物医学知识专家讲座第36页2.最大或然数(most

probable

number，MPN)计数（稀释培养计数）适合用于测定在一个混杂微生物群落中虽不占优势，但却含有特殊生理功效类群。其特点是利用待测微生物特殊生理功效选择性来摆脱其它微生物类群干扰，并经过该生理功效表现来判断该类群微生物存在和丰度。如氨化菌、硝化菌、纤维素分解菌、硫化和反硫化细菌等

土壤微生物医学知识专家讲座第37页测定原理和步骤原理：MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到稀释液中没有或极少几个。依据没有生长最低稀释度与出现生长最高稀释度，采取“最大或然数”理论，计算出样品单位体积中细菌数。步骤：菌液经屡次10倍稀释后，一定量菌液中细菌能够极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜液体培养基中。培养后，将有菌液生长最终3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数稀释倍数，即为原菌液中含菌数。土壤微生物医学知识专家讲座第38页如某一细菌在稀释法中生长情况以下；稀释度

10-310-410-510-610-710-8重复数

5

5

5

5

5

5

出现生长管数

5

5

5

4

1

0

依据以上结果，在接种10-3——10-5试管中，5个重复都有生长；在接种10-6稀释液试管中有4个重复生长；在接种10-7稀释液试管中有1个重复生长；而10-8稀释液试管中没有生长。由此得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数稀释倍数（10-5稀释倍数为105）。1ml原菌液中活菌数＝17×105。土壤微生物医学知识专家讲座第39页基于培养计数法缺点第一，没有一个培养基和培养条件能够把土壤中各种多样微生物都同时培养出来，而分类培养是很繁琐，何况90％以上土壤微生物尚不知道怎样培养。如用营养丰富牛肉汁蛋白胨来测定土壤细菌总数并不很适合，因为土壤中微生物大多是贫营养。土壤微生物医学知识专家讲座第40页温度影响普通试验室在分离、培养土壤细菌时通常只是在28-30℃下培养。但土壤中存在高温型细菌和低温细菌，但都被忽略了。其实在寒温带和温带地域土壤中也存在低温型甚至嗜冷细菌。pH影响普通细菌培养基pH为7.0左右。显然细菌中存在着嗜酸或嗜碱种群土壤微生物医学知识专家讲座第41页日本学者从日本土壤中分离到许多生长于pH10和和0℃下细菌，从约1000个土样分离菌株中经纯化后有83株于0℃下在含1％Na2CO3固体培养基上生长，其中仅50株能在液体培养基中生长。在加拿大土壤中也于低温条件下分离别油菜促生细菌。华中农业大学研究者在28℃和10℃下分离到小麦根圈细菌类型有差异。土壤微生物医学知识专家讲座第42页第二，不可能在制备土壤悬液时把土壤中微生物都清洗下来，所以取得结果大大低于实际数量土壤微生物医学知识专家讲座第43页第三，能够洗脱出来微生物也不是全部细胞都能在培养基上生长和繁殖，有些细胞可以转变为不可培养状态

土壤微生物医学知识专家讲座第44页第四，微生物个体数量对于细菌而言，一个细胞就是一个独立个体，而对丝状微生物如霉菌来说，测定结果就难以说明问题，因为一条长菌丝能够形成一个菌落，它断裂为一些片段后能够分别形成许多菌落，使不一样样本之间缺乏可比性。土壤微生物医学知识专家讲座第45页3.显微境下直接测数法快速粗放不能区分活细胞和死细胞或者微小土壤颗粒，超微细菌和粘粒即使在电镜下也难以区分，所以细胞总数测定是很粗放土壤微生物医学知识专家讲座第46页3.荧光定量PCR技术提取土壤总DNA测定细菌16SrRNA基因拷贝数测定真菌18SrRNA基因拷贝数结果表示：16S（18S）rRNA基因拷贝数/g土壤误差来自：DNA提取效率PCR扩增土壤微生物医学知识专家讲座第47页三、微生物生物量测定原理微生物生物量即微生物生物物质(microbialbiomass)，它是指微生物活体总量间接测定：生物量＝细胞数×体积×比重。直接测定：直接测定微生物生物量比测定个体数量更能反应微生物在土壤中实际含量和作用潜力。土壤微生物医学知识专家讲座第48页(一)生物量测定生理学方法生理学方法是依据微生物代谢活性来测定生物量。当前使用比较广泛是英国学者詹金森(Jenkinson)等提出土壤熏蒸法。土壤微生物医学知识专家讲座第49页微生物碳测定原理和主要步骤：先将氯仿(CHCl3)放入盛有土样容器中，密闭容器，使其散发为气态，渗透土壤样本以杀死全部微生物。再开启容器或用气体置换法使土样中残余气态氯仿全部散发，然后以少许同一土样接种，置温室中培养。最终测定经氯仿熏蒸杀死土样中微生物残体被重新接种微生物分解矿质化后所释放出来CO2量。同时用待测土样作对照，除不加氯仿处理外，其余步骤完全一样。土壤微生物医学知识专家讲座第50页经过比较氯仿熏蒸后土壤和未经氯仿熏蒸土壤中释放CO2量差异来计算生物量。在计算时要利用一个转换系数，普通是0.4—0.5。因为细菌矿化率约为33％、真菌约为44％，假定土壤中细菌和真菌生物量之比为1：3，所以平均矿化率为41%。土壤微生物医学知识专家讲座第51页(二)生物量测定生物化学方法生化测定方法原理是分析各类微生物细胞中都具备且含量较靠近、但不在土壤中游离存在生化成份，以此来计算微生物生物量。较常测定成份有DNA、ATP、细胞壁成份和光合微生物色素等。土壤微生物医学知识专家讲座第52页1.土壤DNA测定DNA在微生物细胞中含量较恒定2.ATP含量测定因为细胞死亡后ATP快速消失，所以能够依据测定土壤中ATP浓度来计算生物量。测定方法：荧光比色法，高压液相色谱关键：必须快速破碎细胞并钝化ATP合成酶和降解酶活性。土壤微生物医学知识专家讲座第53页从土壤ATP量换算为细胞碳量时普通以120作为系数，水体样本采取系数为250一286。用ATP来换算生物量不如DNA测定法准确。因为有些微生物在营养和生理条件改变时，ATP含量起改变。所以有些人提议经过测定土壤中总腺苷酸库(AT)来计算生物量，其数值不因细胞代谢情况而波动。计算公式是：AT＝ATP＋ADP＋AMP土壤微生物医学知识专家讲座第54页土壤微生物数量(包含细胞数和生物量)只能在一定程度上比较微生物作用强度，或者只说明它们潜在活性。比如，有孢子和休眠细胞在平板培养测数时能够生长，但并非代谢旺盛细胞．所以研究工作者有时需要测定土壤中微生物实际活性

三、土壤中微生物活性测定土壤微生物医学知识专家讲座第55页1.放射性同位素法比如，测定光合微生物光合作用，能够使微生物吸收14CO2，再测定细胞14C量测定硫酸盐还原作用能够利用35SO42-，然后分析H235S；测定土壤微生物呼吸强度能够加入14C标识有机物质，然后分析14CO2产生。土壤微生物医学知识专家讲座第56页2.稳定性同位素法研究中应用最多是C和S稳定性同位素。自然界碳素主要以12C存在，但也有少许13C；硫素主要为32S，也存在34S.应用原理：大多数生化过程优先利用较轻碳和硫。如在12CO2和13CO2同时存在下，光合微生物细胞碳素富集12C，残留CO2则富集了13C。土壤微生物医学知识专家讲座第57页依据“重”与“轻”同位素百分比能够测知生物过程和时间性所以稳定性同位素测定法不但能够用于研究土壤中微生物活性和作用过程及土壤中腐殖质形成及其寿命，而且能用于地球物质大循环以及土壤圈同其它生态圈物质交换。土壤微生物医学知识专家讲座第58页3.微生物呼吸率向土样中加入基质后在短期内出现呼吸强度同微生物活性成百分比。这一方法同熏蒸法有很好相关性而且加用不一样抑菌剂时能够分别测定细菌和真菌生物量。土壤微生物医学知识专家讲座第59页第三节土壤微生物种群结构土壤微生物医学知识专家讲座第60页一、土壤细菌A、单细胞,B、繁殖速度快C、个体微小(um)，靠近于土壤粘粒大小D、以杆菌占优势，G-为主E、数量大：细菌占土壤微生物总数70%～90%F、多样性最丰富——营养类型多样性，代谢多样性，遗传多样性G、中性土壤中多

耕作土壤中，以每亩20cm深耕作层土壤重30万千克计，细菌湿重约90-225kg/亩；以土壤有机质含量为2%计算，则所含细菌干重约为土壤有机质1%左右

土壤微生物医学知识专家讲座第61页Caulobacter——柄杆菌Corynebacterium——棒杆菌属

Bdellovibrio-——蛭弧菌土壤微生物医学知识专家讲座第62页土壤放线菌actinomyces

土壤放线菌：是生活于土壤中呈丝状单细胞、革兰氏阳性原核微生物。

在自然界分布很广，绝大多数为腐生，少数寄生。产生种类繁多抗生素，据预计，已发觉4000各种抗生素中，有2/3是放线菌产生，如链霉素、庆大霉素、利福霉素等。

土壤微生物医学知识专家讲座第63页放线菌（原核生物）多分布在有机物较丰富碱性土壤中。放线菌生长使土壤带有特殊土腥气味。放线菌也是原核微生物，菌丝比真菌细，经过断裂菌丝繁殖或无性孢子繁殖土壤中放线菌数量仅次于细菌105-107/克土壤

放线菌占土壤微生物总数5％~30%因为菌体大，其生物量与细菌靠近。土壤微生物医学知识专家讲座第64页土壤中主要放线菌优势属:链霉菌属（streptomyces)诺卡氏菌属(Nocardia)小单孢菌属(Micromonospora)土壤微生物医学知识专家讲座第65页土壤微生物医学知识专家讲座第66页

土壤真菌：菌体多呈分枝丝状，少数菌丝不发达或缺乏，具真正细胞核——真核生物。

生态习性：适宜酸性；好气性微生物；化能有机营养型作用：是土壤中糖类、纤维类、果胶和木质素等含碳物质分解主动参加者。土壤微生物医学知识专家讲座第67页

菌体粗大，菌丝最长可达40米，其生物量是全部微生物类群中最高，。土壤霉菌为好氧性微生物，普通分布于土壤表层，深层较少发育，以丝状体和孢子体形式存在于土壤中，103-104/克土壤，喜欢酸性土壤，如森林土壤中数量多土壤微生物医学知识专家讲座第68页真菌属异氧型微生物。土壤真菌多少与土壤有机质含量亲密相关。依据真菌营养过程将真菌分为三类：寄生真菌：引发植物病害；腐生真菌：分解有机残体；共生真菌：与植物体共生，也叫菌根菌。土壤微生物医学知识专家讲座第69页土壤中真菌主要类群：青霉(Penicillium)曲霉(Aspergillus)镰刀霉(Fusarium)木霉(Trichoderma)根霉(Rhizopus)毛霉（Mucor）。土壤微生物医学知识专家讲座第70页酵母菌真核生物单细胞，有时候为假菌丝主要存在于果园土壤中，酵母在果园土壤里含量几十万个／g土壤。土壤微生物医学知识专家讲座第71页藻类（植物还是微生物？）含叶绿素，能进行光合作用，合成有机质。因为需要光，它们主要生活在土壤表层。地表藻类能够和土壤颗粒粘结在一起，增加土壤表面强度，可使土壤侵蚀显著减轻。另外蓝绿藻可固定N素。土壤微生物医学知识专家讲座第72页藻类包含单细胞或多细胞原核或真核生物土壤中藻类主要是绿藻和硅藻。在土壤微生物总量中不足1%。

土壤微生物医学知识专家讲座第73页土壤微生物医学知识专家讲座第74页土壤藻类是土壤生物先行者，可经过光能自养能力,成为地球上有机物质制造者之一。荒地和沙漠土壤中腐殖质多来自土壤藻类。依据藻类生长情况，可判断出土壤肥力情况和性质。肥沃土壤，藻类生长旺盛，土表常出现黄褐色或黄绿色薄藻层，硅藻多则是土壤营养丰富证实土壤微生物医学知识专家讲座第75页Botrydiopsisarhiza

土壤微生物医学知识专家讲座第76页原生动物原生动物:３万个／克土纤毛虫，鞭毛虫、肉足虫等为主，它们以其它微生物和有机物碎片为食，对其它几类微生物数量起调整作用。土壤微生物医学知识专家讲座第77页第四节土壤微生物个体生态学与原位研究群体生态学(synecology)研究由各种生物组成群落(Community)及与环境相互关系个体生态学(autecology)研究一个生物(甚至一株植物或一个动物)与环境相互关系土壤微生物医学知识专家讲座第78页一、细菌个体生态学研究技术个体生态学不但要区分土壤中不一样细菌种，而且还要分别研究种内不一样类型菌株和个体动态，但土壤是细菌数量众多诸种微生物共居异质体，所以要求采取特异性很高方法和伎俩来跟踪研究对象。土壤微生物医学知识专家讲座第79页用特异DNA或RNA序列作为核酸探针检测引入环境中目标微生物，探针与从土壤中提取DNA或RNA杂交，依据杂交信号有没有、强弱分析目标微生物；或者和经过培养后菌落杂交，能够检测目标微生物数量。目标微生物检测方法1、核酸探针法土壤微生物医学知识专家讲座第80页用探针和环境中DNA杂交。土壤微生物医学知识专家讲座第81页菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）：是将环境中细菌培养后，再将菌落转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后将膜上菌落裂解以释放出DNA，DNA经烘干固定后与标识探针杂交，检测杂交信号土壤微生物医学知识专家讲座第82页2、PCR-baseddetectionmethods常规PCR法检测是依据所设计引物对特异性片段进行PCR扩增，经过对产物琼脂糖凝胶电泳，看是否能扩增出特异性条带来检测样品中是否含有目标微生物

现已发展了许多衍生技术，如原位PCR、套式PCR、荧光定量PCR以及real-timePCR等

土壤微生物医学知识专家讲座第83页3、免疫学方法依据微生物本身特异性蛋白或外源基因能产生蛋白，制备对应抗体，再用对应抗体去检测，以此同其它微生物相区分。免疫荧光菌落染色(IFCS)和菌落免疫杂交检测(colonyimmunoblotassay)技术既应用了免疫学和杂交技术选择性，又利用了菌落分离优点。土壤微生物医学知识专家讲座第84页土壤微生物医学知识专家讲座第85页免疫学或遗传标识探针技术能提供特定细菌总细胞浓度方面信息，但并不能展示土壤中特种生物群体存活力及生理活性，而且技术要求高、费用高、操作复杂。所以，其应用有不足。土壤微生物医学知识专家讲座第86页4标识基因检测法基因标识是指将外源DNA引入受体菌株，经表示以后，使受体菌株细胞能够在环境中与其它微生物相区分。标识基因分为：选择基因：担负筛选细胞作用，如抗生素抗性基因汇报基因：则是依据表示产物直接显示目标微生物存在，汇报基因是一个编码可被检测蛋白质或酶。土壤微生物医学知识专家讲座第87页一、标识基因必须具备基本条件（1）环境中应极少或没有这种标识系统存在，所以不产生背景干扰或者干扰很小;（2）标识基因能够在宿主细胞中稳定存在;（3）标识基因表示对目标生物生理、生化性质影响小;(4)标识基因表示能够到达可检测水平，检测灵敏度高，检测过程方便简单;(5)应用于田间试验对环境不产生影响——环境安全。土壤微生物医学知识专家讲座第88页二、标识基因种类

1、抗性标识基因

a.

抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，Hygrb.重金属抗性基因:Cur，Znr，Cdr

潮霉素抗性基因Hygr是真核微生物中最惯用是标识基因抗性标识能够经过分子生物学方法取得或者经过传统突变方法取得采取抗生素（或重金属）选择性培养基检测目标微生物土壤微生物医学知识专家讲座第89页

四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中一个蛋白质分子上，抑制核糖体转位过程。四环素抗性基因编码一个399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。土壤微生物医学知识专家讲座第90页氨苄青霉素抗性基因（Apr）

Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参加细胞壁合成酶类活性。Apr抗性基因编码一个分泌到细菌细胞周间质酶，催化β—内酰胺环水解，使氨苄青霉素失活。氯霉素抗性基因（Cmr）

Chlorophenicol可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，造成乙酰化氯霉素不能结合在核糖体上。土壤微生物医学知识专家讲座第91页卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)抗性基因Kanamycin，Neomycin均属脱氧链霉氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质合成。Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。土壤微生物医学知识专家讲座第92页抗生素抗性作为检测标识含有简便、快速、费用低、试验结果能够进行统计分析等优点。因为土著微生物中一些微生物会产生不一样程度天然抗性，对目标微生物菌数测定会有影响。如选择两种或两种以上抗生素基因标识，则测定结果非常可靠。

为了预防抗生素抗性基因扩散，生态学研究中通常不采取抗生素抗性基因，即使要用，也尽可能不要采取人类疾病治疗惯用抗生素对应抗性基因。抗生素抗性基因不要标识在质粒上（因为质粒轻易扩散），而要标识在染色体上土壤微生物医学知识专家讲座第93页2、显色基因其表示产物（酶）可催化一些易检测生化反应，如lacZ,GUS

土壤微生物医学知识专家讲座第94页β-半乳糖苷酶基因lacZ带有lacZ微生物在含有底物5-溴-4-氯-3-吲哚二分之一乳糖苷（X-Gal）平板上或溶液中使菌落(菌体)变成蓝色，检测直观Background：activity

Visibleonlyinbigamountsofcells(colonies)土壤微生物医学知识专家讲座第95页土壤微生物医学知识专家讲座第96页邻苯二酚2,3一双加氧酶基因（xylE）XylE催化邻苯二酚产生黄色产物——使得标识菌菌落展现黄色土壤微生物医学知识专家讲座第97页β—葡萄糖苷酶基因(gus)该基因编码一个可分解各种β-葡萄糖苷衍生物水解酶。它适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。gus基因(3’端)与其它结构基因形成融合基因后仍能够正常地表示，所产生融合蛋白依然含有GUS活性。土壤微生物医学知识专家讲座第98页①在一定条件下与X-G1ucuronicacid（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronicacid）底物发生作用，产生蓝色物质，既能够用分光光度计法测定，又能够直接观察到植物组织中形成蓝色斑点。②当加入4-甲基伞形酮基-葡萄糖酸苷时生成4-甲基伞形酮，发荧光（λ=465nm）。因而能够用荧光光谱法测定。因为荧光强度高，本底低，故荧光检测极为灵敏。③检测轻易、快速并能定量。④价格廉价。土壤微生物医学知识专家讲座第99页未标识菌株形成根瘤gus标识菌株形成根瘤土壤微生物医学知识专家讲座第100页3、生物发光基因发光酶是生物体内催化发光反应一类酶家族萤火虫发光酶Luc，催化ATP至底物萤光素之间能量转移产生光能，不过因其底物昂贵极少应用;细菌发光酶lux，它催化长链脂肪醛和FMNH2(黄素单核苷酸)氧化产生蓝绿色光。绝大多数发光细菌是从海洋中分离到，只有发光致病杆菌(Xenorhabdusluninescens)分离自人体伤口和昆虫病原线虫。尽管(X.luninescens)是一个陆栖细菌，但其与线虫共生，迄今尚无采取平板直接分离到作为根圈细菌群落组员自然生物发光细菌报道。土壤微生物医学知识专家讲座第101页许多Lux标识菌株发光水平足以满足在暗室内直接观察平板上生长发光菌落;土壤微生物医学知识专家讲座第102页BioluminiscenceluxCDABE

ABcodefortheluciferase

CDEcodeforluciferinbiosynthesis

markstrategies:

IntroducethewholeoperonluxCDABE

IntroducetheluciferasegeneluxAB

Luciferinhastobeexternallyadded

土壤微生物医学知识专家讲座第103页4、发光蛋白质基因发光蛋白是由水母产生一个可发光蛋白质。绿色荧光蛋白基因（gfp）红色荧光蛋白基因（rfp）其它土壤微生物医学知识专家讲座第104页

土壤微生物医学知识专家讲座第105页绿色荧光蛋白发觉、基本结构及性质

GFP发觉绿色荧光蛋白(greenfluorenscentprotein,GFP)最初是从维多利亚多管水母(Aeguoriavictoria)中发觉天然荧光蛋白(aequorin)，当结合Ca2+后发出蓝光，紫外光激发GFP产生绿色荧光土壤微生物医学知识专家讲座第106页GFP基本结构GFP三维结构是由11股链组成β一圆柱状结构，圆柱中心带有一个与其共轴变形a一螺旋，生色团就位于该a一螺旋中。GFP氨基酸序列中65-67位丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸经过共价键形成独特、相当稳定环状三肽结构，组成GFP生色基团关键。这种坚固桶状结构能够非常有效地保护生色团，赋予GFP高度稳定性，使其能够抵抗高温及变性剂。生色团形成需要分子氧土壤微生物医学知识专家讲座第107页绿色荧光蛋白应用优点GFP构象非常稳定，在细胞中表示GFP自发环化成熟，保持它荧光特征。土壤微生物医学知识专家讲座第108页检测方便因为GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质可能难于进入细胞问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就能够观察到，而且灵敏度高，对于单细胞水平表示也可识别。土壤微生物医学知识专家讲座第109页荧光稳定GFP对光漂白有较强耐受性，能耐受长时间光照;GFP在pH7-12范围内也能正常发光;对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶Pronase除外)都有较强抗性。土壤微生物医学知识专家讲座第110页无毒害

从当前研究结果来看，GFP对生活细胞基本无毒害，对目标基因功效也没有影响。共用性和通用性

首先表现在GFP表示几乎不受种属范围限制，在微生物、植物、动物中都取得了成功表达;其次是GFP没有细胞种类和位置上限制，在各个部位都能够表示发出荧光。土壤微生物医学知识专家讲座第111页易于构建载体

因为GFP分子量较小，仅为27-30kD，编码GFP基因序列也很短，为2.6kb所以很方便地同其它序列一起构建各种质粒，而不至于使质粒过大影响转化率。可进行活细胞定时定位观察

对活细胞中蛋白功效研究，更能靠近自然真实状态。经过GFP可实时观察到外界信号刺激下，目蛋白改变过程，借助于最近广泛使用激光扫描共聚焦显微镜，结合强大计算机软件，可进行三维显示。土壤微生物医学知识专家讲座第112页易于得到突变体GFP中氨基酸替换可产生不一样光谱特征突变体，而且增强了荧光强度，适合在不一样物种中专性表示。

土壤微生物医学知识专家讲座第113页土壤微生物医学知识专家讲座第114页GFP-labelledrice-blastfungus

土壤微生物医学知识专家讲座第115页Leaf(b)andstem(c)withconfocalimagesshowingGFP-expressingM.griseaGuy11inthediseasedareasandalsointhevasculartissueoftheleafandstem土壤微生物医学知识专家讲座第116页土壤微生物医学知识专家讲座第117页Confocalscanninglasermicroscopyanalysisoftomatoroots(redbyautofluorescence)beingcolonizedbythephytopathogenicfungusFusariumoxysporumf.sp.radicislycopersicimarkedwithgfp.Theimagewastaken3daysaftergerminatedtomatoseedshadbeenplantedinsandcontainingsporesofF.oxysporumf.sp.radicislycopersici.Ontheirwaytowardtherootsurface,fungalhyphae(green)hadbeenattachedtoandintermingledwithroothairsinthecrownzone.土壤微生物医学知识专家讲座第118页Peroxisomalfattyacidbeta-oxidationisnecessaryforplant