斑马鱼的性腺发育

斑马鱼的性腺发育斑马鱼的性腺发育第1页精巢组织学结构和不一样发育阶段生殖细胞形态精巢一对，位于腹腔背部两侧，体积较小，以系膜与体壁相联，左右精巢彼此分开，在尾端合并成一条很短输精管，和普通鲤科鱼类相同。生殖上皮伴随结缔组织向精巢内部延伸，形成许多隔膜，把精巢分成许多不规则精小叶，从其横切面上可见许多精小叶紧密排列，但没有一定规律性，精小叶为精巢实质个别，因其呈管状又可称为精小管。在精小叶内由许多精小囊组成，伴随精巢发育，精小叶内各精小囊间生精细胞发育不一样时，而在同一精小囊内生精细胞发育是同时。精小叶中央为小叶腔，小叶腔在精巢内相互连接成网状，最终通到输精管，精原细胞位于精小叶边缘处，在分化过程中，当生殖细胞在精小囊内发育成为成熟精子时，精小囊破裂，成熟精子释放到小叶腔中，各小叶腔内精子最终聚集到输精管内并可借助于输精管排出，所以成熟精子只在小叶腔和输精管内存在。生殖细胞在发生上由外向里可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。斑马鱼的性腺发育第2页繁殖期，V期精巢斑马鱼的性腺发育第3页III期精巢；小叶腔显著，初级精母细胞排列多层，百分比尺示24μmSg，精原细胞；ScⅠ，初级精母细胞；ScⅡ，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊斑马鱼的性腺发育第4页VI期晚期精巢，示精小囊内发育同时各期生殖细胞，百分比尺示24μmSg，精原细胞；ScⅠ，初级精母细胞；ScⅡ，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊斑马鱼的性腺发育第5页V期早期精巢，示精原细胞，精母细胞，精子细胞和精子，百分比尺示24μmSg，精原细胞；ScⅠ，初级精母细胞；ScⅡ，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊斑马鱼的性腺发育第6页V期中期精巢，示成熟精子充满整个精小叶，百分比尺示24μm；Sg，精原细胞；ScⅠ，初级精母细胞；ScⅡ，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊斑马鱼的性腺发育第7页Ⅵ期精巢，示精子排出后留下空腔，腔内有少许残余精子和第二次发育由精原细胞有丝分裂产生初级精母细胞.Sg，精原细胞；ScⅠ，初级精母细胞；ScⅡ，次级精母细胞；St，精子细胞；Sz，精子；LL，小叶腔；LC，间质细胞；SC，支持细胞；ST，精小囊斑马鱼的性腺发育第8页卵巢组织学结构和不一样发育阶段生殖细胞形态斑马鱼卵巢一对，左右两叶，大个别对称；成熟卵巢呈囊状，位于体腔内，外被由平滑肌和结缔组织形成卵巢膜，卵巢膜不发达。卵巢位于腹中线两侧，在鱼体后端汇合成一短输卵管，进入泄殖腔，由泄殖腔开口于体外。卵母细胞直径、核径和核质比在不一样时相中改变:

卵母细胞在Ⅱ时相增加不显著，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ时相期增加快速胞核直径在Ⅱ时相增加快速，在Ⅲ时相中期、Ⅳ时相增加迟缓，几乎没有改变核质比在第Ⅱ时相最大，伴随卵母细胞发育，核质比越来越小斑马鱼的性腺发育第9页卵巢壁:由两层被膜组成，外层为腹膜，内层为白膜。白膜由外到内依次为扁平上皮细胞、疏松结缔组织、间质组织和生殖上皮。产卵板:白膜中结缔组织向卵巢内部伸展与卵巢生殖上皮共同组成板层状结构，称产卵板，是卵子产生地方。卵巢腔:存在于卵巢内部空腔，与输卵管相通。SB产卵板斑马鱼的性腺发育第10页不一样龄雌鱼卵巢发育0～16日龄:没有观察到性腺发育情况。17～22日龄:原始生殖细胞没有两性分化，数量开始增多，并逐步聚集成团，细胞质嗜酸性，核较大，嗜碱性，有一显著核仁。27日龄:原始生殖细胞分化为卵原细胞，体积变大，数量增多，成排排列，在腹腔后背个别布，与肝胰脏相连。32～57日龄:卵巢体积较小，位于腹腔后背部，靠近肝胰脏。卵巢内主要为第Ⅰ时相卵母细胞，细胞体积小，圆形，细胞质少，有一显著细胞核。核中部有1～2个核仁，核内染色质细丝状。62日龄:主要为第Ⅱ时相卵母细胞，细胞为多角形、圆形。细胞质较多，染色较深，为淡紫红色。核对应增大，弱嗜酸性，核仁数个，靠近核膜内侧分布。卵母细胞外面有一层滤泡细胞。67～72日龄:卵巢粗短，主要存在第Ⅱ时相和发育早期第Ⅲ时相卵母细胞。早期第Ⅲ时相卵母细胞比第Ⅱ时相卵母细胞体积大，圆形或椭圆形，染色较浅，核周细胞质内出现少许空泡。细胞核较大，弱嗜酸性，核仁多个，分布在核膜内缘，被染成深蓝色。卵母细胞外周辐射带很薄，结构不显著，细胞外隐约能看到两层滤泡膜。斑马鱼的性腺发育第11页77日龄:以第Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞为主，大个别第Ⅲ时相卵母细胞处于发育中期。中期第Ⅲ时相卵母细胞近圆形，体积显著增大。胞质空泡内出现了嗜酸性卵黄颗粒，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。卵核体积增大，染色较浅，核仁多个，分布在核膜内缘。随卵母细胞发育，核仁逐步向核中央移动，呈深蓝色。细胞周围辐射带显著，并伴随细胞体积增大而增厚，细胞外两层滤泡膜发育显著。82～90日龄:以第Ⅲ、第Ⅳ时相卵母细胞为主。晚期第Ⅲ时相卵母细胞体积较大，空泡内充满卵黄。第Ⅳ时相卵母细胞因为卵黄物质不停积累，细胞体积继续增大，圆球形卵黄颗粒基础充满卵母细胞质。细胞核逐步由中央向动物极移动。卵巢壁随卵母细胞数量增多和体积增加而逐步变薄，放射带显著增厚。成熟小鱼:卵巢白膜变得很薄。卵巢以第Ⅴ时相卵母细胞为主，也存在有发育早期卵母细胞。第Ⅴ时相卵母细胞已充分发育，呈圆球形，卵黄颗粒相互融合，细胞质中充满粗大卵黄颗粒，散布于整个卵母细胞胞质内。至此，卵母细胞发育成熟，很快，核膜崩解、消失，卵母细胞进入第2次成熟分裂中期，形成次级卵母细胞，排到卵巢腔。产卵后小鱼:卵巢细长，结构涣散，包含有排卵后空滤泡、第Ⅱ时相、第Ⅲ时相和第Ⅳ时相卵母细胞。斑马鱼的性腺发育第12页繁殖期，IV期卵巢斑马鱼的性腺发育第13页Ⅰ期：初级生长久(primarygrowthstage)，卵母细胞(卵泡)体积小(7~140μm)，卵母细胞开始生长。Ⅱ期：皮质泡时期(corticalalveolusstage)，卵泡直径140~340μm。卵母细胞体积深入增大，卵母细胞外周皮质区出现许多小泡。Ⅲ期：卵黄增生期(vitellogenesisstage)，卵泡直径340~690μm。卵母细胞体积增加很快，卵黄颗粒物质快速积累，越靠近细胞核，卵黄颗粒越大。Ⅳ期：卵母细胞成熟期(oocytematurationstage)，卵泡直径690~730μm。因为卵黄颗粒数量和体积增加，圆球形卵黄颗粒基础充满卵母细胞细胞质。Ⅴ期：成熟卵期(matureeggstage)，卵泡直径730~750μm。卵母细胞成熟，细胞内充满了粗大卵黄颗粒。斑马鱼的性腺发育第14页1Ⅱ时相卵母细胞(皮层滤泡期或卵黄生成前期)

主要是处于小生长久卵母细胞。卵母细胞直径在约为54.56～94.24μm，核径约为29.76～59.52μm，核质比约为：0.11～0.42。核形不规则，呈圆形、椭圆形或多角形，细胞质嗜碱性，H.E染色呈深紫色，核浅蓝色，位于细胞中央。在同一切面上核内有3-10个核仁，沿核膜内缘分布。依据卵径大小和结构形态不一样，这个时相又能够分为三个阶段；在早期，卵母细胞形态依然不规则，形状多变；在发育中期，卵母细胞呈近圆球形；发育晚期，卵母细胞内生长环快速扩充。滤泡膜仅一层。斑马鱼的性腺发育第15页Ⅲ时相卵母细胞(卵黄生成期)主要是处于大生长久早期初级卵母细胞。第3时相卵母细胞比第2时相卵母细胞大，但染色要浅。卵母细胞呈圆球形，该时相卵母细胞开始出现液泡，内含物被H.E染成淡红色。滤泡膜上皮细胞开始分裂，并与卵母细胞质膜分离，出现不显著放射带。依据卵母细胞大小、卵黄沉积多少以及放射膜有没有将其分为早、中、晚三个时期。斑马鱼的性腺发育第16页Ⅲ时相早期卵母细胞直径在约为97.3～155.68μm之间，核径约为38.92～68.11μm，核质比约为：0.02～0.14。胞质弱嗜碱性。核质嗜酸性，核仁位于核膜内缘，主要为小核仁，35个左右。细胞质外缘出现少许小液泡，直径1～2μm，较透明，内含物极少。卵母细胞外周放射带很薄，结构不显著。此时已经形成两层膜结构。斑马鱼的性腺发育第17页Ⅲ时相中期卵母细胞显著增大，卵母细胞直径在约为124～198.4μm，胞核约49.6～119.04μm，核质比为0.03～0.36。核质被染成浅紫色，大核仁少见，小核仁约40个左右，其中较大分布于核膜内侧，较小散在于核质中。放射带发育显著。内层膜细胞呈立方形，而外层仍为扁平形。斑马鱼的性腺发育第18页Ⅲ时相晚期卵母细胞增大为145.95～330.82μm，核径为48.65～58.38μm，核质比0.006～0.06。液泡充满卵黄，放射带外周形成均染粉红色胶质膜结构，小核仁45个左右，多位于核膜内侧周围。斑马鱼的性腺发育第19页IV时相卵母细胞(卵母细胞成熟期)主要是处于大生长久晚期初级卵母细胞。因为卵黄物质不停积累，卵母细胞细胞体积继续增大、卵黄快速积累、液泡被积压到卵母细胞周围细胞质中，圆球形卵黄颗粒基础充满卵母细胞质，卵母细胞直径在约为379.47～447.58μm，胞核约38.92～68.11μm，核质比为0.0007～0.004，细胞质及细胞核开始由中央直接移向动物极移动，卵母细胞开始表现出极性。放射带显著增厚。斑马鱼的性腺发育第20页V时相卵母细胞(成熟卵期)卵母细胞已充分发育，呈圆球形，卵径约为467.04～564.34μm。卵黄颗粒相互融合，细胞质中充满粗大卵黄颗粒，卵黄颗粒散布于整个卵母细胞胞质内，至此，卵母细胞已经成熟，以后便脱离滤泡膜而排入卵巢腔。斑马鱼的性腺发育第21页2.2.2.5VI时相卵母细胞卵细胞排出，剩下空滤泡膜，形状不规则，蜷曲于卵巢内。斑马鱼的性腺发育第22页斑马鱼繁殖斑马鱼的性腺发育第23页斑马鱼为研究脊椎动物胚胎发育理想模式生物子代数多能够光周期诱发产卵体外受精，胚体透明，胚胎发育快能够诱发产生突变种能够分子生物技术控制特定基因表现或产生基因转殖鱼在胚胎发育时期讯号传递路径和哺乳动物有很高同源性斑马鱼的性腺发育第24页分辨斑马鱼雌雄

公鱼：与性成熟前体态相同，保持原本流线型，臀鳍较母鱼长。在身上各个鱼鳍末端，时常可看到有显著黄色出现。母鱼：性成熟后肚子开始膨大，里面卵囊形成卵，臀鳍较公鱼来得小、短且较圆，鱼鳍末端有时也有黄色出现，但相对于公鱼出现时间比较少。斑马鱼的性腺发育第25页斑马鱼的性腺发育第26页步骤一、布置环境※光周期调控：斑马鱼需要在约14:10光照周期下，才会产生交配产卵行为。※水温：需在24~28.5℃。在适当水温下，将公鱼和母鱼分缸进行喂养约5-7天后，即可在光周期天亮后1小时内，看到斑马鱼进行交配行为。斑马鱼的性腺发育第27页步骤二、交配前准备产卵前一天准备：挑选出适当公鱼跟母鱼，体长要尽可能一样，母鱼能够略大一些。将公鱼与母鱼分别放置产卵缸两侧，中间设置隔板将其隔开。产卵房准备斑马鱼的性腺发育第28页放入隔板及斑馬魚上盒與普通下盒組裝上盒底以網狀材料代替产卵房准备防止刚产出鱼卵被成鱼吃掉，而有特殊设计！1234斑马鱼的性腺发育第29页步骤三、交配当日光周期控制隔天清晨，当日亮后约十分钟，公鱼和母鱼会恢复清醒。当母鱼发觉公鱼时，因为前一天费洛蒙影响，母鱼在天亮后也释放另一个费洛蒙，使公鱼往母鱼方向前往行为愈加显著及强烈。此时就能够准备打开隔板，让公鱼跟母鱼进行交配。斑马鱼的性腺发育第30页交配中公鱼在交配过程中，采绝对主动方式，会先以眼睛观察并决定要向哪一只母鱼进行攻势。其次会进行求偶舞蹈，在想要交配母鱼周围绕圈圈或是８字型，游向母鱼后，利用腹部侧面摩擦母鱼，刺激母鱼排卵，公鱼便会同时射精。斑马鱼的性腺发育第31页产卵母鱼会一次把全部腹中卵包含卵囊全部排出，一胎聚会生出200-500颗卵。排出后母鱼会重新产生新卵，约3-5天就能够再生下一次卵。伴伴随卵释放，会有其它激素一起排出，这种激素能够让母鱼顺利把卵排放出来，另外一个功效则是让其它还产生卵母鱼，停顿排卵行为，这在演化上算是一个竞争结果。斑马鱼的性腺发育第32页注意事项（1）母鱼体内卵，假如太长时间没有交配，或是没有完全排完，卵会留在体内，并不会重新被吸收回去，假如超出太久没有排卵，母鱼腹部中卵会死亡，而且造成母鱼腹部类似囊肿残留物，这种囊肿会让母鱼下次排卵不顺，甚至无法排卵而被公鱼激烈追求之后而难产死亡，当前也没有很好方式改进这种情况。普通认为，固定一段时间就让公鱼跟母鱼进行交配，让母鱼把卵排出，是很好方式。斑马鱼的性腺发育第33页注意事项（2）斑马鱼卵在受精后，约72小时即可孵化，在这段期间内，不需要给予打气，只要放在洁净水中即可孵化。放在解剖显微镜下，即可清楚看到斑马鱼胚胎发育整个经过。斑马鱼的性腺发育第34页人工受精将鱼放入冰水中，直至不太活动为止。统计鱼体长、体重雌鱼：轻压腹部，卵子流出。搜集到小培养皿中。雄鱼：同雌鱼。加1mlD-hanks液稀释。将稀释精子加入卵子中。斑马鱼的性腺发育第35页斑马鱼卵巢取得发育成熟且腹部膨大雌性斑马鱼体表用75％酒精消毒，用眼科剪小心剪开腹部后，快速用眼科镊取白色半透明两侧卵巢置于已除菌清洗液D-Hank溶液中斑马鱼的性腺发育第36页卵细胞分离用D-Hank’s溶液洗去卵巢周围附带脂肪、结缔组织及血块等杂质。将个别卵巢置于一装有新鲜D-Hank’s溶液培养皿中，用眼科镊小心撕开卵巢外膜并轻轻抖动，同时用另一眼科镊将卵细胞从结缔组织中剥离。此种卵母细胞外被滤泡膜。当卵细胞基础从卵巢中分散出来后，选出滤泡膜完整卵母细胞，用移液管轻轻吹打卵细胞5-10次至卵细胞单个分离。用D-Hank’S溶液洗涤分离好卵细胞2-3次。斑马鱼的性腺发育第37页卵细胞培养取20-30个卵细胞于直径35mm无菌培养皿中，加人3ml培养液，封口，于培养箱内27℃、饱和湿度条件下成熟培养18h。卵细胞直径0.65mm或以上培养液为

90%LeibovitzL-15，pH9培养液中添加定量FSH（0、0.1、0.5、1、2、5μg/ml）斑马鱼的性腺发育第38页成熟判定卵母细胞成熟是一个包含细胞核、细胞质、细胞膜、透明带等多方面在内复杂生物学过程。在形态上表现为生发泡破裂，核仁消失，纺锤体形成，染色质浓缩为染色体，第一极体排出，卵丘、颗粒细胞扩散、膨胀和透明带软化等。本试验以生发泡破裂即细胞核消失判定卵细胞成熟。在添加TB（终浓度0.2%）培养液中25度10分钟染色后观察。将培养后卵细胞置于透明液(clearingsolution)中固定，在倒置显微镜下观察。无细胞核卵细胞既是已发生生发泡破裂(GVBD)成熟卵细胞。斑马鱼的性腺发育第39页卵母细胞完整性观察

解剖镜下对用两种方法取得斑马鱼卵母细胞进行形态学观察斑马鱼的性腺发育第40页细胞存活率测定取同一条鱼两侧卵巢，解剖镜下，对培养前和18小时培养后成活卵细胞进行计数，以其与培养细胞总数之比作为存活率。斑马鱼的性腺发育第41页细胞成熟率测定取同一条鱼两侧卵巢，随机选出5个细胞用固定液固定，解剖镜下检测，若成熟细胞≤1个，即所获卵母细胞处于第Ⅳ期，则将分离得到此批卵细胞分装培养。18小时后，将卵母细胞固定后在解剖镜下观察，依据细胞核有没有计数成熟卵母细胞个数，以其与卵母细胞总数之比作为成熟率(GVBD％)。斑马鱼的性腺发育第42页斑马鱼的性腺发育第43页细胞生长曲线绘制将分离得到卵母细胞培养于无菌培养ⅢL中，从0d时起，每隔两小时从培养皿中取一定数目标卵母细胞，用固定液固定后，解剖镜下检测，依据细胞核有没有判断卵母细胞成熟，分别计数细胞总数和成熟卵母细胞数。以培养时间为横坐标，卵母细胞成熟率(GVBD％)为纵坐标，绘制生长曲线。斑马鱼的性腺发育第44页成熟卵受精卵母细胞在发生GVBD后每隔0.5h取数粒卵子，置Hanks液内，用两把尖镊小心剥去滤泡膜，并移入冷开水中，取精子加到卵子旁使二者混合，此时作为受精开始时间。3mim后将卵取出放在Holtfreter液中，于25℃继续培养。定时观察受精卵发育并作摄影统计。以发育到囊胚为受精标志，统计受精率。斑马鱼的性腺发育第45页斑马鱼的性腺发育第46页Holt缓冲液NaCl 3.5g/LKCl 0.05g/LCaCl2 0.1g/LNaHCO3 0.025g/L斑马鱼的性腺发育第47页清洗液D-Hank溶液(加入100unit/mL青霉素和链霉素)培养液:90%LeibovitzL-15(加入100unit/mL青霉素和链霉素)透明液(clearingsolution):酒精(6):乙酸(1):多聚甲醛（3）斑马鱼的性腺发育第48页Leibovitz'sMediumspecificallydesignedtogrowcellsinaCO2freeatmosphere.Thestandardsodiumbicarbonate/CO2bufferingsystemisreplacedbycombinationoffreebasicaminoacids,phosphatebuffersandhigherlevelsofgalactoseandsodiumpyruvate.Asaresult,themediumdoesnotrequiresupplementationwithsodiumbicarbonateandcanbeusedunderconditionsoffreegaseousexchangewiththeatmosphere.ThemediumcanbeusedtogrowhumantumorcellsandembryoniccellsandalsoestablishedcelllineslikeHeLaandHep-2.