里氏木霉染色体dna提取方法的比较研究

里氏木霉染色体dna提取方法的比较研究

李家木霉是一种防腐性菌(。11.1病毒基因工程菌1.2ph值的测定斜面保藏培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,加水定容到1L,pH值自然。种子培养基:葡萄糖10g,蛋白胨3.0g,(NH1.3实验方法1.3.1培训方法斜面培养:28℃培养5d。菌体培养:250mL三角瓶装入种子培养基50mL,接菌悬液(101.3.2提取方法1.3.2.-异戊醇法样品质将在-70℃冷冻的菌丝体取出,充分研磨至粉状。加入5mL,65℃,CTAB提取液,65℃水浴1h,不时颠倒混匀。8000r/min离心10min,取上清液加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),轻轻混匀10min使其成为乳浊液。10000r/min离心10min,取上清液,重复用氯仿和异戊醇抽提直至上下液层间无变性蛋白出现为止。加入2/3体积预冷的异丙醇在-20℃下沉淀30min。10000r/min离心10min,弃上清液。沉淀用70%乙醇洗涤两次。让其自然风干,用适量的1×TEbuffer溶解沉淀。1.3.2.异丙醇溶液的制备向装有菌体的离心管内加入5mLDNA提取液,剧烈震荡使其摇匀,再加入1mL10%SDS和3mL氯化苄原液,剧烈震荡使其混匀。50℃水浴中保温1h,每隔10min震荡混匀1次。加入3mL3moL/L的醋酸钠(pH5.2),放入冷水中15min。在室温下4000r/min离心20min,取上清液加入等体积的异丙醇,室温沉淀20min。在4℃下10000r/min离心10min。将沉淀用70%乙醇洗涤两次。让其自然风干,1×TEbuffer1mL溶解沉淀。1.3.2.3.冷冻研磨sds法该方法除了破膜时加入SDS缓冲液代替CTAB提取液外,其余操作同冷冻研磨CTAB法。1.3.3电泳缓冲液制备用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的质量。TAE为电泳缓冲液,电压100v(每cm为5v),电泳1-2h,取胶,EB染色,在紫外光下照相记录。1.3.4pcr反应条件加PCRMaster25μL,上、下游引物各1μL,Mg1.4dna提取、缓冲液、相对于u3000e-u-l-sds的水文景观提取CTAB提取液:向30mL水中加入4.09gNaCl,1gCTAB,5mLTris-HCl(1moL/L),2mlEDTA(pH8.0),加水定容至50mL。DNA提取液:100mmol/L的Tris-HCl,40mmol/L的EDTA(pH9.0),2%SDS。SDS缓冲液:100mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0,1%SDS。PCR即用试剂盒和上、下游引物均由上海生工提供。22.1氯化苄破膜和沉淀DNA提取方法的不同主要是采用破壁和破膜的方法不同。破壁的方法有:冷冻研磨、酶解和氯化苄法。酶解是用溶菌酶和纤维素酶去壁得原生质体;氯化苄法是利用氯化苄在碱性条件下可与细胞壁中的多糖成分发生反应,从而破坏细胞壁结构。冷冻研磨是将菌体用液氮或低温冷冻后,充分研磨成细粉而破坏菌体的细胞壁。破膜的方法一般是加入SDS裂解细胞膜,同时SDS还有使核蛋白解离,蛋白质变性的作用。利用非离子型去污剂CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)也能够裂解细胞膜,释放DNA,同时在一定的盐浓度下,它可以沉淀色素和多糖。在植物组织DNA的制备中常用CTAB法通过表1可以看出在同等菌体量下,OD2.2冷研磨cta法的最佳条件的确定2.2.1rnase酶提取从图1中可以看出,电泳条带前沿发亮,这是由于RNA的存在。采用两种方法加入RNase酶去除RNA。一种为在CTAB提取液中加入RNase酶,65℃,提取30min后降温到RNase酶的最适温度37℃,作用30min;另一种将RNase酶加到TE缓冲液中,对提取后的DNA37℃,作用1h。比较两种方法的效果,结果可从图2中看出。前一种方法将RNA去除完全,条带前沿不再有RNA的亮带,得到了更纯的DNA。2.2.2乙醇沉淀实验结果本实验获得DNA的方法分别采用异丙醇和乙醇沉淀的方法,实验结果如表2和图3所示。乙醇沉淀的DNA出现了降解,而异丙醇沉淀效果好。用异丙醇沉淀的DNAOD2.3t-pacdna的遗传扩增为了检验提取的基因工程菌株里氏木霉染色体DNA中外源基因t-PAcDNA的情况,以其为摸板,根据t-PAcDNA两端碱基的排列顺序,设计了引物,进行t-PAcDNA中r-PA基因的扩增,结果如图4所示:扩增出了与设想大小一致的DNA单一条带,说明用本实验冷冻研磨CTAB法提取的DNA完全适用于PCR和其