海南产守宫木安全性评价

海南产守宫木安全性评价

sauropusandroginov（l）merr，sa），又名大戟科天青香、木冬、木条、越南、泰国枸杞、，在中国东南部和东南亚拥有悠久的食物历史。郭巨先等曾对小鼠的实验研究表明守宫木可能有一定蓄积毒性,不适宜作为蔬菜长期日常食用,这项研究结果的公布引起媒体、市民和商家的极大反响。其实早在1994年～1995年间,台湾地区连续发生阻塞性细支气管炎的流行和爆发,多项人群流行病学的研究证实病因可能与生吃一种减肥蔬菜——守宫木有关,2005年日本学者也发表了类似病例报道。但至今关于守宫木引起阻塞性细支气管炎的病理机制仍然不明了,动物实验研究的报道也是众说纷纭。为全面系统地评估守宫木的食用安全性,本项目组采集我国海南产守宫木鲜样,采取统一的前处理提取方法,对其细胞毒性、遗传毒性、亚急性和亚慢性毒性、免疫毒性等进行系统研究和分析。本研究从小鼠脾淋巴细胞增殖能力、细胞因子分泌功能和腹腔巨噬细胞的吞噬功能的角度,分析守宫木对免疫系统的影响和可能机制。1材料和方法1.1样品与饲料的制备守宫木(Sauropusandrogynus(L)Merr,SA)于早春二月采自海南省五指山县,经华南师范大学生命科学学院高峰教授鉴定。守宫木嫩芽160g,加纯水240ml低温研磨,低温超声破碎,过滤,低温真空浓缩得50ml提取液,回收率为86.75%,1ml提取液相当于3.2g守宫木鲜样,0.22μ滤膜除菌后,用RPMI1640培养基分别稀释成25,50,100,200,400,800和1600mg/ml浓度的受试样品备用。SPF级BALB/C雌性小鼠,6～8周龄,体重18～22g。由南方医科大学实验动物中心提供。合格证号:SCXK(粤)2006-0015,质量合格证编号:0040118。颗粒饲料由南方医科大学实验动物中心提供。动物实验室:SPF级,使用许可证号:SYXK(粤)2003-0011,室温(22±2)℃;湿度50%～75%。小鼠Th1/Th2(IL-2,IL-4,IL-5,TNF,IFN-γ)CBA试剂盒(Cat:551287)和流式细胞仪(FACSCalibur)为美国BectonDickinson公司产品;CASYDT型快速细胞分析仪为德国SCH?RFESYSTEM公司产品;RPMI1640培养液为美国GIBCO公司产品(Cat:C22400);伴刀豆球蛋白A(ConA)为美国WorthingtonBiochemical公司产品(Cat:50K904J);脂多糖(LPS)为美国Sigma公司产品。1.2th1/th2的诱导诱导表达无菌取10只小鼠脾分别制备成单细胞悬液,用CASYDT型快速细胞分析仪计数活淋巴细胞数,调整细胞浓度为6×106/ml,然后将各细胞悬液分至2块96孔培养板中,其中一板进行ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应,另一板进行LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应,守宫木提取物终浓度分别为10、20、40、80、160和320mg/ml,ConA和LPS终浓度分别为5和1μg/ml,置体积分数为5%的CO2,37℃培养72h后,收集ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应孔培养上清,755g4℃离心5min后取上清,使培养上清中所含Th1/Th2细胞因子浓度进入标准曲线浓度范围。取连续倍比稀释的标准品和待测样品,按照CBA试剂盒说明书完成样品孵育步骤并对流式细胞仪进行设置,然后用流式细胞仪和CBA分析软件获取数据并分析。1.3小鼠细胞中的小球物理细胞的制备参照本实验室所建立的流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的方法,小鼠腹腔巨噬细胞收集及荧光微球前处理方法见文献,收集6只BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞各2ml,细胞浓度为4～6×105/ml,分至8孔,与调理后的荧光微球分别与终浓度为0、5、10、20、40、80、160和320mg/ml的守宫木提取物37℃避光孵育2h,冷PBS洗涤1次后,70μm过滤器过滤后上流式细胞仪分析吞噬比例(PP)和吞噬指数(PI)。1.4数据分析和相关性分析实验数据经SPSS10.0统计软件包处理并分别进行非参数Mann-Whitney检验(淋巴细胞增殖功能和细胞因子含量比较)、单因素LSD方差分析(巨噬细胞吞噬功能比较)和Pearson相关性检验(相关性分析)。2结果2.1组小鼠红细胞增殖能力小鼠脾淋巴细胞在体外与守宫木提取物和ConA或LPS共培养72h后,10～320mg/ml剂量组淋巴细胞增殖能力均明显低于ConA单独培养对照组,剂量-反应关系明显,差异有统计学意义(P<0.01,图1)。2.2tfn-表达小鼠脾淋巴细胞在ConA刺激作用下培养72h后,Th1细胞因子表达水平均明显高于Th2细胞因子,尤其是TNF和IFN-γ表达较高,Th2细胞因子均低于2.5pg/ml检出限。与对照组比较,10～320mg/ml剂量组守宫木提取物对TNF和IFN-γ细胞因子的分泌均有明显抑制作用,10～20mg/ml剂量组守宫木提取物可刺激IL-2表达增加,而40～320mg/ml剂量组IL-2表达又降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01,表1)。2.3tnf、ifn-表达水平与tnf、ifn-表达的相关性ConA和LPS诱导小鼠脾淋巴细胞增殖功能呈正相关,两者均与TNF、IFN-γ表达水平呈正相关,而TNF与IFN-γ表达水平也呈正相关(P<0.01,表2)。2.4两组pi的比较20～160mg/ml剂量组(PP)和10～320mg/ml剂量组(PI)均较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01,图2)。3守宫木细胞毒性Lai等曾对守宫木能否引起SD大鼠发生阻塞性细支气管炎进行了研究,结果表明守宫木不会引发SD大鼠的肺部损伤。Chang等进行的病理研究中认为淋巴细胞尤其是T细胞介导的免疫反应在守宫木诱发的阻塞性细支气管炎发生发展过程中发挥重要的作用。基于以上实验结果,本研究选择BALB/C小鼠作为实验动物,分析了守宫木对其脾T、B淋巴细胞体外增殖功能、细胞因子分泌功能和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响,淋巴细胞功能分析结果表明:10～320mg/ml的守宫木提取物对ConA和LPS诱导的T和B淋巴细胞增殖功能、TNF和IFN-γ的分泌均有抑制作用,且两两均呈正相关关系,剂量-反应关系明显,说明守宫木体外能显著抑制淋巴细胞的增殖和活化,剂量越高抑制作用越明显。但有趣的是IL-2的分泌和表达结果,低剂量的守宫木提取物(10～20mg/ml)能刺激IL-2的分泌,而相对高剂量的守宫木提取物(40～320mg/ml)却表现为明显抑制作用,说明20～40mg/ml似乎是影响IL-2表达的转折点,这种IL-2刺激性的升高表达是否与Th1细胞因子的内部平衡状态有关值得关注,是否可以认为20～40mg/ml剂量是守宫木对小鼠脾淋巴细胞的相对刺激剂量范围。本项目组前期研究结果也发现20和40mg/ml剂量组反应很特殊,染毒24h时未观察到细胞数量、形态与对照组有明显差别,但在染毒48和72h时就会明显地发现这2个剂量组的细胞数量特别多、细胞边界不清楚、层次模糊和形态变异较大。后续研究需要重点对20～40mg/ml剂量间的免疫反应表现进一步深入探讨。相比淋巴细胞的反应,守宫木对小鼠腹腔巨噬细胞的刺激剂量范围似乎更宽,具体表现为:10～320mg/ml剂量范围的守宫木提取物均能提高腹腔巨噬细胞对荧光微球的PI,但320mg/ml剂量开始呈现下降趋势,巨噬细胞吞噬功能是机体防御外界损伤的第一道防线,相对低剂量守宫木能刺激其吞噬功能是否代表机体的一种自我保护能力和代偿反应,也值得进一步的探讨和分析。本研究结果表明巨噬细胞