发酵私曲中一个毛霉蛋白酶的分离纯化及水解特性研究

发酵私曲中一个毛霉蛋白酶的分离纯化及水解特性研究

毛霉菌是植物发酵和阐明的主要细菌之一。它的主要作用是以多媒体形式存在的，具有很高的脱水水平，并从含有各种生理活性的多媒体产品中分离出许多独特的酋长。对许多腐败产品的感官分析还表明，腐败产品通常不具有一般蛋白水分解的独特味道。如上所述，毛霉酶对解决植物蛋白（尤其是大豆蛋白）的低水分解和产物的强烈苦味方面具有很大的潜力。毛霉虽然在工业生产中有很悠久的应用历史,但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未完全展开.仅有少数学者对该菌种的发酵产酶特性以及粗酶的催化、水解特性进行过探讨.然而,毛霉长期受到高蛋白环境条件的驯化,通常具有合成及分泌多种胞外蛋白酶的能力,其胞外的蛋白酶系是由多种蛋白酶所构成的复杂体系,因此,单纯从总体上(即粗酶的研究)并不能完全了解其内在的特性.为了更加全面地了解这一蛋白酶系的组分构成、各组分的催化特性以及相互之间的作用,笔者开展了这方面的研究工作.1材料和方法1.1蛋白质及氨基酸雅致放射毛霉ActinomucorelegansAS3.2778为华南理工大学分子生物学实验室保藏菌种.二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖、羧甲基(CM)-葡聚糖、苯基-葡聚糖、葡聚糖6B购自Pharmacia公司;Alcalase及Protamex蛋白酶购自NovoNordisk公司;木瓜蛋白酶购自MERCK公司;大豆分离蛋白(SPI,蛋白质量分数为87.35%)购自哈尔滨高科大豆食品有限公司;其他试剂均为分析纯或生化试剂.1.2实验方法1.2.1蛋白峰的提取(1)粗酶的提取.称取一定量的干麸曲加入10倍于其质量的0.3mol/L的氯化钠溶液,混匀后于40℃水浴中抽提1.5h,纱布过滤后在4℃以7000g离心10min,取上清液即得到粗酶液.(2)硫酸铵分段盐析.取一定体积的粗酶液,在冰水浴中缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为40%,充分溶解后在4℃冰箱中静置4h,于4℃、12000g离心20min,取上清液继续加入固体硫酸铵至饱和度为85%,4℃冰箱中静置过夜,然后于4℃、12000g离心20min,蛋白沉淀用0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl缓冲液溶解,并透析脱盐.(3)DEAE-葡聚糖阴离子交换.用0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-葡聚糖阴离子交换柱,取一定量盐析脱盐后的酶液,加样于阴离子交换柱.用平衡缓冲液充分洗柱,然后混合A液(0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl缓冲液)和B液(0.5mol/LNaCl溶液,即NaCl溶于0.02mol/L、pH=7.5的Tris-HCl缓冲液)进行梯度洗脱,收集穿透蛋白峰.用超滤离心管浓缩收集液并用0.05mol/L、pH=5.0的醋酸缓冲液调节其pH值至5.0.(4)CM-葡聚糖阳离子交换.用0.05mol/L、pH值为5.0的醋酸缓冲液平衡CM-葡聚糖阳离子交换柱,取上一步的浓缩酶液加样于阳离子交换柱.用平衡缓冲液充分洗柱,然后用A液(0.05mol/L、pH值为5.0的醋酸缓冲液)和B液(0.5mol/L的NaCl溶液,NaCl溶于0.05mol/L、pH值为5.0的醋酸缓冲液制得)混和进行梯度洗脱.收集第一洗脱峰(即目标蛋白峰),用超滤离心管浓缩收集的酶液.(5)苯基-葡聚糖疏水层析.用1.2mol/L的硫酸铵溶液(硫酸铵溶于0.05mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液)平衡苯基-葡聚糖疏水层析柱.上一步的浓缩酶液与2.4mol/L硫酸铵溶液(硫酸铵溶于0.1mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液)等体积混和后加样于苯基-葡聚糖疏水层析柱,用平衡缓冲液充分冲洗疏水柱,然后用A液(0.05mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液)和B液(1.2mol/L的硫酸铵溶液,即硫酸铵溶于0.05mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液)混和进行梯度洗脱.收集梯度洗脱的第二蛋白峰,即为目标蛋白峰.用超滤离心管浓缩收集的酶液.(6)葡聚糖6B凝胶过滤层析.用0.02mol/L、pH=7.5的磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖6B凝胶柱,将上述浓缩酶液加样于凝胶柱,用0.02mol/L、pH=7.5的磷酸盐缓冲液洗脱.收集主要蛋白峰即为目标蛋白,用超滤离心管浓缩收集样品即得纯化酶液.1.2.2e电泳分析利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)检测了纯化后的蛋白酶纯度,并通过还原及非还原电泳的比较,确定该蛋白酶的亚基组成.电泳分析采用了Laemmli方法,分离胶的质量分数为14%,浓缩胶的质量分数为5%.1.2.3大豆蛋白水解度的测定以大豆蛋白为底物,考察了纯化的毛霉蛋白酶对大豆蛋白的水解效果,并探讨了相关因素对水解过程的影响.(1)水解试验.用0.05mol/L、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液配制5%的大豆分离蛋白,在沸水浴中热处理15min.冷却后按酶活与底物比5.0U/g(1U=16.67nmol/s)加入蛋白酶,然后置于50℃水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化.(2)pH值对水解的影响.分别在pH值为6.0、8.0、10.0的条件下进行水解试验,探讨毛霉蛋白酶在不同pH条件下对大豆蛋白的水解情况.(3)温度对水解的影响.分别在45、55、65℃的条件下进行水解试验,考察毛霉蛋白酶在不同温度下对大豆蛋白的水解情况.(4)加酶量对水解的影响.分别以酶活和底物比为2.5、5.0、7.5U/g加入不同量的蛋白酶进行酶解,考察了加酶量对大豆蛋白水解的影响.(5)不同蛋白酶对大豆蛋白的水解.比较了纯化的毛霉蛋白酶、粗酶液、木瓜蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶及Protamex复合蛋白酶对大豆蛋白水解效率的差异.在pH值为8.0、50℃的条件下,以酪蛋白为底物统一校准以上几种蛋白酶的酶活单位,然后按照标准水解试验的方法进行水解实验,水解5h后测定大豆蛋白的水解度.1.2.4游离氨基测定水解度的测定采用甲醛滴定法.取5mL水解样品,加入60mL蒸馏水,用0.1000mol/LNaOH标准溶液调节pH值到8.2,加入20mL己中和的甲醛,然后用0.1000mol/LNaOH标准溶液滴定到pH值为9.2,记录消耗的NaOH溶液的体积V1.用蒸馏水代替样品,操作方法相同,测得空白对照体积V0.设样品中游离氨基的量为C,样品水解度为D,则式中:ρ为样品中蛋白质量浓度,g/L;0.1000为NaOH溶液的浓度,mol/L;5为水解样品的体积,mL;0.33是大豆蛋白中游离氨基浓度,mmol/g;7.8为每克大豆蛋白的肽键当量数,mmol/g;1000为用于单位换算的量.1.2.5酪氨酸酶活测定蛋白质浓度和蛋白酶酶活测定分别采用Bradford法和Folin酚法.在1.5mL离心管中加入0.3mL适当稀释的酶液及0.3mL1.5%的酪蛋白溶液(酪蛋白溶于0.02mol/L,pH值为9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中),40℃反应10min,再加0.6mL0.4mol/L的三氯乙酸终止反应,静置15min后于14000g离心10min,取上清液0.6mL,加入3mL0.4mol/L的碳酸钠溶液及0.6mL福林酚试剂,于40℃显色20min,在680nm处测其吸光度D(680),根据标准曲线计算酶活.酶活定义:实验条件下,每分钟水解酪蛋白释放1μmol当量酪氨酸所需的酶量定义为1个活力单位,即1U.1.2.6胶片电泳酶谱检测参考OlafTill的方法.采用非热变性的SDS电泳,其分离胶质量分数为10%(其中添加0.1%的牛血清白蛋白作为底物),浓缩胶质量分数为5%.样品与上样缓冲液混和后直接点样于各泳道,在冰水浴中进行电泳.电泳结束后用2.5%Triton-X100(溶于0.05mol/L、pH值为9.5的甘氨酸-NaOH缓冲液制得)浸洗胶片两次,每次20min,然后用0.05mol/L、pH值为9.5的甘氨酸-NaOH缓冲液多次清洗,置于0.05mol/L、pH值为9.5的甘氨酸-NaOH缓冲液中于40℃酶解过夜.用考马斯亮蓝染色的方法对酶解后的胶片进行染色及脱色.2结果与分析2.1电泳分离和纯化蛋白酶纯化结合多种层析方法对毛霉蛋白酶组分进行纯化.首先,采用阴离子交换的方法对毛霉粗酶液中蛋白酶组分进行分组分离(见图1),使其中的碱性蛋白酶组分主要分布于穿透峰中,而其它蛋白酶组分及杂蛋白则被树脂所吸附;随后,利用CM-葡聚糖阳离子交换柱对穿透峰中的蛋白质进行进一步的分组分离(见图2),通过优化洗脱方法使蛋白酶组分与绝大多数的杂蛋白分离开;然后,利用目标蛋白与杂蛋白疏水性的不同,采用疏水层析柱对上一步收集的样品进行进一步的分离(见图3);最后利用目标蛋白与杂蛋白相对分子质量的差异做进一步纯化(见图4),并同时达到对样品脱盐的目的.采用SDS电泳的方法对纯化后样品的纯度进行分析(见图5)显示,纯化后的蛋白酶在SDS中仅显示出单一条带,说明该蛋白酶组分已经达到电泳纯;电泳还发现在还原及非还原条件下纯化的毛霉蛋白酶均显示出单一条带,这说明纯化的毛霉蛋白酶是一单体蛋白,其相对分子质量大约为32000.表1中的纯化过程及结果显示,经过以上多步的纯化操作,毛霉蛋白酶的纯度提高了22.7倍,其最终比酶活为30.47U/mg,酶活回收率为16.10%.2.2粗酶及纯化蛋白酶的组分分析酶谱是一种将电泳分离与在位酶活检测相结合起来的检测方法.它在检测及分析明胶酶、金属蛋白酶、果胶酶、脂肪酶等水解酶方面有着广泛的应用.本研究中,采用酶谱的方法分析了粗酶及纯化蛋白酶的组分.由图6可以看出,原粗酶液在电泳胶片上可以清晰地显示出3个不同的水解条带,而纯化后的酶液仅显示出其中的一条,由此说明在原粗酶中至少存在有3个不同的蛋白酶组分,纯化的蛋白酶仅为其中的组分之一.此外,从电泳胶片上水解条带的亮度及粗细程度不难看出,原粗酶液中3个组分的含量及活性水平存在很大差异,被分离纯化出的蛋白酶是其中的主要组分,另两个组分的含量相对较低.2.3酸性蛋白酶.图7的结果显示,纯化的毛霉蛋白酶在碱性条件下(pH值为8.0～10.0)对大豆蛋白表现出相对较强的水解能力,说明该酶是一种碱性蛋白酶.以大豆蛋白为底物,其合适的催化pH值在10.0左右.在pH值为6.0的条件下,该蛋白酶显示出很弱的水解能力,说明该蛋白酶在pH值为6.0时的活性很低.而腐乳酿造过程中,其蛋白水解反应通常是在pH=5.5～6.5的条件下进行的.由此可见,纯化的蛋白酶在腐乳酿造过程中并不是起主要作用的组分,这也说明了在毛霉胞外还有其它对腐乳酿造起重要作用的蛋白酶组分存在.2.4蛋白质的纯化分别于45、55、65℃的条件下进行大豆蛋白的水解试验,水解曲线如图8所示.在不同的温度下大豆蛋白的水解呈现出不同的变化趋势.在55℃的条件下,纯化的毛霉蛋白酶对大豆蛋白具有最高的水解活性,催化活性最强;在65℃的条件下,大豆蛋白的水解度在前30min增加迅速,而后几乎是维持不变,说明该蛋白酶在65℃也具有相当强的活性,但在这一温度下极不稳定,很快就变性失活.2.5酶活对大豆蛋白水解度的影响如图9所示,纯化的毛霉蛋白酶的添加量对其水解大豆蛋白具有很显著的影响,加酶量为2.5U/g时,大豆蛋白的最大水解度为8.25%;当加酶量增加到7.5U/g时,大豆蛋白的水解度可以达到17.23%.在本实验中大豆蛋白水解度随酶活的增加量远高于其它已报道的蛋白酶,如Alcalase、Protamex等.从大豆蛋白的水解过程来看,特定蛋白酶对大豆蛋白的最大水解度是一确定值,这主要是由该蛋白酶在大豆蛋白肽链上的切割位点所决定的;通常情况下进行的水解反应均不能达到这一最大水解度,其原因主要是由于水解过程中生成的小肽对蛋白酶有竞争抑制作用.一般来说,当蛋白酶的用量增加时,底物蛋白的水解度往往会有一定程度的增加,而增加程度的大小则主要依赖于可被作用底物的浓度,即底物肽链上可被切割位点的总量.由此可知:与其它蛋白酶相比,纯化的毛霉蛋白酶具有更为广泛的肽键选择性,在大豆蛋白肽链上具有相对较多的切割位点.2.6不同蛋白酶的肽键选择性对复合酶的影响比较了不同蛋白酶对大豆蛋白的水解效果.实验结果发现:在测试的几种蛋白酶中,毛霉粗酶液对大豆蛋白具有最强的水解能力,在实验条件下大豆蛋白的水解度可以达到23.50%,这应该与毛霉胞外复杂的蛋白酶组成有密切的关系.众多的研究已经表明,多种蛋白酶的协同作用效果往往优于单一蛋白酶.这主要是因为不同蛋白酶的肽键选择性通常存在一定的差异,所以由它们构成的复合酶具有一定的底物互补性,在底物蛋白肽链上有更多的作用位点,表现出来的协同水解能力更强.与其它几种商品化的蛋白酶相比,纯化的毛霉蛋白酶也显示出相对较强的水解能力,在实验条件下对大豆蛋白的水解度可以达到14%左右,而Alcalase和Protamex则只能达到10%左右,木瓜蛋白酶对大豆蛋白的水解度只能达到7%左右.这一结果表明,纯化的毛霉蛋白酶对大豆蛋白具有相对较强的亲和力,在大豆蛋白肽链上具有较多的酶切位点,这进一步说明了该蛋白酶组分具有相当广泛的肽键选择性,与2.5中的结论相吻合.3其它蛋白酶本研究主要探讨了一种毛霉碱性蛋白酶组分的分离及纯化,利用多种层析相结合的方法从雅致放射毛霉AS3.2778的发酵麸曲中纯化出一种蛋白酶组分,并以大豆蛋白为底物探讨了该蛋白酶对大豆蛋白的水解效果.结果表明:该蛋白酶是一碱性蛋白酶,其作用的pH范围相对较宽,在pH值为8.0～10.0时对大豆蛋白具有较强的水