致病菌毒力基因的系统筛选方法

致病菌毒力基因的系统筛选方法微生物学教研室丛延gcong@毒力基因的定义/标准一个基因或其产物可以在致病株中查见，而在非致病株中没有（或发生突变或不表达）；在致病株中失活该基因会减低其致病力；将该基因转到非致病株中表达会提高其致病力；在致病株感染过程中，该基因会被调控表达；针对该基因产物的体液免疫或细胞免疫具有保护性作用。柯赫原则的分子版本Falkow,S.(1988)Rev.Infect.Dis.10,S274－S276Falkow,S.(2004)NatureReviewsMicrobiology2,67-72WassenaarTMetal.(2001)FEMSMicrobiolLett.201:1-7TrudyM.WassenaarandWimGaastra.Bacterialvirulence:canwedrawtheline?FEMSMicrobiolLett.2001,201:1-7毒力基因的类别病原菌有多少毒力基因?对鼠伤寒沙门菌的估测方法：转座子随机突变标准：毒力减弱1000倍结果：毒力基因比例为4%和7%（腹腔注射和灌胃）BoweFetal.AtleastfourpercentoftheSalmonellatyphimuriumgenomeisrequiredforfatalinfectionofmice.Infectionandimmunity

1998;66(7):3372-7毒力基因的数量：~200个已经确认：<20%近年发展的毒力基因筛选技术根据突变株毒力变化：转座子随机突变技术标签标记的突变技术

Signature-taggedmutagenesis（STM）根据毒力基因表达调控特点：体内诱导性启动子筛选：

差异荧光诱导技术Differentialfluorescenceinduction（DFI）体内表达技术

Invivoexpressiontechnology（IVET）转录水平：基因芯片分析翻译水平：体内诱导抗原鉴定技术

Invivo-inducedantigentechnology（IVIAT）双向电泳转座的概念细菌转座元件的类型细菌转座的机制及其遗传学效应细菌转座的应用第一节转座子随机突变技术的应用一、什么是转座？转座(transposition)是指细菌的一段可移动的DNA片段，能在细菌的染色体、质粒和噬菌体内部或之间自行移动。TransposableGeneticElement(转座因子)Transposon（转座子）Jumpinggene（跳跃基因）DonorsiteTargetsite转座特点：转座因子是基因组正常组分，以相对独立的序列结构存在于染色体、质粒或者噬菌体中。转座的发生不依赖于转座因子和靶位点之间任何的序列同源性。原核生物和真核生物均有转座因子。转座可造成遗传学效应。二、转座现象的研究Dr.BarbaraMcClintockobservedsomehigh frequencysomatic mutationsobservedapparent reversion(mutant [yellow]backtowild- type[pigmented])reversioncouldbehigh frequencyAc/DsTransposonsinMaizeDissociationtransposonpurplecolorgeneActivatortransposon

转座现象广泛存在玉米基因组的20亿个碱基对中，其中转座因子就占了一半以上转座子广泛存在于从病毒、细菌到真核的高等动植物细胞中人类基因组中转座序列在35％以上三、细菌转座元件的类别插入序列（InsertionSequence）类插入序列（IS-likeelement）复合转座子（CompositeTransposon）TnA家族转座噬菌体（Mu

Bacteriophage）（一）插入序列InsertionSequence（IS）是最简单的可移动片段，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分；是一个自主的单位，由一段编码转座酶的DNA序列和两端的反向重复序列（invertedrepeatsequence）组成；IS转座频率为10-3～10-4/世代。命名方式：

IS＋编号长度700～2000bp每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式插入序列IS1的结构（二）类插入序列IS-likeelements

结构和IS相似，但不独立存在，而是作为复合转座子两臂的组件。（三）复合转座子CompositeTransposon命名：通常以Tn加上数字表示，如Tn903。结构:1.两侧重复顺序就是IS或者类IS。

2.除转座酶基因外还有其它表型基因，如：耐药基因，使宿主具表型效应。ISISISISLISR臂中心区臂transpositionTn1681大肠杆菌热稳定毒素I基因552bpIRIRIRIR复合转座子结构示意图IS1IS1（四）TnA家族：两端为IR（Invertedrepeats）而非IS中间的编码区不仅编码抗性标志，还编码转座酶和解离酶；进行复制性转座，分为两步，分别由转座酶和解离酶完成。如：Tn3和Tn1000（五）转座噬菌体MuBacteriophage（巨型转座子）噬菌体Mu是一个特殊的噬菌体，可以感染大肠杆菌；有裂解和溶原两个生活周期；Mu前噬菌体整合到宿主染色体上的方式不是位点特异性重组，而是随机的转座机制。

随着噬菌体的复制，新的拷贝以复制转座方式随机插入到宿主菌染色体各处不同位置。四、细菌转座元件的转座机制及遗传学效应转座可被分为复制性和非复制性两大类：在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。TnA类转座主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、复合转座子等都以这种方式进行转座。

1．非复制性转座（nonreplicativetransposition）

这类转座因子直接从原位点移到靶位点，同时在供体留下产生一个双链断裂的位点，这种类型的机制只需要转座酶，这个双链断裂位点需要修复系统的识别和修复。

转座子作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。

2复制性转座（replicativetransposition）：

转座的遗传学效应：①转座引起插入突变；②转座产生新的基因（转移重组）；③转座可产生染色体畸变；④其它效应：转座引起切离效应、外显子重组等。

转座子的应用：转座子除了它本身的遗传学效应外，在许多方面是遗传学研究中的一个有用的工具。如在插入突变、作为基因转导的供体、基因定位的标记、菌株构建、基因克隆等方面都可利用转座子作为工具。五、细菌转座子的应用致突变的工具，用于研究细菌基因的功能高通量地筛选与某种特定功能有关的基因快速构建细菌完整的单基因突变株库STM法系统筛选病原菌的毒力基因应用举例1

高通量地筛选与某种特定功能有关的基因InfectionandImmunity,August2004,p.4888-4890,Vol.72,No.8

0019-9567/04/$08.00+0

DOI:10.1128/IAI.72.8.4888-4890.2004

Copyright©2004,AmericanSocietyforMicrobiology.AllRightsReserved.

BiofilmFormationInVitroandVirulenceInVivoofMutantsofKlebsiellapneumoniae

HeatherF.Lavender,JenniferR.Jagnow,andStevenClegg*

DepartmentofMicrobiology,CollegeofMedicine,UniversityofIowa,IowaCity,Iowa52242构建克雷伯菌的转座突变株库检测突变株的生物膜形成能力发现部分突变株不能形成生物膜研究路线对突变基因进行定位对突变株的体内毒力进行检测构建转座突变株库大肠杆菌

SM10(λpir)：pUTMini-Tn5(含转座子片段)KmrRifs

肺炎克雷伯菌43816

KmsRifr自杀质粒通过接合方式传递质粒发生转座双抗平板筛选肺炎克雷伯菌43816的转座突变株

1tnp:transposase转座酶2反向重复序列，Km耐药基因3oriR6K:复制起点，只能在表达π蛋白的细菌中复制。（成为自杀质粒）在大肠杆菌SM10(λpir)中复制4mobRP4:编码与接合有关的酶，使质粒通过接合方式传递给受体菌。质粒pUTMini-Tn5的构成大肠杆菌肺炎克雷伯菌K.pneumoniae:KmsRifr无转座K.pneumoniae:KmrRifr发生转座突变株＋质粒上的转座序列细菌染色体上的基因ACBACB’(基因失活)转座细菌突变株生物膜形成能力的检测

localizationofthemutationgenesP2P1P1P2TnP1P2RestrictionsiteRestrictionsiteChromosomalDNAdigestedwitharestrictionenzyme

Self-ligationandinversePCR(I-PCR)SequencingtheresultedPCRproduct反向ＰＣＲStrainSiteofTninsertionBiofilminvitroaVirulenceinvivob43816++MBM100yadH–+MHV1yciI––HFL100yhdH–+HFL101pduA–(+)c+实验发现：转座子的优点与普通诱变法如亚硝基胍诱变、紫外线照射诱变比较：诱变率较高。导致插入性单突变，不会出现化学诱变常出现的多重突变，有利于研究的准确。插入序列已知，便于对失活基因定位。

转座子的优点与基因敲除法比较：高通量；操作简单；适用于与某种功能有关的未知基因的筛选；而基因敲除则是对某一比较确定的基因进行操作（至少知道序列）。转座子随机突变技术的缺点不同细菌可能需要不同的转座子，且转座子在基因组中插入方式必须是随机的；有可能产生极效应，需要确证实验；需要合适的筛选模型，操作应简单；讨论如何寻找S.suis2型强毒株的黏附相关基因？选择转座子：Tn917Tn917随机插入诱变与血管内皮细胞进行细胞黏附实验，筛选突变株定位突变基因同源重组构建同一基因敲除株和回补实验确认

应用举例2

快速构建完整单基因突变株库

铜绿假单胞菌PA14的转座突变株库的建立PA14genomeismadeupofapproximately5,500non-essentialgenesByNicoleT.Liberati,DanG.Lee,JacintoM.VillanuevaandFrederickM.AusubelDepartmentofMolecularBiologyMassachusettsGeneralHospital两种转座子，避免插入的热区流程示意图转座获得突变株随机引物PCR扩增突变基因序列突变株库的筛选规模ThePA14TransposonInsertionMutantDatabase(/cgi-bin/pa14/mutants/retrieve.cgi)应用举例3

STM法筛选病原菌毒力基因STM(signaturetaggedmutagenesis)标签标记突