第二章 基因工程原理及其在食品工业中的应用

第二章基因工程原理及其在食品工业中的应用

第一节基因工程基础

（一）基因工程的定义1.基因（gene）DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质最小功能单位。2.基因组（geneome）一个生物体的全部基因序列。一、基因工程的定义、基本操作程序3.基因表达（geneexpression）遗传信息转录和翻译的过程。（1）转录。在DNA分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程。（2）翻译。在RNA的控制下，根据核苷酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链过程。（3）逆转录。以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程。4.重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）

利用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同的DNA进行体外切割、连接构成新的DNA分子的技术。5.基因工程（geneengineering）运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。6.食品基因工程利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏价格性状以及感官性状的技术。（二）基因工程的基本操作程序1.运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成制备目的基因。2.采用合适的方法将目的基因与合适的载体进行体外连接，构建重组DNA。3.利用合适的方法将重组DNA导入受体生物细胞以获得转化体。4.采用合适的方法筛选出重组转化体阳性克隆。5.运用合适的方法对重组转化体阳性克隆进一步分析以及操作，使目的基因在受体生物细胞中高效表达。

（三）基因工程的三大理论和三大技术基础1.三大理论基础（1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA。（2）1950年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理。（3）1960年代Crick关于遗传中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质方向进行传递。2.三大技术基础（1）如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需要的基因片段切割下来（限制性内切核酸酶）。（2）如何将获得的基因片段进行连接（DNA连接酶）。（3）如何将切割下来的基因片段进行繁殖扩增（基因载体）。二、基因工程的工具酶

工具酶：基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、连接酶等）作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶。

（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶

1.限制作用与修饰作用限制作用（restriction）：指一定类型的细菌可以通过其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的现象。修饰作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用下，生物体自身DNA分子在特定碱基的特定位置上发生甲基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解的现象。2.限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）：简称限制酶，指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。DNA甲基化酶（DNAmethylase）：简称甲基化酶，指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶。3.限制性内切核酸酶的类型（1）Ⅰ型。由三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸；切割位点距其识别位点至少1000bp；切割作用随机。Ⅰ型限制酶不宜作为基因工程的工具酶。（2）Ⅱ型。由两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；识别位点常具旋转对称性；切割位点与其识别位点重叠或在其附近；切割作用特异性强。Ⅱ型限制酶是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型。由两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；切割位点一般在距其识别位点3’端24～26bp处。Ⅲ型限制酶在基因工程中也不常用。

限制性内切核酸酶没有种属特异性，即限制性内切核酸酶识别、切割特定序列的能力同底物DNA的来源无关，它可识别、切割各种来源的DNA。

DNA甲基化酶具有种属特异性，生物体的DNA甲基化酶只修饰保护自己的DNA，而不修饰保护非己的DNA。生物体的限制性内切核酸酶不能降解自身被修饰保护的DNA，而只能降解外源的DNA。

表4-1限制性内切核酸酶的类型及主要特性

主要特性Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型

酶蛋白构成三种不同亚基两个相同亚基两种不同亚基酶活辅助因子ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+识别序列特性EcoBⅠ:TGAN8TGCTEcoKⅠ:AACN6GTGC旋转对称EcoPⅠ:AGACCEcoP15Ⅰ:CAGCAG切割位点距其特异识别位点至少1000bp处随机切割在特异切割位点上或其附近特异切割距其识别位点3’端24～26bp处特异切割4.Ⅱ型限制性内切核酸酶的切割方式在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成双链平齐末端。在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从3’端切断磷酸二酯键，形成3’-羟基端2～5个核苷酸突出单链黏性末端。在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从5’端切断磷酸二酯键，形成5’-磷酸端2～5个核苷酸突出单链黏性末端。5.影响限制性核酸内切酶活性的主要因素

（1）底物DNA制备物的纯度蛋白质、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。（2）底物DNA的甲基化程度dam甲基化酶：特异地催化DNA分子中5’GATC3’序列中的腺嘌呤N7位置的甲基化。dcm甲基化酶：催化DNA分子中5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位置的甲基化。

（3）底物DNA的结构构型环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。在用限制酶酶解同样分子质量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA所需酶量的10～20倍。（4）酶反应缓冲液的组成酶反应体系中常含MgCl2、NaCl或KCl、三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）等。Tris-HCl的作用在于使反应液的pH值稳定于酶活性所要求的最佳范围内，而后三者均有稳定酶的作用。

（5）酶反应的最适温度

大多数限制酶反应的最适温度为37℃，少数限制酶反应的最适温度高于或低于此温度。反应温度高于或低于其最适温度，酶的活力均会下降。应根据各限制酶反应的最适温度作相应调整。

6.限制酶的主要用途（1）在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切割的DNA片段。（2）建立DNA分子的限制酶图谱。

限制酶图谱（restrictionmap）:指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。

（3）构建基因文库。基因工程中，将某种生物的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的材料，称为基因文库（genelibrary）（4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。（二）DNA聚合酶

依赖于DNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）、耐热的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）等。依赖于RNA的DNA聚合酶（即逆转录酶）优先以RNA为模板，也可以DNA为模板。逆转录酶能以RNA为模板催化合成双链DNA。末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）不以DNA或RNA为模板，而只是将核苷酸加到已有DNA分子的末端。

DNA聚合酶作用的条件（1）要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA，接受模板指导，产物的性质与模板编码相同。（2）不能起始合成新的DNA链，要有引物3’-羟基的存在。（3）催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-羟基末端。（4）催化DNA合成的方向是5’→3’。

1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）一种从大肠杆菌中分离出的一条分子质量为109KDa的多肽链（球蛋白）。具有三种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②5’→3’外切核酸酶活性，从5’端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。

主要用于：①以切刻平移法标记DNA；②对DNA分子的3’突出尾进行末端标记。

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）一条分子质量为76KDa的多肽链，一般由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶水解获得，也可通过克隆技术获得。具有两种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。②3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。3.TaqDNA聚合酶最初来源于水生栖热菌（Thermusaquaticus），现可由基因工程途径来生产。分子质量为65KDa，是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。

具有一种活性：5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。主要用于：①对DNA进行测序。②通过聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。

4.逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）常用的逆转录酶有两种：一种来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条多肽链组成，分子质量为170KDa。一种来自鼠白血病病毒（MLV）逆转录酶基因的大肠杆菌，由单链多肽组成，分子质量为84KDa。具有两种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以RNA或者DNA为模板，以带3’自由羟基的RNA或DNA片段为引物。②RNA酶H活性，即5’→3’外切核糖核酸酶活性，特异地降解RNA-DNA杂交体中的RNA。逆转录酶无3’→5’外切核酸酶活性，即无校对功能，其催化的聚合反应容易出错。5.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）来源于小牛胸腺，分子质量为60KDa，是一种不需要模板的特殊的DNA聚合酶。具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羟基端。

主要用于：①给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾。②以32P标记的一种dNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3’端。

（三）连接酶、磷酸酶1.T4噬菌体DNA连接酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，分子质量为68KDa。具有一种活性：即催化DNA的5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNA、平齐末端DNA等。主要用于：①连接带匹配黏性末端的DNA分子。②使平齐末端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。

2.碱性磷酸酶来源于大肠杆菌及牛小肠。包括细菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。具磷酸酶活性，催化去除5’磷酸的反应。底物为单链或双链DNA及RNA、dNTP。主要用于：①在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA分子的5’磷酸。②去除DNA片段5’磷酸，以防自身环化。

三、基因工程的载体

载体（vector）：携带外源基因进入受体细胞的运载工具。基因工程载体的特性:（1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。（2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。（3）DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，最好是单一酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。（4）具有能够观察到的表型特征，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。

载体的报告基因（标记基因）：基因工程中利用载体上引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来，这种具有标志意义的基因称为报告基因（reportergene）或标记基因。最常用的报告基因有抗药性基因（例如，抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素等抗生素抗性基因），此外，还有氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、β-球蛋白基因和人生长激素基因等。

按照介导的作用目的，可将基因工程载体主要分为克隆载体和表达载体。

克隆载体：有一个松弛性复制系统，能使外源DNA在受体生物细胞中扩增复制。（例如，细菌质粒载体、λ噬菌体载体、柯氏质粒载体）

表达载体：有一个受体生物细胞所要求的包括启动子序列在内的调控系统，能使外源基因在受体生物细胞中进行功能表达。（例如，Ti质粒、SV40猴状病毒）按照导入的受体生物，一般可将基因工程载体分为大肠杆菌（原核细胞）载体、酵母载体、植物载体、动物载体等。（一）大肠杆菌载体

1.质粒载体质粒:指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质。质粒拷贝数（plasmidcopynumber）：一种质粒在一个细胞中存在的数目。

（1）质粒的生物学特性一般为双链的共价闭合环状DNA（cccDNA），质粒分子的长度一般为1～200kb。不同质粒的分子质量差异显著，小质粒的分子质量约为103KDa，仅能编码2～3种中等大小的蛋白质；而大质粒的分子质量可达105KDa。

（2）质粒的分类根据复制控制类型：一般可将大肠杆菌质粒分为严紧型复制控制质粒和松弛型复制控制质粒。严紧型复制控制质粒:复制与宿主染色体的复制同步，并与宿主蛋白质的合成有关，而与DNA聚合酶Ⅰ的活性无关。如果宿主蛋白质的合成终止，质粒与宿主染色体的复制也停止。每个宿主细胞中只能达到1至数个拷贝。松弛型复制控制质粒:复制与宿主染色体的复制不同步，其与DNA聚合酶Ⅰ的活性有关，而与蛋白质的合成无关。当宿主蛋白质的合成终止时，质粒仍可复制。每个宿主细胞中的质粒拷贝数可达10～200个。（3）质粒克隆载体的条件①分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上。②能插入、运载一定大小的外源基因。③在携带外源基因前后在宿主细胞内均能自主复制。④在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能。⑤分子质量小，易于操作，一般为松弛型复制控制。⑥容易控制，安全可靠。现已通过DNA重组技术构建了许多质粒克隆载体供基因工程应用，例如，pBR322、pUC系列等。

（4）质粒pBR322

组成①氨苄青霉素抗性基因（ampr）②四环素抗性基因（tetr）③DNA复制起始点（ori）

优点①分子质量小。②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。③较高的拷贝数。

（5）pUC质粒载体组成①来自pBR322的复制起始点（ori）②大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构称为lacZ’基因。③氨苄青霉素抗性基因（ampr），但其核苷酸序列有变化，不含原来内切限制酶的单位识别位点。④位于lacZ’基因中的靠近5’端的一段多克隆位点（MCS）区，但它并不破坏该基因的功能。

优点①更小的分子质量和更高的拷贝数。②适用于组织化学方法检测重组体。③有多克隆区位点。2.噬菌体载体（1）噬菌体的生物学特性不同种类的噬菌体（颗粒）在外形上差别很大。大多数噬菌体颗粒由呈20面体的头部及尾部构成，例如，λ噬菌体；还有一些噬菌体颗粒为线状体形，例如，M13。在结构上，噬菌体颗粒比质粒复杂。噬菌体颗粒的外壳是蛋白质，内部是核酸。该核酸最常见的构型是线状双链DNA，此外，还有环状双链DNA、线状单链DNA、环状单链DNA等。（2）λ噬菌体载体λ噬菌体颗粒由头与尾两部分组成。头部装载了其整个基因组λDNA。λDNA为一长度约48.5kb的线状双链DNA分子，可以分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的5’处各有12个碱基长的互补单链（从而构成黏性末端）。当λ噬菌体感染宿主细胞时，λDNA被注入宿主细胞后会迅速通过黏性末端的互补作用形成环状双链DNA分子。λ噬菌体载体的优点：①可携带较长的外源DNA片段。②重组后的DNA分子可在体外被包装成噬菌体颗粒。③重组的噬菌体容易筛选和贮存。λ噬菌体的必要基因：λDNA至少包括61个基因。其中大约半数基因参与噬菌体生命周期活动，位于其左臂和右臂，这类基因称作λ噬菌体的必要基因。λ噬菌体的非必要基因：另一部分基因在被外源基因取代后并不影响噬菌体的生命周期活动，位于其中央区，这类基因称作λ噬菌体的非必要基因。cos位点（cohesive-endsite）：由黏性末端结合形成的双链区段。

λ噬菌体载体的分类：根据插入方式，一般可将λ噬菌体载体分为插入型载体和置换型载体。插入型载体（insertionvector）：指在基因组的非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位点可供外源DNA插入，而不缺失其本身任何片段的λ噬菌体载体。由插入型载体得到的重组DNA分子都比原载体长。插入型载体可容纳的外源DNA片段相对较小，一般在10kb以内。广泛应用于cDNA以及小片段DNA的克隆。

置换型（取代型）载体（replacementvector）：指在基因组的非必要基因区内两个或两个以上的限制酶切位点间的DNA区段可被插入的外源DNA片段所置换的λ噬菌体载体。置换型载体容纳外源DNA片段大小的范围一般在9～22kb之间。

有些λ噬菌体载体兼有插入和置换两种外源DNA片段的插入方式，这具体取决于载体与外源DNA末端匹配的限制酶切位点的种类和数目等。3.柯斯质粒载体（Cosmidvector）也称黏粒载体，指一类由人工构建的含有抗性基因、单一克隆位点、λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。分子质量较小，一般为4～6kb。（1）柯斯质粒载体的组成①1个质粒复制起始区域复制子（基因组中能独立进行复制的单位）；②至少1个抗药性选择标记基因；③至少1个限制酶的单一识别切割位点；④1个λ噬菌体黏性末端片段cos位点。（2）柯斯质粒载体的特点①具有质粒载体的特性：它带有质粒的复制子，能像质粒DNA一样在宿主细胞内复制，也能在氯霉素的作用下进行扩增。带有抗生素抗性基因，有些还带有基因插入失活的克隆位点，为重组体的筛选提供了简便的标记。②具有λ噬菌体载体的特性：它在与适宜长度的外源DNA片段重组后，可在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效地转入对λ噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞。进入宿主细胞后，也能像λ噬菌体一样进行环化。③具有高容量的克隆能力：质粒载体的克隆容量一般为10kb，λ噬菌体载体的克隆容量理论极限值是23kb，一般为15kb左右，而柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。（一）基本原理在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段。在进行PCR扩增时，通常需要设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。四、多聚酶链式反应（PCR）技术将热变性后分开的两条模板链与摩尔数大大过量的两个引物共同温育复性产生的模板－引物杂交体作为作用底物，利用耐热的TaqDNA聚合酶催化延伸合成反应。在第一轮扩增完毕后，将反应混合物再加热使新构成的双链DNA变性，然后再度温育使模板链与引物复性，进入第二轮特异性合成。由于耐热的TaqDNA聚合酶在热变性步骤中不失活，可直接进入第二轮特异性合成而不需要另外补加DNA聚合酶等。PCR的每个循环包括3步（1）变性（denaturation）。通过加热至一定温度使双链DNA两链间的氢键断裂，DNA双链离解形成两条DNA单链。（2）复性（退火，annealling）。当反应体系温度突然降低时，由于模板DNA分子的结构比引物DNA分子复杂得多，而且在反应体系中引物的量大大多于模板，因此引物和与其互补的模板配对形成局部杂交双链，而变性后离解形成的两条模板DNA单链之间互补配对的机会则较少。（3）延伸（extension）。在4种脱氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的条件下，TaqDNA聚合酶以模板－引物杂交体分别为模板和引物催化DNA链沿5’→3’方向合成延伸。每个循环的扩增产物作为下一循环的模板。

2.PCR的操作体系和反应条件（1）模板。待测的核苷酸（DNA或RNA）分子；双链DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。（2）DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow