分子杂交技术(PPT)

ACGT分子杂交技术基因公司技术讲座****分子杂交****分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子（探针）的一门技术。分子杂交原理及流程图样品制备电泳杂交转膜结果显示探针制备***分子杂交分类***•SouthernBlot----DNA杂交•NorthernBlot----RNA杂交•WesternBlot----蛋白质杂交•原位杂交****样品制备****•DNA纯化•RNA纯化****探针制备****随机引物法合成高特异活性的DNA探针——NEBLot®Kit特点：*活性高：≥109dpm/ug*标记效率高：可用于5ng-2ug的模板DNA量模板量用途基因文库筛选Southern杂交Northern杂交原位杂交随机引物法双链DNA探针合成标记优化技术DECAprimeTMIIRandomPrimingDNALabelingKit优化技术：*高纯度无外切酶活性的Klenow酶提高了标记效率10分钟完成反应*改进的标记动力学增加了探针产量对低纯度及低浓度模板也能通过延长反应时间达到目的*独特的Decamer溶液提高引物-模板复合物稳定性减少引物双体形成，提高了灵敏度*标记灵活：提供dATP和dCTP两种标记缓冲液特异性单链DNA探针合成标记优化技术Prime-A-ProbeTMStrandSpecificDNAProbeSynthesisKit活性大于4×cpm/ug109合成高特异性全长RNA探针的最佳选择——MAXIscriptTM体外转录试剂盒特点：*可合成长达2kb的RNA*产量可达2-4ug/ul同位素标记可达109cpm/ug*对应不同的启动子有不同的试剂盒可供选择*同位素或非放标记均可多次洗脱反复杂交探针制备技术——Strip-EZTMSystem专门为需要在同一张膜上反复标记检测不同信号的用户设计，提供非常温和的杂交信号洗脱条件，提高膜的使用寿命达通常的三倍左右。工作原理合成探针的同时掺入经过修饰的dNTP(修饰不影响杂交特性）杂交检测后将膜浸入探针降解缓冲液中将探针降解68℃温和洗脱适用于：Northern\Southern\dot/slot及相关杂交Strip-EZTMRNA探针合成Strip-EZTMRNAProbeSynthesis&RemovalKit特点：*灵敏度高比随机引物法DNA探针灵敏10倍以上*温和洗脱，提高膜寿命*不同启动子有不同试剂盒*同位素和非放标记均可效果比较PCR法Strip-EZTMDNA探针的合成Strip-EZTMPCRStripableDNAProbeSynthesis&RemovalKit

特点：*模板多样：克隆序列、cDNA、PCR产物*不对称PCR技术，产物大多为单链DNA探针*灵敏度高，比随机引物法高3-5倍*提供除模板、标记物、Taq酶外所有合成探针及洗膜试剂，包括M13正反向及T7引物结果比较cDNAdsDNAssDNAssRNAOligonucleotidessRNAssDNAdsDNAOligonucleotideProbeType****标记类型****•放射性同位素标记：灵敏度高，成本低但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰期限制•非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）：安全，标记稳定，探针寿命较长但灵敏度较低，背景较高，成本高非放射性杂交系统BrightStarTMPsoralen-BiotinNonisotopiclabelingKit&BioDetectTMNonisotopicDetectionKit灵敏度最高的非放检测系统之一——BioDetectTMNonisotopicDetectionKit

采用的化学发光剂CDP-Star为发光最强、发光时间最长的化学发光底物之一，灵敏度与同位素相当。*曝光10-30分钟相当于32P压片1-2天*发光时间稳定持续2天，发光峰值无明显下降允许反复多次压片*背景很低Phototope®化学发光系统NEBlot®Phototope®Kit&Phototope®-StarChemiluminescentDetectionKitNorthern杂交Southern杂交Phage文库筛选菌落及质粒文库筛选用途原位杂交及检测试剂盒mRNAlocator-HybTMInSituHybridizationKitmRNAlocator-BiotinTMmRNAInSituDetectionKit6小时完成杂交RNasecure保证无RNase污染高效灵敏的NBT/BCIP-生物素探针显色检测提供对照改良的Northern杂交技术——Ambi