抗体工程研究及进展

抗体工程研究及进展一、抗体发展简史多克隆抗体

单克隆抗体

工程抗体诊断治疗多克隆抗体

灵敏度高很少用于治疗特异性差副作用大（交叉反应）少数用于被动治疗单克隆抗体特异性高只有少数用于治疗灵敏度低免疫源性（解决办法：多大量制备种单抗混合）鼠单抗局限性制备麻烦，难以大量生产。杂交瘤细胞稳定性差。HAMA的产生。半衰期短。难以制备融合蛋白。全抗体应用中的局限：分子量大，通透性差；恒定区的存在，导向特异性差。制备基因工程抗体的重要性基因工程抗体制备方便，既可以从杂交瘤细胞中获得，也可以从未经免疫的脾或外周血林巴细胞中获得可在细菌或细胞中大量生产可按人们意愿及需要构建全抗体或抗体片段（如Fab，Fv），也很容易制备赋予抗体新功能的抗体杂合蛋白对研究抗体结构功能有较大的理论研究意义在诊断和治疗等应用上有广泛的应用价值进行抗体工程的有利条件B细胞活化，抗体多样性及抗体亲和性成熟等重大理论机制的进一步阐明，为抗体工程提供了理论依据。大量抗体基因序列已测定，可以设计一套引物，通过PCR构建抗体基因库，分离抗体基因。大量与抗原结合或未结合的抗体及片断的三维结构（晶体结构）已测定，为抗体改造，如提高抗原亲和性，进行抗体人源化等提供理论依据。免疫球蛋白结构与功能关系清楚，且不同功能的结构域相互独立。生物高技术不断涌现,如噬菌体显示技术,转基因小鼠技术等.工程抗体种类根据免疫原性分类：鼠源性人源化人源性根据分子大小分类：全抗体小分子抗体根据组成成分分类：单价小分子抗体双（多）价、双特异性抗体抗体融合蛋白

*构建各种大小不同的抗体片段:scFv，(scFv’)2，Fab,F(ab’)2，miniantibody.

*增加亲和性、提高特异性。

*抗体人源化（降低免疫原性）。

*人源性抗体。

*抗体稳定性、表达水平。

*抗体融合蛋白（同位素、细胞介素、毒素、药物等）。

*催化抗体。*抗体芯片。工程抗体的应用

*构建各种大小不同的抗体片段:scFv，(scFv’)2，Fab,F(ab’)2，miniantibody.

*增加亲和性、提高特异性。

*抗体人源化（降低免疫原性）。

*人源性抗体。

*抗体稳定性、表达水平。

*抗体融合蛋白（同位素、细胞介素、毒素、药物等）。

*催化抗体。*抗体芯片。工程抗体的应用二.治疗性抗体开发现状治疗用抗体研制史上的几个重要里程碑1975:制备第一株鼠单克隆抗体1982:抗独特型抗体成功应用于治疗淋巴瘤1986:FDA批准OKT3(鼠抗体)1994:FDA批准ReoPro(嵌合抗体)1996-1999:FDA批准14种工程抗体工程抗体的应用至2000年，FDA已批准至少16种抗体在临床应用，包括应用于癌症治疗，移植排斥等多个方面，占已认证的生物制品1/5。超过79个抗体正在进行临床I和II期试验，占生物技术药物的1/3。美国临床试验的和进入市场抗体

临床试验：97/374进入市场：16/199自身免疫性疾病：104

肿瘤及其相关疾病：4710消化系统疾病：7心脏病：1感染性疾病：41神经系统疾病：5呼吸系统疾病：7皮肤病：6器官移植：31其它：3

2002年美国已批准上市的治疗性抗体名称抗体类型治疗病种及批准年生产公司OncoScint®MurineMab(B72.3)(Anti-TAG-72)结肠癌和卵巢癌1992CYTOGEN

ORTHOCLONEOKT®3MurineMAb(Anti--CD3)肾移植1991心脏及肝移植1993OrthoBiotechReoPro®AbciximabChimericMAbAntiGPIIb/IIIareceptor1994溶栓1997Centocor

ProstaScint®MurineMAb(Prostatemembranespecificantigen(PMSA))前列腺腺癌1996CYTOGEN

CEA-Scan®technetium-99m-ArcitumomabMurineFab´fragment(Anti-CEA)结肠癌1996ImmunomedicsVerluma®T99nofetumomabmerpentan

MurineMAb(Anti-small-celllungcancer)

小细胞肺癌显像1996DuPontMerck2002年美国已批准上市的治疗性抗体名称抗体类型治疗病种及批准年生产公司Rituxan®RitiximabChimericMAb(Anti-CD20)淋巴瘤1997Genentech

Zenapax®daclizumabHumanizedIgG1(Anti-IL-2R)肾移植排斥1997RocheHerceptin®TrastuzumabHumanizedMAb(Anti-HER2)乳腺癌1998GenentechRemicadeinfliximabMurineMAb(Anti-TNFalpha)Crohn’s病1998类风湿1999，2001CentocorSimulect®MurineMAb(Anti-CD25)肾移植1998NovartisPharmaceuticals2002年美国已批准上市的治疗性抗体名称抗体类型治疗病种及批准年生产公司Synagis®palivizumabHumanizedIgG1k(Anti-RSVvirus)CMV感染1998Medlmmune

Thymoglobulin®thymocyteglobulinrabbitpolyclonalantibody(Anti-lymphocytes)预防肾移植排斥1998SangStatMylotarg

HumanizedMab(Anti-CD33)急性淋巴细胞性白血病2000WyethCampath®HumanizedMab(Anti-CD52)B-CLL慢性淋巴瘤（B细胞性）2001BerlexLaboratoriesMontvilleZevalinMurineIgG1kappa(Radioactiveformulation)淋巴瘤2002IDECPParmaceuticals2003年至今FDA批准上市的抗体抗体生产公司适应症批准日期单抗Xolair,OmalizumabGenentech中度至严重的因敏感引起的哮喘，经激素治疗无效者2003.6.20LFA-3单抗LFA-3/IgG1Biogen银屑病、牛皮癣2003.1.30血浆α-1抗胰蛋白酶Antitrypsin,alpha-1AlphaTherapeutic/Baxter遗传性肺气肿2003.1.9Bexxar(抗CD20)Corixa/GlaxoSmithKline结肠癌2003Avastine（抗VEGF）Genentech非何杰森淋巴瘤2004226我国治疗性抗体研究进展（2002）名称治疗病种研究阶段研制单位OKT3肾移植上市武汉生物制品所抗IL-8抗体银屑病上市宏远逸士公司抗CEA嵌合抗体胃癌申报新药医科院肿瘤所北京制药二厂CD3嵌合抗体器官移植2001科技奖武汉生物所抗人VEGF（人源化）肿瘤2001科技奖医科院肿瘤所HAb18导向药物肝癌临床二期四医大抗FabC1027肝癌临床前医科院医生所抗已型脑炎单抗已型脑炎临床前中科院遗传所抗破伤风单抗预防破伤风临床前军科院FDA批准的部分抗体类药物2001年销售额商业名类型靶抗原适应症2001全球销售额(百万美元)ReoPro嵌合单抗GPIIb/IIIa受体PCI辅助治疗431Rituxan嵌合单抗CD20淋巴瘤/类风湿819Synagis人源化单抗RSVRSV感染516Hercepin人源化单抗HER2乳腺癌347Remicade嵌合单抗TNF-α炎症性肠病/类风湿721Campath人源化单抗CD52CLL27

三.存在问题与解决策略工程抗体面临的问题鼠抗体的免疫原性亲和力低和特异性差大量制备问题1：免疫原性HAMA半衰期短:<20h(FcRn)问题1的解决方案人源化抗体（嵌合抗体，改型抗体）人抗体抗体人源化

一、嵌合抗体：鼠可变区+人恒定区二、鼠CDRs+人框架区

三、鼠CDRs+人框架区（保留关键鼠残基）

人源化原则

1、CDR残基保持不变。2、文献报道的重要残基保持不变，包括高风险残基和维持LOOP结构的关键残基。3、三维结构模建中重要残基不变，包括模建之中的包埋残基和模建中影响CDR构型的残基。改型抗体（一）人抗体的选择

1、轻、重链来自同一人抗体

2、“bestfit”method,轻、重链来自不同人抗体，甚至抗体轻、重链各部分可来自于不同的人抗体选择依据：序列同源性，尤其是框架区序列；考虑与某一canonical结构结构相关的包埋残基；isotype

的类型及CDR构型（二）、关键鼠残基的保留1、重要鼠残基确定依据—比较canonical结构，保留与canonical结构有关的关键残基—保留包埋残基（pakingresidues）—可变区亚组（sungroup）的保守氨基酸残基—比较已知结构的抗体，确定FR中影响抗原结合的残基—框架区残基的突变实验—抗原结合位点三维结构的模建—根据晶体结构2.重要鼠残基的确定方法(1)只根据可变区的一级序列,不需同源模建

理由:抗体具有高度同源性，结构相当类似a.只保留与canonical结构有关的残基b.保留框架区起调节CDRs结构的残基

（2）序列比较和同源模建相结合a.典型方法b.可变区‘resurfasing’法人源化效果人源化抗体引起免疫反应的频率降低到12％以下半衰期延长至几天，有时接近21天（人IgG在体内的半衰期）

9个FDA批准抗体，56个正在进行临床试验的抗体嵌合抗体:52(3.5%)人源化抗体335(62.5%)鼠抗体:17(12.5%)人抗体:06其它（兔，弥猴等）:06人源性抗体的制备制备人单克隆抗体的难点

受伦理道德的限制不能免疫人。人外周血淋巴细胞中10%为未刺激的B淋巴细胞，含有大量的记忆细胞，难以和骨髓瘤细胞融合。人、鼠杂交瘤不稳定，有易失去人染色体的影响难以找到合适的骨髓瘤细胞。制备的人单抗亲和力往往较低。对于人自身抗原和免疫原性较低的抗原，制备人单抗相当困难。一、链置换法鼠重链人轻链repertoire转化筛选阳性鼠人杂合抗体阳性人抗体分离人轻链人重链repertoire库转化筛选二,人源性抗体库法天然抗体库免疫抗体库半合成抗体库全合成抗体库背景材料VCDR3VVCDR3构建大的未经免疫的抗体repertoire噬菌体显示库

43位未经免疫的人（BRL15人，tonsilB细胞4人，bonemarrow24人）PCR构建抗体repertoire库筛选高亲和性人抗体1.41010特点：1、所需时间少（二周）2、获得对自身抗原具有高亲和力的人源性抗体全套抗体repertoire库的应用

1.提高抗体的亲和性和特异性2.制备人源性抗体3.筛选抗各种抗原（包括自身抗原、肿瘤抗原等）repertoire的抗体二,人源性抗体库法天然抗体库免疫抗体库半合成抗体库全合成抗体库背景材料VCDR3VVCDR3构建合成和半合成抗体repertoire库

49VH片段CDR34-12随机突变Repertoire库26Vk片段CDR38-10aa或3个残基随机突变21V

片段CDR38-13aa1、2、3、4或5残基随即突变采用P1噬菌体Lox-Cre特异重组系统全合成人源性噬菌体ScFv库的构建

背景材料全合成人源性组合抗体库Knappik,2000,HuCAL库分析了人类抗体的结构、序列、胚系基因(germline)的使用率，发现7个VH和7个VL(4个Vκ和3个Vλ)胚系基因家族覆盖了人类多样性抗体的95％。根据这14个germline可变区序列设计了14个通用可变区序列作为基本框架，并按照E.coli的表达规律进行了序列优化，并且CDR区都易于替换。CDR3区的随机化采用了基于三联核苷酸的合成策略。7个VH和7个VL组配成49个子库，得到了2×109容量的全合成抗体库。借助Cre-loxP系统制备大容量ScFv库Sblattero(2000)背景材料VLVHgIIIlinkerloxP