酶工程 第四章 酶的提取与分离 2013-3-苗条

酶工程

EnzymeEngineering林范学

fanxuelin@1第四章酶的提取与分离酶的提取（extraction）与分离（separation，isolation）纯化（purification）是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等2酶分离纯化路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。3第一节细胞破碎celldisruption胞外酶：细胞内产生以后，可以分泌到细胞外的酶胞内酶：合成以后不分泌到细胞外，仍然存于细胞内的酶溶酶：游离在细胞内结酶：牢固与膜或细胞颗粒结合在一起不同类型细胞产酶动物细胞多为——胞外酶植物细胞多为——胞内酶微生物细胞为——胞外酶、胞内酶4胞外酶提取：盐析、沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶提取：收集菌体，破碎细胞后提取。结酶：打断酶蛋白和细胞颗粒结合。动物细胞需剔除结缔组织、脂肪组织等植物材料如种子应去壳，以免单宁等物质着色污染。5细胞破碎方法及其原理分类破碎方法原理机械破碎法捣碎法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎研磨法匀浆法物理破碎法温度差破碎法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎压力差破碎法超声波破碎法化学破碎法添加有机溶剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎添加表面活性剂酶促破碎法自溶法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，达到细胞破碎外加酶制剂法6一、机械破碎法方法作用过程适用范围捣碎法捣碎机高速旋转叶片产生剪切力，将组织细胞破碎动物内脏，植物叶芽等脆嫩组织，细菌细胞研磨法研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械产生的剪切力，将组织细胞破碎微生物细胞、植物组织细胞匀浆法匀浆器产生的剪切力，将组织细胞破碎破碎程度高，用于易分散、较柔软、颗粒细小的组织细胞7二、物理破碎法方法作用过程适用范围温度差破碎法温度突然变化，由于热胀冷缩作用而使细胞破碎较脆弱、易破碎的细胞压力差破碎法高压冲击；突然降压；渗透压变化G－菌，膜结合酶、细胞间质酶。对G＋不适用超声波破碎法声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用而使细胞破碎微生物细胞Ultra-highPressureCellDisrupter超声波细胞粉碎机8三、化学破碎法方法试剂作用过程有机溶剂甲苯、丙酮、丁醇、氯仿破坏细胞膜磷脂结构，改变膜透性，使胞内酶等释放到胞外，低温下进行防止酶失活表面活性剂Triton、吐温与膜中磷脂及脂蛋白作用而破坏膜结构，从而增加膜的透过性。一般采用非离子型，离子型会破坏酶的空间结构。9四、酶促破碎法方法试剂作用过程自溶法细胞自身的酶系在一定的pH值、温度和离子强度下，细胞本身的酶系作用使细胞破坏，释放出胞内物质外加酶制剂法溶菌酶(G＋)；β-葡聚糖酶(酵母)；几丁质酶(霉菌)；纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶(植物细胞)破坏肽聚糖中的β-1,4-糖苷键(G＋)；水解β-1,3-葡聚糖(酵母)10第二节提取extraction酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称为酶的抽提。提取目标：

a.将目的酶最大限度地溶解出来。

b.保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则 a.相似相溶。（极性物质：极性溶剂，非极性物质：非极性溶剂，酸性物质：碱性溶剂，碱性物质：酸性溶剂） b.远离等电点的pH值，溶解度增加。11一、酶提取的方法提取方法使用的溶剂(液)提取对象盐溶液提取0.02–0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2-6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8-12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含较多非极性基团的酶四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂，水。12二、影响酶提取的主要因素1、温度温度↑，酶的溶解度↑，酶分子的扩散速度↑温度过高，酶容易变性失活提取时温度不宜过高。有机溶剂提取时，温度在0~10℃。有些酶对温度的耐受性较高，如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸梅、胃蛋白酶等，可在37℃或更高一些温度下提取 在不影响酶的活性的条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。132、pH值溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著的影响为了增加酶的溶解度，提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点但是除了酸溶液提取或碱溶液提取者以外，提取时溶液的pH值不宜过高或过低，以防止酶的变性失活143、提取液的体积提取液↑，提取率↑过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利提取液的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。分次提取适当搅拌加保护剂（底物，辅酶，抗氧化剂等）15第三节沉淀分离定义：沉淀分离就是改变某些条件或者加入某些物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他物质分离的技术过程。16沉淀分离主要方法沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离17一、盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。应用最早、至今广泛使用主要用于蛋白类酶的分离纯化。181、基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：

1)盐溶（saltingin）：

低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

2)盐析（saltingout）：

高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。19Neutral

salt

0.5-1.0M

usually

salting

inNeutral

salt

>

1M

will

salting

out

20原因：加入少量盐↑，蛋白质上极性基团↑，蛋白质溶解度↑：盐溶。高盐浓度，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。2122232、溶解度影响因素酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切，可表示为：S：酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L）；S0：酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L）；KS：盐析系数；I：离子强度。24在温度和pH值一定的条件下，S0为一常数。β=lgS0，主要决定于酶或蛋白质的性质，也与温度和pH值有关。当温度和pH值一定时，β为一常数。Ks为盐析系数，主要决定于盐的性质。其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。

25某酶或蛋白质，在温度和pH值等盐析条件及所使用的盐确定（即β、Ks确定）之后，酶或蛋白质的溶解度决定离子强度I。离子强度I：指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。即：mi——离子浓度（mol/L）;zi——离子价数。26例如，0.2mol/L的（NH4）2SO4溶液，其中，铵离子浓度为2×0.2mol/L，价数为十1；硫酸根离子浓度为0.2mol/L，价数为十2；其离子强度为：273、分段盐析Ks分段盐析：在一定的温度和pH值条件下（β为常数），根据不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值)使不同的酶或蛋白质分离的方法。β分段盐析：在一定的盐和离子强度的条件下（I为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱和度饱和析出析出284、盐的选择常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等硫酸铵溶解度大25℃时，溶解度为767g/L；在0℃时，溶解度为697g/L）不影响酶的活性分离效果好价廉易得29盐浓度的表示饱和度例如，70mL酶液加入30mL饱和硫酸铵溶液，则混合溶液中硫酸铵的饱和度为30/（30十70）＝0.3。饱和硫酸铵溶液的配制方法：在水中加入过量的固体硫酸铵，加热至50~60℃，保温数分钟，趁热滤去过量未溶解的硫酸铵，滤液在0℃或25℃平衡1~2天，有固体析出，此溶液即为饱和硫酸铵溶液，其饱和度为1。在盐析过程中，需要加入的饱和硫酸铵溶液的体积，可以从有关文献中直接查表获得所需的数据。

30调整盐浓度的方式饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。V,V0——分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1——分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度31b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。32调整硫酸铵溶液饱和度计算表335、盐析法影响因素1)离子强度和种类盐析方程：2)蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%—3%最好。3)pH值：等电点处最易沉淀。4)温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。34二、等电点沉淀法(isoelectricprecipitation)

1、原理等电点(isoelectricpoint，IEP，pI)

：在某一pH的溶液中，蛋白质或氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。非等电点pH时，蛋白质自身所带的电荷与水分子形成了双电子层，使蛋白质胶体互相排斥。pI时，蛋白质的静电荷为0，破坏了这种双电层，导致蛋白质相互聚集在一起，从而形成大颗粒沉淀出来。35等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。2、使用方法常与其他方法一起使用。单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。加酸碱时，边搅边加，防止局部过酸过碱。36三、有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂(organicsolvent)，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法(organicsolventprecipitation)。仙人掌茶加入丙酮出现蛋白质类似物沉淀蛋清凝固效果371.沉淀机理降低溶液的介电常数，使分子间的静电引力增大，易于凝结；使某些分子表明水膜破坏，溶解度降低。2.常用有机溶剂丙酮

乙醇

甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。383.影响有机溶剂沉淀的因素（1）温度：低温(0℃)操作，溶剂要预冷(-15~-20℃)（2）pH值：尽可能靠近其等电点。（3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度防止蛋白质变性（4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/mL394.优缺点：

优点1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。40四、复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使其与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。常用的复合沉淀剂非离子型聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)、单宁酸、硫酸链霉素离子型表面活性剂：SDS

优点：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。41五、选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。热变性加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。如热稳定性好的α-淀粉酶。pH变性目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。42第四节离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。一、离心机的选择二、离心方法的选择三、离心条件的确定43一、离心机的选择44一、离心机的选择45一、离心机的选择46一、离心机的选择1、常速离心机（低速离心机）：＜8000r/min分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒。472、高速离心机：1000~25000r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等。483、超速离心机：25000~120000r/min制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等。分析用超速离心机：测定样品纯度、沉降系数、相对分子量49机械转动装置转子、离心管、离心管帽冷冻装置真空系统50离心机基本组件1.低速离心机

转子速度控制系统最高转速在8000rpm以下实验室中常用于分离制备。

2.高速离心机

系列转子速度控制系统温控系统最高转速在25,000rpm以下常用于生物大分子的分离制备

3.超速离心机系列转子速度控制系统温度控制真空系统常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。51二、离心方法的选用常速、高速离心机：颗粒大小和密度相差较大，确定离心速度和时间分离出2种以上大小和密度不同的颗粒，采用差速离心法超速离心机：差速离心密度梯度离心等密梯度离心521．差速离心（differentialcentrifugation）是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。

2）沉降的颗粒受到挤压，容易结团，甚至失活。53541000g/10min去掉上清3000g/10minetc.55操作时，将均匀的悬浮液装进离心管，选择好离心速度（离心力）和离心时间，使大颗粒沉降；分离出大颗粒沉淀后，再将上清液在加大离心力的条件下进行离心，分离出较小的颗粒；如此离心多次，使不同沉降速度的颗粒分批分离出来。562．密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。

57密度梯度系统梯度介质足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围；不会与样品中的组分发生反应；也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度蔗糖：浓度5%~60%，密度1.02~1.30g/cm2

甘油密度屏障不连续梯度

连续梯度58密度梯度的制备梯度混合器

贮藏室

混合室BA59密度梯度混合器操作1、稀溶液置于B室，浓溶液置于混合室B，保持液面平等2、开动搅拌器3、同时打开两阀门4、离心管收集注意：1、若浓溶液置于B室，稀溶液置于A室，则梯度液导流管须插入离心管底部，让后流入的高浓度混合液将先流入的低浓度的混合液顶起来。2、若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带变宽，影响离心效果，可适当增加离心力缩短离心时间加以解决60A=B截面积B＞A浓度体积B＜A线性梯度凸形梯度凹形梯度61密度梯度混合器62手动混合将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。63操作过程注意：样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。50000rpm×15min50000rpm×20minSTOP643．等密度梯度离心(equilibrium-densitygradientcentrifugation)当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称为等密度梯度离心，或称为平衡等密度离心。isopycniccentrifugation65特点：

介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质介质氯化铯（CsCl）,硫酸铯（CsSO4）、溴化铯（CsBr）等。有时采三碘苯的衍生物。66操作过程先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量的铯盐加到样品液中使之溶解。在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度梯度。样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成区带。67注意：

预先配置介质的密度梯度溶液，将介质和预分离样品混合或者是置于梯度溶液顶部。离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。一旦达到了平衡，再延长离心时间也不能改变粒子的成带位置。艳盐对铝合金的转子有很强的腐蚀作用，要防止艳盐溶液溅到转子上,最好采用钻合金转子。

68密度梯度离心等密度梯度离心梯度介质通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降样品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降样品离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度分离依据密度相近，但沉降系数不同沉降系数相近，但密度不同69总结：差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。70三、离心条件的确定离心分离的效果好坏受到多种因素的影响离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度离心力（或离心速度）和离心时间。离心介质的pH值和温度。711．离心力（centrifugalforce）离心力（Centrifugalforce，Fc）：指由于物体旋转而产生脱离旋转中心的力，取决于颗粒的质量和离心加速度ac

ac:颗粒旋转的加速度（m/s2）;ω:旋转角速度(弧度／秒);r:颗粒离旋转轴的距离，即旋转半径(cm);m:颗粒质量（g）;n：转速，单位为转/分(r/min);

ρ:颗粒密度;V:物体体积72相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF

）即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字

g）表示。g为重力加速度（980.7cm/sec2)7374沉降系数（sedimentationconstant）指单位离心力下颗粒的沉降速度,用S表示。对于某一具体的颗粒，S是定值。(1S=10-13秒）常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1~200之间。752．离心时间常速离心、高速离心和差速离心沉降时间：是指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需的时间。沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。密度梯度离心 区带形成时间：指形成界限分明的区带的时间。等密度梯度离心平衡时间：指颗粒完全达到等密度点的平衡时间。76知道沉降系数的颗粒，其沉降时间为：t——沉降时间（s）；S—颗粒的沉降系数（s）；ω——转子角速度（船以s）；r1——旋转轴中心到样品液液面的距离（cm）r2——旋转轴中心到离心管底的距离（cm）。77效率因子K：是转头的一个特性指标，可以衡量转头离心效率的高低.离心机出厂时标出最大转速时的K值。可以根据公式计算出其他转速时的K值。78离心机r1、r2为定值，某一颗粒的沉降系数S为定值，即ω2t为定值，得较高转速+较短时间较低转速+较长时间793．温度和PH值离心温度4℃左右，某些耐热性较好的酶，室温（20~25℃）。在超速离心和高速离心时，必须采用冷冻系统。离心介质的pH处于酶稳定的pH值范围可用缓冲溶液。80第五节过滤与膜分离过滤（filtration）是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质（filter）：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等。81过滤分类82根据颗粒大小的过滤分类及其特性类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤2nm～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<2nm生物小分子、盐、离子反渗透膜83一、非膜过滤(non-membranefiltration)采用高分子膜以外的材料，如滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤，包括粗滤和部分微滤。1.粗虑2.微滤841．粗滤roughfiltration借助于过滤介质截留悬浮液中直径大于2μm的大颗粒，使固形物与液体分离的技术称为粗滤。通常所说的过滤就是指粗滤而言。助滤剂：加快过滤速度，提高分离效果硅藻土、活性炭、纸粕等。85（1）常压过滤以液位差为推动力的过滤方法滤纸过滤，吊篮或吊袋过滤设备简单，操作易行方便，但过滤速度慢分离效果差86（2）加压过滤以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力的过滤方法。设备简单，过滤较快，过滤效果好87（3）减压过滤又称真空过滤(vacuumfiltration)或抽滤(suctionfiltration)，是通过在过滤介质的下方抽真空，增加过滤介质上下方之间的压力差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。882．微滤microfiltration微滤又称为微孔过滤。微滤介质截留的物质颗粒直径为0.2~2μm，主要用于细菌、灰尘等光学显微镜可以看到的物质颗粒的分离。在无菌水、矿泉水、汽水等软饮料的生产中广泛应用。非膜微滤一般采用微孔陶瓷、烧结金属等作为过滤介质，也可采用微滤膜为过滤介质进行膜分离。89微孔陶瓷Microporousceramic烧结金属(青铜）SinteredBronzeFilter微滤膜micro-filtrationmembrane90二、膜分离技术(membraneseparationtechnology)借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。薄膜主要由丙烯脂、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以来用动物膜等。薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。91根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离可以分为3大类921．加压膜分离加压膜分离是以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差的作用下，小于孔径的物质颗粒穿过膜孔，而大于孔径的颗粒被截留。9394（1）微滤（Microfiltration，MF）以微滤膜（或非膜材料）作为过滤介质的膜分离技术。截留颗粒在0.2~2µm,操作压力在0.1Mpa以下。例如：无菌水除菌，酶液除微生物细胞细胞水盐大分子小分子95一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞微滤膜在各种分离膜中的产值最高，占世界膜技术总产值的50%以上（用于其它膜过程的前期处理过程）实验室常用：0.2μm或0.5μm的微滤膜＋真空泵＋抽滤瓶＋夹子＋溶液杯96（2）超滤（Ultrafiltration，UF）又称超过滤，是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的方法。截留颗粒直径在20~200nm，相当于分子质量为1×103～5×105

道尔顿。用于分离病毒和各种大分子。A、高分子溶质之间（如蛋白质分子之间的分级分离），以及高分子与小分子溶质之间（如蛋白质分子脱盐）的分离B、Pro浓缩大分子水盐小分子97超滤膜过滤原理98超滤膜致密膜、微孔膜、非对称膜非对称膜：使用最广泛。一般由两层组成：表面活性层和支撑层。表面活性层非常薄，厚度0.1－1.5μm。表面活性层起分离作用(即选择透过作用)。支撑层起机械支撑作用，是多孔的，对分离特性和传递速率影响很小，厚度50－250μm。99膜的透过性一般以流率表示，即每平方厘米的膜每分钟透过的流体的量。超滤时流率一般为0.01～5.0mL/cm2•min。影响流率的因素膜孔径的大小：孔径大，流率大，为主要因素。颗粒的形状与大小：密度小、球状、小分子的颗粒透过性较好。溶液浓度：浓度越高，超滤流率越小。操作压力：一般压力增加，超滤的流率亦增加，压力一般控制在0.1～0.7MPa。温度、搅拌：适当提高温度，增加搅拌速度等利用提高流率。1003、反渗透（ReverseOsmosis，RO）在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻挡于膜壁外。截留颗粒直径：小于2nm。操作压力：0.7~13MPa。应用：主要用于分离各种离子和小分子物质。在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛应用水盐小分子大分子101102（4）纳滤(Nanofiltration，NF)纳滤膜主要用于截留粒径在2～10nm，分子量为1000左右的物质，可以使盐和小分子物质透过， 操作压（0.5～1MPa）。其被分离物质的尺寸介于反渗透膜和超滤膜之间。水盐小分子大分子1032．电场膜分离电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场作用下，的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。电渗析(electroosmosis)离子交换膜电渗析(ionexchangemembraneelectroosmosis)104（1）电渗析(electroosmosis)在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离的目的。+-极水盐水

淡水电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、纯水制备以及其他带电荷小分子的分离。105（2）离子交换膜电渗析(ionexchangemembraneelectroosmosis)离子交换膜电渗析的装置与一般电渗析相同。只是以离子交换膜代替一般的半透膜而组成。Anion106离子交换电渗析在酶液脱盐、海水淡化、以及从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的小分子发酵产物等。1073．扩散膜分离利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外。而大分子被截留，从而达到分离效果。常见的透析(dialysis)就是属于扩散膜分离。扩撒Diffusion108透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛聪盼等制成。透析主要用于酶等生物大分子的分离纯化，从中除去无机盐等小分子物质。109透析袋透析简单装置。A:透析夹，B:透析，C:透析示意图

透析方法及装置110第六节层析分离层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中而达到分离。层析法也称色谱法（chromatography）层析中两相为流动相(mobilephase)和固定相(stationaryphase)，当流动相流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离纯化。111极性相近的分之间，其亲和力较强112层析方法分类113层析分离方法层析方法分离原理吸附层析利用吸附剂对不同的物质吸附能力不同而使混合物各组分分离分配层析利用不同的物质在两相的分配系数不同而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离集团（活性集团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而达到分离的目的亲和层析利用生物分子与配基专一而又可逆的亲和力力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点的特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离114一、吸附层析吸附层析（adsorptionchromatography）是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。由于吸附剂来源丰富、价格低廉、可以再生，吸附设备简单，至今仍在实验室和工业生产中广泛使用。1151．吸附层析原理利用吸附剂对不同组分的吸附力不同进行分离。吸附：任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。吸附剂：凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。116吸附层析示意图吸附剂易吸附分子不易吸附分子被分离样品与吸附剂之间主要作用力是范德华力。被吸附物能够解吸117柱层析：将固定（吸附剂）相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。吸附剂种类：活性氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸盐、活性碳、陶土、纤维素等。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。118吸附层析操作步骤：装柱→上样→洗脱（1）先把吸附剂装在玻璃柱中（吸附剂用量为分离样品的30～50倍），使它形成层析柱；（2）将待分离的样品从柱顶加入（加样时避免冲动基质）；（3）当样品溶液全部流入吸附层析住后，加入洗脱剂。119不同的物质吸附力和解吸力不同，移动的距离不同。吸附力弱而解吸力强的物质，移动距离较大。吸附力强而解吸力弱的物质，移动距离较小。1201211221232．洗脱方法用适当的溶剂或者溶液从吸附柱中把被吸附组分洗脱出来的方法主要有3种。溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法124（1）溶剂洗脱法：溶剂洗脱法是采用单一或者混合的溶剂进行洗脱的方法，是目前应用最广泛的方法。125洗脱曲线：用洗脱液体积对各组分浓度作图，可以得到洗脱曲线流速太慢，前峰拖尾与后峰相连流速太快，组分分不开，两峰重叠正常的流速使组分完全分离126洗脱液的流速要恰当控制太快，峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的离子强度太慢，出现拖尾现象，若峰间距离过大，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱方法(属于离子交换层析)。127理想的洗脱曲线如图所示。图中的各峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。128（2）置换洗脱法置换洗脱法又称为置换法或取代法，是用吸附力比被吸附组分更强的洗脱物质来洗脱样品组分的方法。洗脱剂为置换洗脱液，含有置换剂（吸附力比被吸附组分更强）。阶梯式的洗脱曲线。物质浓度洗脱液体积AB各组分一个接一个，界限不分明，交界处互相混杂，分离效果并不理想。129（3）前缘洗脱法前缘洗脱法，又称为前缘分析法，是连续向吸附层析校内加入欲分离的混合溶液，即所用的洗脱液为含有各组分的混合溶液本身。流出顺序：纯溶剂吸附力最弱的组分两组分、三组分……多组分的混合混合液AA+BA+B+C只能将最前缘的组分A分开1303．吸附剂与洗脱剂的选择（1）吸附剂的选择吸附剂是关键因素，尚无固法可循，操作中可根据前人的经验或者通过小样试验来确定。吸附力的强弱：极性物质容易被极性表面吸附非极性物质容易被非极性表面吸附溶液中溶解度越大的物质越难被吸附选择原则：极性强的分离物，选择极性小的吸附剂极性弱的分离物，选择极性强的吸附剂131吸附剂具备条件表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉等吸附剂种类可以分为无机吸附剂和有机吸附剂常用吸附剂包括硅胶、活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖、菊糖、纤维素等。此外，还可以在吸附剂上连接亲和基团而制成亲和吸附剂。132吸附剂预处理 去除杂质、提高吸附力、增强分离效果。加热处理：去除吸附在其中的水分、气体氧化铝，140℃高温条件下加热6h，使含水量降至0~3%活性炭，在使用前需于150℃加热干燥4~5h，干燥除气酸处理，以除去各种金属离子。用于酶的分离纯化的吸附剂硅藻土、氧化铝、磷酸钙、轻基磷灰石和活性炭等。在较低pH值、低离子强度的条件下对酶有较强的吸附作用，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可被解吸而洗脱下来。133（2）洗脱剂的选择根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。非极性组分，用非极性溶剂洗脱较佳。洗脱剂的种类：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。按其极性的增大排列如下：石油醚、环已烷、四氯化碳、三氯己烷、甲苯、苯、二氯甲烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶乙酸等。134洗脱剂的选择要注意下列各点：①洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解；②洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，黏度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离；③洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响。135二、分配层析分配层析（Partitionchromatography）是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数（distributioncoefficient）是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数，以K表示。固定相：吸附在多孔性固体支持物上的溶剂流动相：与固定相溶剂互不相溶的溶剂，可沿着固定相流动136分配层析分类纸层析分配薄层层析分配气相层析只适用于气体组分的分离和分析检测1371．纸层析（paperchromatography）固定相：滤纸纤维的结合水（6%~7%）流动相：与水不相混溶或部分混溶的有机溶剂特点：设备简单，操作方便。所需样品少展开时间长、分离量少，酶容易变性失活。1381392．薄层层析（thinlayerchromatography）固定相：支持物均匀地铺在支持板（玻璃板）上，成为薄层流动相：与水不相混溶或部分混溶的有机溶剂支持物为固体吸附剂如硅胶、氧化铝、聚酰胺等：主要依据吸附力的不同使组分分离，称为吸附薄层层析支持物为纤维、硅藻土，主要依据分配系数的不同而使组分分离的薄层层析法，称为分配薄层层析。特点：薄层层析的展开时间短分辨率比纸上层析高10~100倍既可作分析用，分离0.01μg的微量样品；又能作制备用，分离500mg甚至更多的样品；薄层可以规格化制备。重现性比纸上层析差，对酶等生物大分子的分离效果不理想。140薄层板玻璃板上涂吸附剂层SiO2Al2O3上行法薄层板层析缸展开剂层析缸展开剂滤纸条下行法薄层板141三、离子交换层析离子交换层析(ionexchangechromatography，IEC)是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。1、原理根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。1422、离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。离子交换剂由母体（载体）、电荷基团和反离子构成。

如羧甲基纤维素离子交换剂组成纤维素—O—CH2—COO-—Na+

载体电荷基团反离子143144按活性基团的性质不同可以阳离子交换剂：能吸附带“+”的离子或酶（溶液pH＜pI）

酸性基团：

-CM-（羧甲基）、-PO32-（磷酸基）、-SO3-（磺酸基）等阴离子交换剂：能吸附带“-”的离子或酶（溶液pH＞pI）碱性基团：-N+(CH3)3（季胺）、-N+(CH3)2（

叔胺）、-NHCH3（仲胺）根据母体不同可分为离子交换树脂：交换容量不大，易使酶失活离子交换纤维素：最广泛的一类离子交换凝胶：不耐高流速洗脱145平衡常数在一定条件下，某种组分离子在离子交换剂上的浓度与在溶液中的浓度达到平衡时，两者浓度的比值K称为平衡常数（也叫分配系数）。即：K的值越大，活性基团对某组分离子的亲和力就越大，表明该组分离子越容易被吸附。K值越大，保留时间就越长。如果欲分离的溶液中各种组分离子的K值有较大的差别，通过离子交换层折就可以使这些组分离子得以分离。146离子交换剂的选择①离子交换剂和组分离子的物理化学性质：电荷高者＞电荷低者②组分离子所带的电荷种类：同性相吸③溶液中组分离子的浓度高低：浓度大者＞浓度小者④组分离子的质量大小：质量小的，采用小孔径；质量大的，采用大孔径⑤组分离子与离子交换剂的亲和力大小：亲和力大的易吸附难洗脱，亲和力小的难吸附，易洗脱147离子交换剂的处理（1）水浸泡：2h以上，使充分膨胀（2）无离子水洗涤（3）用酸浸泡，2mol/LHCl，4h，无离子洗涤至中性（4）用碱浸泡，2mol/LNaOH，4h，无离子水洗涤至中性（5）转型处理，使离子交换剂上所带的可交换离子转变为所需的离子。1483、离子交换层析的操作过程（1）装柱干法装柱：干燥的离子交换剂→柱子→加溶剂或溶液湿法装柱：加溶剂或溶液→柱子→离子交换剂（2）上柱平衡：溶剂或缓冲液上样：加入欲分离混合液，上样体积1%~5%（交换剂总量）（3）洗脱和收集梯级洗脱（分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度）梯度洗脱（连续改变pH或盐离子强度）（4）再生用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl处理。149150四、凝胶层析凝胶层析（gelchromatography）指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶过滤（gelfiltration）分子筛层析（molecularsievechromatography）排阻层析（exclusionchromatography）1511、基本原理大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。152153分配系数Ka

(表示凝胶对溶质的排阻程度):Ve——洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo——外水体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积；Vi——内水体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。V0VolumeoutsideViVolumeintsideVi

=Vt

-Vo

VtVolumetotalVgVolumegel154凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Ka=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.

0<Ka<1,Ve=KaVi+Vo,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Ka小的先流出，Ka大的后流出。Ⅲ.Ka=1时,

Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ka＞1，表明凝胶对组分有吸附作用Vo洗脱液体积mLVeVo+Vi组分浓度ViIIIIII155分配系数Ka

的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果Ka差异大，分离效果好，Ka差异小，分离效果差。156流动分离理论大分子不能进入毛细管，最先流出中等大分子在毛细管中心区，流速较快，较快流出小分子在毛细管壁处，流速较慢，最后流出扩散分离理论大分子扩散到凝胶微孔中的程度小，较易被洗脱出小分子容易进入到凝胶微孔中，较难被洗出。157Ve与分子量(M)的关系:K1和K2对特定的层析柱来说都是常数.在同样凝胶层析条件下，测定一系列已知分子量（M）蛋白质的Ve，可作图得一直线.用此直线为标准曲线,求知未知蛋白的lgM.再由lgM求出M.lgMABCVelgMAlgMBlgMCVeCVeBVeA158利用相对洗脱体积Kav对lgMr做曲线，称为选择曲线Kav=Ve/Vt每一类型的化合物都有其各自特定的选择曲线。所以通过凝胶层析可以测定物质的相对分子质量。3.54.05.55.05.56.000.51.0KavlgMr葡萄糖凝胶G200葡萄糖凝胶1200球蛋白的选择曲线1592．凝胶的选择与处理微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成凝胶材料：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等。交联剂：环氧氯丙烷等。交联剂加得越多，载体颗粒的孔径就越小。其孔径的大小决定其用于分离的组分颗粒的大小。160（1）葡聚糖凝胶（dextrangel)商品名:Sephadex，型号

SephadexG-10至G-200。G后的数字为凝胶吸水值的倍数。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。广泛用于各种物质的分离（2）琼脂糖凝胶（agarosegel)

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美国）。琼脂糖密度越大，网状结构越密集。适用于分子质量较大的蛋白质和多糖的分离纯化（3）聚丙烯酰胺（polyacrylamidegel）商品名为Bio-GelP,型号从Bio-GelP-2至P-300。P值越大，孔径越大。惰性凝胶，适合酶,蛋白质，核酸的分离纯化，但不能遇强酸1613.操作步骤（1）凝胶的选择和处理根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于5~10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。（2）装柱选择粗细均匀的柱子。采用长度：直径（L/D）比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。洗脱液浸过凝胶表面162（3）加样（上柱）体积不能过多，不超过床体积的30％，通常可在10％左右。混合液的浓度可以高些，但是黏度宜低。（4）洗脱洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。洗脱液体积一般为凝胶床体积的120%左右。（5）凝胶的保存洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%叠氮钠（NaN3）防腐。163五、亲和层折亲和层析(AffinityChromatography)是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。又称为：功能层析（functionchromatography）生物专一吸附（biospecificadsorption）选择层析（selectivechromatography）酶——底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅因子）特异性抗原——抗体激素——受体

DNA——互补的DNA或RNA

凝集素——糖蛋白164将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。1651．亲和层析母体和配基母体（Matrix）载体、担体配体（ligand）配基臂（spacearm）琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶纤维素小分子物质（金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等）作为配基时引入连接臂欲分离物质杂质166母体活化：目的：不溶性母体与配基以共价键偶联不同的载体活化需要不同的活化剂。常用活化方法溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功能试剂法AgaroseOHOH+CNBrNaOHC=NHAgaroseOO+NH2—RC—NH—ROOHNH=AgaroseNaOH载体活化载体配体亲和吸附剂1672．亲和层析方法根据欲分离组分与配基的结合特性，亲和层析可以分为:分子对亲和层析免疫亲和层析共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析168（1）分子对亲和层析分子对亲和层析（moleculepairaffinitychromatography）是利用生物分子对之间专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的一种亲和层析方法。酶——底物酶——竞争性抑制剂酶——辅因子抗原——抗体酶RNA——互补RNARNA——互补DNA169配对的任何一方都可做固定相，另一方做流动相控制条件温度：0~10℃pH：吸附时在酶作用的最适pH，洗脱时在酶稳定性好又不在最适pH170（2）免疫亲和层析免疫亲和层析（immuneaffinitychromatography）：是利用抗原与抗体之间专一而又可逆的亲和力使抗体或者抗原分离纯化的一种亲和层析方法。又称为抗体亲和层析配基抗原或抗体蛋白A或蛋白G可与IgG的Fc区域高度专一亲和171172（3）共价亲和层析共价亲和层析（covalentaffinitychromatography）：是生物大分子中的功能性基团与层析剂上配基形成可逆性的共价键的一种亲和层析方法。例如，巯基化合物中的—SH基可与另一个—SH堪结合形成二琉键（—S—S—）。可用L-半胱氨酸、巯基乙醇、谷肮甘肽以及二硫苏糖醇等小分子巯基化合物进行洗脱。173（4）疏水层析

疏水层析（hydrophobicchromatography）：是酶蛋白中的疏水基团与亲和层析剂上的疏水基团进行可逆性疏水结合反应的一种亲和层析方法。酶蛋白通常含有疏水性较强的氨基酸，如亮氨酸、濒氨酸和苯丙氨酸等，可以与亲和层析剂上改性琼脂糖的烷基发生疏水结合反应，不同的蛋白质分子中疏水基团的数量和特性有所不同，可以通过疏水层析而得以分离。174低盐浓度下，疏水基团相互分离高盐浓度下，疏水基团相互亲和175溶液中的高离子强度可以增强酶（蛋白质）与疏水层析介质的疏水相互作用；采用高离子溶液上样，能够使酶（蛋白质）等分离组分吸附于疏水层析介质；然后线性或阶段地降低流动相中的离子强度，将使吸附于介质上的组分，按照疏水作用由弱到强，被依次洗脱下来。176（5）金属离子亲和层析金属离子亲和层析(metalionaffinitychromatography）：是利用蛋白分子中的一些氨基酸残基与层析剂上的金属离子进行可逆性鳌合反应的一种亲和层析方法。氨基酸残基：His咪唑基团，Cys的巯基，Trp吲哚基团金属离子：Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等用螯合剂将金属离子螯合到母体（如交联化的琼脂糖、葡聚糖等）的表面上制成金属亲和层析剂。177MetalChelateAffinityChromatography178洗脱方法：改变盐的浓度改变pH值置换：加入竞争性试剂，如咪唑、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等。优点：母体可再生：强螯合剂可代替弱螯合剂螯合剂较稳定：选择适宜的金属离子，可吸附不同蛋白质。蛋白质能保持活性179（6）染料亲和层析染料亲和层析（dye-ligandchromatography）是利用酶分子与一些染料上的基团进行可逆的亲和反应的一种亲和层析方法。一些有机染料，如蒽醌化合物、偶氮化合物等，具有类似于NAD+的结构。一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料有一定的亲和力。常用的有机染料是二羟偶氮化合物。已成功地用于以NAD+、NADP+、ATP为辅酶的多种酶的分离纯化。180羟基蒽醌NAD+蒽醌偶氮化合物181（7）凝集素亲和层析凝集素亲和层析（lectinaffinitychromatography）是利用酶蛋白与凝集素之间进行可逆性亲核反应的一种亲和层析方法。凝集素（1ectin）是一类能与糖的残基专一而又可逆结合的蛋白质。它们能与多糖、糖蛋白及红细胞和肿瘤细胞的凝集体等亲和结合。182与固定化凝集素结合的物质可用竞争性的结合试剂或离子浓度梯度洗脱下来183184凝集素亲和层析可以用于各种糖蛋白的分离纯化。例如，胞外超氧化歧化酶（EC-SOD）具有3种同工酶，都是含铜—锌离子的糖蛋白。用肝素、琼脂糖凝胶等为母体，以凝集素为配基制成亲和层析剂进行亲和层析，可以将这3种同工酶分离纯化。185六、层析聚焦层析聚焦（chromatofocusing）是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离的技术。层析聚焦等电聚焦：聚焦作用，高分辨率离子交换层析：浓缩分离作用，大容量分离186基本原理利用层析过程中固定相偶联的具有两性解离功能的有机分子为配基，与流动相中某些两性物质发生等电聚焦反应而进行分离流动相多缓冲溶液，含两性电解质载体，在一定范围pH值条件下具有相似的、较强的缓冲能力；Polybuffer96：pH6～9Polybuffer74：pH4~7

混合在一起，缓冲pH4~9187固定相为 多缓冲交换剂。是以Sepharose6B为基质，通过化学方法把带有多种电荷基团的配体与其偶联而制成的。PBE94：pH4~9PBE118：pH8~11188pH梯度的形成聚焦层析介质上偶联的多氨基多羧基的有机分子具有相应的碱性和酸性离子交换基团，当用Polybuffer96时，先用高pH缓冲液平衡，再用低pH多缓冲液过柱，层析介质能与缓冲液中的H+

或OH-作用而形成连续pH梯度，层析介质都会带上不同数目的负电荷当溶液中带负电荷的离子流过时就会根据各自pH不同在不同的部位发生交换聚焦，被吸附在介质上然后用pH较低的缓冲液洗脱时，被吸附的物质重新带电荷，从介质上解下来189-Cl--Cl--OH-+++淋洗液++-OH-pH低高pH=6从层析柱顶部到底部形成了pH6～9的梯度。190蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的pI和层析柱的pH值pH环境pH＜pIpH＞pIpH＜PIPro带电性+-+吸附情况不吸附吸附解吸附某种pro加样到已形成pH梯度的层析柱时，由于洗脱液的连续流动，pro迅速迁移至与它pI相同的部位，从此位置开始，pro将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直至pH＜pI

、pro带正电荷时，被洗脱下来191++++■层析聚焦的聚焦机制：8765+++++-0+Polybuffer聚焦在pI超越pI（带负电）被吸附在低pH处带正电被排斥192●

抹香鲸肌红蛋白

(pI=8.2)追过

马肌红蛋白

(pI=7.4)193操作流程：聚焦层析柱起始缓冲液平衡样液上样多缓冲液淋洗洗脱液解吸附194第七节电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳（electrophoresis）。电泳技术（electrophoresistechnique）是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。电泳按支持物体不同分为：1、纸电泳2、薄层电泳3、薄膜电泳4、凝胶电泳5、自由电泳6、等电聚焦电泳195在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。196迁移率与内在特性和外界条件有关内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小、形状）外界条件：电场强度、溶液性质（pH，离子强度、电 渗）、支持体特性、缓冲液性质（1）颗粒性质：电荷越大、半径越小、形状越接近球形，迁移率越快。197（2）电场强度：电场强度越高，迁移率越快。常压电泳：电场强度一般为2~10V/cm，电压为100~500V，电泳时间从几十分钟到几十小时，多用于带电荷的大分子物质的分离高压电泳：电场强度为20~200V/cm，电压大于500V，电泳时间从几分钟到几小时，多用于带电荷的小分子物质的分离。198（3）溶液性质：pH值：离pI越远，迁移率越快。（用buffer）离子强度：离子强度越高，迁移率越低。（4）电渗：在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动滤纸纤维素带有负电荷，使水分子带有正电荷，向负极移动，使带正电粒子速度加快，带负电荷粒子减慢。“顺水快，逆水慢”应避免用高电渗物质作支持介质。199一、纸电泳纸电泳（paperelectrophoresis）是以滤纸为支持体的电泳技术。是最早使用的区带电泳。

操作过程：1：支持物的选择，一般采用层析滤纸为支持物。2：选择一定的pH和一定强度的缓冲液3：点样量要适当，过多拖尾，过少难检测4：电泳200201ElectrophoresisofhaemoglobinoncelluloseacetatepaperA:normalSS:sicklecellanaemia镰状细胞贫血AS:sicklecelltrait镰状细胞特质AC:haemoglobinCtrait血红蛋白C特质202二、薄层电泳薄层电泳(thin-layerelectrophoresis)是将支持体与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳的技术。支持体:淀粉最常用,广泛应用于蛋白质、核酸、酶等的分离。纤维素硅胶琼脂203三、薄膜电泳薄膜电泳（filmelectrophoresis）是以醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持体的电泳技术。薄膜电泳的分辨力虽然比不上凝胶电泳和薄层电泳，但是由于薄膜电泳具有简单、快速、区带清晰、灵敏度高、易于定量和便于保存的特点，故广泛用于各种酶的分离。204四、凝胶电泳凝胶电泳（gelelectrophoresis）是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。凝放电泳与其他电泳的主要区别在于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，具有很高的分辨力。支持体：聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。205聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。机械强度高，透明有弹性，有较好的化学稳定性和热稳定性，没有吸附作用和电渗作用，可以通过改变丙烯酰胺浓度和交联剂浓度而制成不同孔径的凝胶等显著优点。2061．聚丙烯酷胺凝胺的制备聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）

为单体，以N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide，简称Bis）

为交联剂，在催化剂的作用下聚合而成的具有网状结构的多孔凝胶。Acr:（CH2＝CH—CONH2）Bis:（CH2＝CH—CONH—CH2—HNCO—CH＝CH2）207208催化剂①可以用过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）为化学聚合催化剂。在TEMED的催化下，过硫酸铵形成氧的自由基，氧的自由基引发单体与交联剂的聚合作用。②用核黄素作为光聚合催化剂。光聚合可以用日光、电灯等作为光源。在痕量氧存在的条件下，核黄素经光解作用形成无色基，无色基再氧化生成自由基，从而引发聚合反应。209催化剂①化学聚合系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，A