肉类艾美耳球虫生物学和免疫生物学研究进展

肉类艾美耳球虫生物学和免疫生物学研究进展

球虫病是以肠病为特征的原生动物，每年给世界养禽业造成约80亿欧元的损失。如果药物的预防失败，死亡率和发病率就会增加，损失将更加大。1艾美耳球虫的发育禽类的艾美耳球虫的生活史包括有性生殖阶段和无性生殖阶段,球虫的生物学发育也比较清楚。通常,卵囊随粪便排出,在外界环境中进行孢子生殖,有氧气的环境下经过大约24h孢子化。孢子化卵囊包含4个孢子囊,每个孢子囊含有2个子孢子。通过合适的途径感染宿主,卵囊在肠腔内,在胰酶、胆汁和CO2的作用下脱囊,子孢子逸出并钻入绒毛上皮细胞。有些种的子孢子如布氏艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫,在钻入位点的细胞内发育。其他种的子孢子如堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫,被转运到其他地方如上皮细胞下层发育。在宿主细胞内,子孢子进行无性生殖(或裂殖生殖),产生的裂殖子一部分进行下一代的发育,一部分出现性的分化,产生大配子体和小配子体,分别形成大配子和小配子,大小配子结合形成合子最后发育成卵囊随粪便排出体外。整个发育阶段为4~5d。最大卵囊产量于感染后6~9d不等。控制艾美耳球虫在宿主细胞内发育的生化和遗传学机制目前尚不明了。但是,通过对柔嫩艾美耳球虫的早熟株和耐药株的研究,确定了与早熟和耐药特性相关的连锁群,定位在球虫的1和2号染色体上。这些信息有助于确定控制柔嫩艾美耳球虫生活史的遗传座。从这个研究中可得到其遗传分离数据。近年来其他的研究也确定了一些基因如ETS3a基因,也许在控制柔嫩艾美耳球虫生活史中起重要作用,它的表达受到发育阶段的调控。艾美耳球虫代谢机制的研究也有了进展,如一些保护性抗原在免疫中的应用和化学药物的代谢途径的研究。譬如,甘露醇循环在柔嫩艾美耳球虫的孢子化过程中提供能量来源。这个途径也许广泛存在于其他的艾美耳球虫种中。最近报道了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的一些特征性的酶类,在禽类其他艾美耳球虫中也表现一系列活性。2艾美耳球虫致病性鉴定禽类的艾美耳球虫,公认的有7种,分别是堆型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫,每种都有特异的寄生部位。在6周龄以内的鸡群中常见的有6种,即堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫,其中有5种致病性由中等到最强,具有特征性的病变。另一方面,和缓艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫在自然条件下不会产生明显的病变,鸡群一般也不会出现死亡,被认为是无致病性的虫种。但是,试验感染也会导致肠炎、腹泻,降低饲料转化率,说明这2种也能引起经济损失,也需要预防和控制。Shirley第1个使用分子生物学方法如卵囊的同工酶谱来鉴别球虫种。Ellis和Bumstead第1个通过特征性限制片段图谱证实了用rRNA和rDNA探针能鉴别个体种。Procunier等用随机引物DNA多态性方法鉴别了堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫并检测出了种间差异。重组DNA技术被应用于区别柔嫩艾美耳球虫不同的株,并建立了早熟和耐药株的标准,用PCR方法从基因组DNA扩增出了内部转录间隔区1,用于检测和鉴别6个艾美耳球虫种。用PCR二步法程序可以区分包括哈氏艾美耳球虫在内的8个种。用限制性片段长度多态性方法鉴定了6个澳大利亚球虫种。这些PCR相关技术对于研究禽类球虫病的流行病学调查是很有用的。3cd4+t细胞在抗感染免疫中的作用该领域进展较大的主要是E.vermiformis进行的遗传改变小鼠感染模式的研究。TCRγδ+CD4+的主要组织相容性复合物II(MHC#II)限制性T细胞可以产生IFN#γ,对初次和再次感染产生抗原特异性反应。此外,B细胞和IL#6也在初次感染中发挥作用,但不是必要的组分。其他的非MHC#II限制性细胞也参与再次感染的免疫记忆作用。由于缺乏遗传改良的鸡即敲除其免疫效应因子基因的鸡,和单克隆抗体制剂的缺乏,使得对禽类球虫病引起的免疫反应的细致研究变得更加困难。然而,有一些事实比较清楚,如初次感染会产生一些遗传的抗性成分。机体对同种物质的再次感染形成稳定的免疫性。虽然产生的免疫性不会阻止子孢子对细胞的侵入,但是会抑制子孢子的进一步发育。初次感染产生的免疫反应效应器及抵抗球虫感染的效应物质主要是位于肠相关淋巴组织的T细胞。此时体液免疫反应也会参与,但是抗体在该过程中只起到次要作用。用单克隆抗体对鸡的肠道淋巴细胞的表面标志进行检测,发现它与鼠和人的CD3、CD4和CD8T细胞具有相同的表面标志。发现CD3多肽复合物与抗原特异性的T细胞受体αβ或γδ异二聚体具有相关性,CD4+T细胞识别MHC#II抗原,CD8+T细胞识别MHC#I抗原。对鸡来说,TCRγδ+T细胞或者是CD4+T细胞,或者是CD8+T细胞。这些T细胞在抗禽艾美耳球虫感染中的作用与艾美耳球虫在鼠体内感染相比有所不同。研究表明,鸡感染堆型艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫激活的T细胞的某些种类可被单克隆抗体选择性的抑制而衰竭,这也说明CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗感染免疫中有不同的作用,这就使得感染不同的球虫种,卵囊的产量也不同。鸡感染堆型艾美耳球虫,CD4+T细胞的衰竭在初次感染或人工感染中不会明显增加卵囊产量。此外,攻毒感染比初次感染要产生较少的卵囊。这些研究结果表明,CD4+T细胞不是抗堆型艾美耳球虫感染中的重要的免疫效应器。另一方面,在柔嫩艾美耳球虫初次感染中,CD4+T细胞的衰竭会导致卵囊产量的明显增加,而攻毒感染不会增加,表明CD4+T细胞在抗柔嫩艾美耳球虫初次感染中发挥重要作用。不论是柔嫩艾美耳球虫初次感染,还是堆型艾美耳球虫初次感染,CD8+T细胞的衰竭会明显减少卵囊产量。理论上讲,这种效应是由于子孢子运输载体———CD8+T细胞数量的减少引起的。但是,攻毒感染后,CD8+T细胞的衰竭会明显增加卵囊产量。这些结果表明CD8+T细胞也许不是抗初次感染的效应器,而在再次感染免疫中是必要的效应器。CD8+T细胞在柔嫩艾美耳球虫感染的保护性免疫中的重要性,可以通过初次感染期间它在外周血中数量上短暂的急剧增加的现象来解释。实际上,鸡体内的CD8+T细胞似乎在抗球虫感染的免疫中发挥双重作用,这是由于对双色免疫荧光染色感染的肠道取自遗传背景不同的对球虫敏感的鸡。初次感染堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫期间,共表达的TCRγδ和CD8+的T细胞数量在上皮内明显增加,这个地方就是子孢子侵入的部位,因此认为这些细胞是将子孢子从黏膜固有层转运到黏膜下层的载体,黏膜的CD8+T细胞在攻毒感染后,数量也会增加,这些细胞也经常与被感染细胞紧密相邻。理论上讲,这些CD8+T细胞是作为毒性细胞发挥作用的,通过帮助杀死被感染细胞的方式来清除寄生性虫体。球虫也可以侵入肠黏膜内的其他类型的白细胞。譬如,在嗜异性粒细胞内柔嫩艾美耳球虫的子孢子,在杯状细胞和肥大细胞内发现柔嫩艾美耳球虫的裂殖子。这些结果与禽类球虫病的免疫控制有无关联性尚不清楚。类似于NK细胞(细胞表面表达低水平的CD8+和四己糖神经节苷脂)在初次感染的早期数量有所增加。这些细胞在体外表现NK细胞的活性,也许参与免疫监督。初次和再次感染中,黏膜巨噬细胞可以吞噬子孢子,但是这种活性似乎在免疫鸡群中也不会增强。巨噬细胞也许参与子孢子的转运。活化的巨噬细胞可产生很多不同的炎症细胞因子,这些因子可以调控细胞免疫反应。黏膜肥大细胞数量在感染堆型艾美耳球虫的早期和晚期增加,但是这些细胞对产生有效的免疫反应和抗病性的作用尚不清楚。白细胞合成和分泌的细胞因子在抗感染的免疫反应期间起着重要的调控作用。在禽类的球虫病中,感染部位的宿主细胞可以产生IFN#γ,IFN#γ的释放可以引起对球虫抗原的T细胞反应。用重组鸡的IFN#γ治疗球虫感染鸡群可以改善体增重。肿瘤坏死因子(TNF)是一种炎症因子,由激活的巨噬细胞分泌。从感染鸡群的受刺激巨噬细胞和血清中可以检测到TNF#α样活性。用TNF#α治疗感染鸡群会加重体增重的抑制作用,而用TNF#α的多克隆抗体治疗会部分改善体增重。这些结果表明TNF#α在禽类感染球虫病的病理生理学方面发挥重要作用。自由基包括活性氧族和NO+,都是活化的巨噬细胞和其他吞噬细胞的分泌产物,对细菌和一些寄生虫有毒性作用。因此,这些因素在抗感染免疫中发挥重要作用。NADPH氧化酶在黏膜中的活性很强,可以产生超氧化物(如O2+)和一定水平的NO2-+NO3-。NO+稳定的代谢产物,在巨型艾美耳球虫感染的鸡群,不同的时间段产量不同,如感染后的1、3和6d,NADPH氧化酶达到最大量;NO2-+NO3-于感染后6d达到最大量。这些参数时间上的差异表明不同的细胞类型参与了这一过程。血浆中NO2-+NO3-的水平在初次感染堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫后大约第6d明显升高,但是再次感染就不会出现这一现象。这一结果表明,NO+的产量与先天抗性的关系,与获得性抗球虫免疫反应相比更加相关。初次感染柔嫩艾美耳球虫期间,NO+的产量与抗性之间存在着一种遗传关系。最近的体外研究表明,IFN#γ刺激的巨噬细胞可以产生NO,可以抑制柔嫩艾美耳球虫在这些细胞内增殖。4球虫病的控制4.1严格控制猪、鸡的毒种和消毒液禽舍的环境中,这样就有大量繁殖的可能,很难使鸡群不受感染,尤其是在密集型饲养的鸡群中。卵囊很容易在禽舍的废物中孢子化。但是,它们也很容易被细菌、其他微生物和消毒液如氨水等杀死,一般3周以后它们的生存能力开始减弱或丧失。很多美国养殖场的管理者基本上都会清除禽舍内大的废物,让舍内通风2~3周,然后换上新的垫料,再引进雏鸡。此外,欧洲的一些国家和加拿大通常在2批鸡期间进行禽舍的彻底消毒清洗。还有一些措施如要求饲养员进出禽舍换衣服以减小感染性卵囊的传播,这样做可以有效地降低球虫病发生的危险性。严格的生物安全制度在肉鸡养殖中也是至关重要的。4.2抗菌类药物添加剂的有效应用对于保证养禽业的健康发展起着重要的作用。这些抗球虫制剂可分为以下几类:(1)化学药物。具有特异性作用于虫体的某一代谢途径而发挥抑制或杀灭作用,如安普罗铵、氯吡多、癸氧喹酯、溴氯哌喹酮等。(2)离子载体类多聚物。如莫能菌素、拉沙里菌素、盐霉素、甲基盐霉素、马杜拉霉素,这些药物可通过改变离子运输方式和破坏渗透平衡来抑制虫体的代谢途径。离子载体类多聚物是现在抗球虫药的主流。但是,抗球虫药的耐药性问题包括离子载体类药物已经成为当前最困难的问题。为了尽可能减小抗药性的影响,一些养殖者采取轮换用药策略和联合用药方案或者穿梭用药。这些方案的使用要根据季节条件和不同球虫的流行情况而定。4.3虫病的测定因此,疫苗也就能够代替药物作为控制球虫病的一种方法。在过去的几十年中,一直在努力研制不同类型的疫苗,但是进展比较缓慢,对疫苗研究的热点也在于此。4.3.1抗感染的基因表达过去的10年间,很多研究都集中在重组疫苗的研制上,尽管到现在为止还没有一个应用于商业,但这些研究结果已经用于阐明宿主与球虫之间相互作用的复杂的本质。重组疫苗研制的主要障碍是缺乏虫种的交叉免疫保护。当然还有一些其他的因素,其中最重要的是保护性抗原的鉴定。比如从很多不同种和不同发育阶段鉴定了29个编码产免疫的DNA序列。这些抗原中的多数是与表面蛋白或与细胞器如微线体、棒状体和折光体有关的内部抗原,如最近报道的存在于柔嫩艾美耳球虫的内源性发育阶段的一个识别单个抗原表位的低分子量抗原。一些代谢抗原,如发育阶段子孢子抗原、裂殖子抗原和配子体抗原,都可引发不同程度的保护性免疫反应。球虫疫苗产生抗感染的运输机制仍有待确定。艾美耳球虫的免疫原性的抗原可被制成乳化的分离蛋白口服,重组抗原借助活载体如非致病性的大肠杆菌、鼠伤寒血清型沙门氏菌、痘病毒、鸡痘病毒和火鸡疱疹病毒口服,或者用质粒DNA直接注射,都取得了不同程度的成功。需要进一步研究来确定疫苗是如何作用于细胞免疫效应系统,来确定宿主针对每一种寄生虫产生的独特的免疫反应。因为T细胞激活抗原是与产生保护性免疫反应最相关的,T细胞增殖试验和INF#γ的产生被用于筛选抗柔嫩艾美耳球虫感染的保护性抗原。引起T细胞高度增殖和巨噬细胞高度活化的抗原作为疫苗免疫鸡群,攻毒后可以产生很低的病变记分。4.3.2以免疫后攻毒、以抗球虫为主的多价免疫疫苗在过去的50年间,活疫苗也在一定程度上应用于控制球虫病。这些活虫苗在体内产生少量的卵囊并逐渐加强宿主的免疫性。主要用于保护种鸡和产蛋鸡。近年在肉鸡上的应用呈上升的趋势。活疫苗包括弱毒苗和强毒苗。Paracox和Livacox都是弱毒苗,所有的球虫疫苗都对药物敏感。Coccivac和Immucox每一种都是由7个球虫毒株构成。这4种疫苗已在国内外商业鸡场广泛应用。Bedrnik对这4种疫苗进行了比较。这些疫苗于孵出后第1周内口服接种,在较好的饲养条件下可产生稳固的免疫力。因为活疫苗都是多价苗,对其效果的好坏需要不同的抗球虫试验来验证。标准方法是以免疫后攻毒试验鸡的体增重率为基础,进而考查病变积分的减少和卵囊产量的降低。弱毒疫苗的优点是虫种本身具有很低的繁殖潜能,这样可以避免感染的特异肠道黏膜部位因繁殖数量多而出现拥挤的现象,从而以最小的组织损伤来引起最佳免疫性的建立。药物敏感株和野生田间株在体内杂交,可以降低田间株的毒力和对药物的抗性。这样,通过活疫苗的轮换应用可以延长抗球虫药的使用期限。Coccivac和Immucox2种疫苗也可用于肉鸡,尤其在美国和加拿大应用广泛。此外,应用活疫苗也有一定的风险,如散播到环境中将污染环境。尽管如此,研究试验表明这种类型的疫苗如Immucox与用化学药物治疗相比,能够产生同样或较好的效果,原因可能是这种方法确保了鸡群体内总是带有少量的卵囊以持续刺激机体的免疫系统。球虫的抗原性随着地域的不同而不同。因此,在将疫苗大规模应用于鸡群前,筛选出抗地域性虫种的弱毒疫苗尤为重要。分离具有免疫差异的虫株可作为地域特异性活疫苗的候选疫苗。活疫苗也可以通过与抗药虫株杂交而得到改良。在平养试验中,用耐药虫株免疫1日龄的肉仔鸡,可以完全抵抗同种球虫的感染。当大规模免疫鸡群时,获得免疫的鸡与对照组相比仍然表现出很低的饲料转化率和几乎可以忽略的体增重。因此,这种类型的疫苗具有延长抗球虫时间的潜力,在耐药虫株存在的地域和球虫病没有很好控制的地域使用仍然是一个问题。4.3.3堆型艾美耳球虫和评论员的免疫作用细胞因子是抗感染免疫反应的重要调节因子,因此细胞因子是帮助疫苗提高免疫刺激的自然免疫佐剂的来源。IFN#γ作为抗球虫疫苗可能的佐剂已引起广大学者的关注。鸡的IFN#γ基因已经被克隆。重组的IFN#γ已经表现出在感染堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫期间体增重下降减缓,堆型艾美耳球虫卵囊产量减少。细胞因子体内使用的一个问题是,它们很快被降解和清除。以DNA形式或细菌、病毒载体形式可以克服这一问题,并可以大规模使用。例如,堆型艾美耳球虫裂殖子的重组蛋白3#1E,同时存