四氯化碳诱导大鼠肝纤维化与尿激酶型纤溶酶原激活物基因表达的关系

四氯化碳诱导大鼠肝纤维化与尿激酶型纤溶酶原激活物基因表达的关系

骨髓源性肝干（nbsc）来源丰富，生长能力强，外生物质能力强，肝系细胞分工能力强，是治疗肝脏疾病理想的靶细胞。然而,由于迄今尚未发现BDLSC区别于骨髓来源其他干细胞的特征性表面标志,故无法有效地从骨髓细胞中获得纯化的BDLSC。本研究根据肝损伤时肝脏再生的机制,拟从淤胆型肝损伤早期大鼠骨髓提取骨髓细胞,通过体内病理环境的筛选作用后,再经体外淤胆血清和肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)的筛选、诱导分化及扩增,从而快速、高效地获取BDLSC。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator,uPA)在降解纤维和逆转肝纤维化中起重要作用。本研究将携带人uPA基因的腺病毒(adenoviruscarryinghumanuPAcDNA,AduPA)体外转染BDLSC,移植入肝纤维化大鼠体内,评价转基因BDLSC对肝纤维化的疗效,旨在为其临床应用治疗肝纤维化提供理论依据和实践基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物动物纯系Fisher344雄性大鼠10只,雌性大鼠36只,体质量150～180g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号:SCXK(沪)2003-0003;使用许可证号:SYXK(沪)2003-0031。1.1.2dmem/fps2基础培养液TRIzol(Invitrogen),M-MLV逆转录酶(Promega),TaqDNA聚合酶(Takara),DMEM/F12基础培养液含10%胎牛血清(Hyclone),20mmol/LHepes、1×10-7mol/L地塞米松、10mg/L胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠混合物(insulin-transferrin-sodiumselenitemediasupplement,ITS)、25μg/LHGF(PeproTech)。1.2方法1.2.1血清除菌、除菌将大鼠胆总管结扎10d后取骨髓细胞前经下腔静脉取血,全血置37℃水浴中30min,离心后吸取上层血清,过滤除菌,56℃中灭活30min,-20℃中保存备用。病理条件培养液:将DMEM/F12基础培养液中10%胎牛血清换为5%的自制淤胆血清。1.2.2林勇博士惠赠乘子人pAduPA重组腺病毒质粒由第二军医大学附属长征医院林勇博士惠赠。利用脂质体转染法在293细胞中包装和扩增,用氯化铯梯度离心纯化,AduPA最终病毒滴度可达3×1012pfu/mL。1.2.3细胞分离和接种取胆总管结扎10d的F344雄性大鼠,乙醚麻醉,背位固定大鼠,常规消毒铺巾,经下腔静脉取血(用于制备淤胆血清)后,无菌解剖双侧股骨和胫骨,去除骨上附着的软组织,离断两端骨骺,用5mL注射器吸取无血清培养液,反复将骨髓冲出,吹打成单细胞悬液。将收集的细胞悬液缓慢加在1.077g/cm3的淋巴细胞分离液上部,1500×g离心30min,用吸管将分界层细胞吸入至另一无菌离心管中。用PBS洗涤两次,将DMEM/F12基础培养液按2×105/cm2密度接种细胞于T-25cm2培养瓶中。72h后首次换液,换为病理条件培养液持续培养,以后每隔3～4d换液,7～10d后首次传代。1.2.4pcr检测指标取培养2周的大鼠骨髓细胞以5×105/孔接种于6孔板,培养24h后收集细胞,用TRIzol试剂提取细胞总RNA。取1μg细胞总RNA用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链,以2μL逆转录产物为模板进行PCR扩增。检测白蛋白(albumin,ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)、细胞色素P4502B1(cytochromeP4502B1,CYP2B1)、转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)、肝细胞核因子-1α(hepatocytenuclearfactor-1α,HNF-1α)、肝细胞核因子-3β(he-patocytenuclearfactor,HNF-3β)及白蛋白转录因子CCAAT/增强结合蛋白α(CCAAT/enhancerbindingproteinα,C/EBPα)mRNA的表达。各指标引物序列、退火温度、扩增产物长度及PCR反应条件见参考文献。各RT-PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.5体外细胞移植后细胞的检测将雌性F344大鼠随机分为4组,每组9只。①正常组:皮下注射等量橄榄油。②模型组:予40%CCl4(CCl4∶橄榄油=2∶3,3mL/kg)皮下注射,每3天注射1次,首次剂量加倍,共注射18次,并经尾静脉注射等量生理盐水。③BDLSC组:造模方法与模型组相同,于实验第4周经尾静脉输入2×106BDLSC;④BDLSC-uPA组:造模方法与模型组相同。AduPA以感染复数(multiplicityofinfection,MOI)500转染BDLSC,72h后收集BDLSC溶于生理盐水,于实验第4周经尾静脉导入2×106转基因BDLSC。细胞移植后应用免疫抑制剂他克莫司灌胃,每天0.1mg/kg。各组大鼠于第8周处死,留取血清及肝组织。1.2.6肝组织抗氧化活性的pcr检测①PCR法检测雄性大鼠BDLSC的导入:按Qiagene试剂盒说明书提取各组大鼠肝组织DNA,以0.7%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪检测所提取的DNA纯度和浓度。取2μL所提取的各组肝组织DNA为模板进行SryPCR扩增,扩增片断长度为329bp;引物序列为5′-GCTGATATCACTGGTGACCGA-3′,5′-AATGCCATAAGAATGCGAGTAG-3′。PCR反应条件:94℃中预变性5min后进入PCR反应循环:94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,共32个循环;循环结束后在72℃中延伸7min。同时以GAPDH在相同反应条件进行PCR反应作为内参照。各组PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。②Westernblot分析:提取各组肝组织总蛋白分别标准定量后,各取20μg于10%SDS电泳分离蛋白,转蛋白至PVDF膜。使用5%BSA/TBST封闭1h,加入一抗(uPA1∶200,β-actin1∶1000稀释),于4℃中孵育过夜。次日用TBST洗涤后,与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000稀释)在室温下孵育2h,TBST洗涤。用SuperSignal®westPic化学发光试剂检测,胶片曝光,经显影、定影后结果扫描入计算机。1.2.7透明质酸、型前胶原、alb的检测取各组大鼠血清1.5mL,使用自动生化分析仪检测肝功能主要指标,丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)、总胆红素(totalbilirubin,TBIL)、凝血酶原时间(prothrombintime,PT)及ALB。采用放射免疫法检测透明质酸(hyaluronicacid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)和Ⅲ型前胶原(procollagenⅢ,PCⅢ)水平。采用碱水解法测定肝组织Hyp的含量。1.2.8肝组织切片染色以福尔马林固定矢状肝组织切片,常规石蜡包埋。制备5μm厚肝组织切片用于HE染色和天狼星红(Siriusred)染色,应用Image-Proplus5.1图像分析软件对胶原染色面积进行定量。1.2.9数据统计分析计量资料以x±sx±s表示,采用SPSS12.0统计软件包进行单因素ANOVA或Kruskal-Wallis检验分析;等级分组资料采用非参数统计,进行Ridit检验。P<0.05表示有统计学差异。2结果2.1细胞分化和分化采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离胆总管结扎后10d大鼠的骨髓单个核细胞,分离后立即用含HGF和10%胎牛血清为主的DMEM/F12培养液孵育,培养48h,出现贴壁细胞,胞体伸展。72h后细胞大部分贴壁,换病理条件培养液后出现部分细胞凋亡脱落,残留细胞逐步分化形成肝细胞样集落,继续分化扩增10～14d后可见分散的较大的克隆样增殖的肝细胞样集落,细胞呈多边形或不规则形(图1)。RT-PCR法检测培养2周的骨髓细胞,显示胚胎期肝细胞标志ALB、AFP、CK18、CYP2B1、TTR、HNF-1α、HNF-3β、C/EBPαmRNA的表达均为阳性(图2)。2.2不同浓度正模间肝组织sry基因表达的比较经雄性大鼠Y染色体性别决定基因SryPCR检测发现:以正常雄性大鼠作为阳性对照,BDLSC组和BDLSC-uPA组肝组织均呈Sry基因阳性表达,而正常组和模型组则无(图3);同时,Westernblot检测发现只有BDLSC-uPA组有外源导入的人来源的uPA蛋白表达(图4)。2.3大鼠血清相关指标的变化大鼠血清肝功能检测结果显示:与正常组相比,肝纤维化模型组血清ALT、AKP和TBIL水平均显著升高,PT时间明显延长,ALB水平则显著下降。与模型组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清ALT、AKP和TBIL水平均有不同程度的降低,PT时间缩短,ALB水平升高(P<0.05)(表1)。与肝功能检测变化一致,大鼠血清细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)水平也呈相似改变:与正常组相比,肝纤维化模型组大鼠HA、LN和PCⅢ水平均明显升高,BDLSC-uPA组大鼠HA、LN和PC水平较模型组和BDLSC组均呈显著下降(P<0.05)(表2)。Hyp检测结果与ECM水平变化相似:BDLSC-uPA组大鼠Hyp含量较模型组和BDLSC组均呈显著下降(P<0.05)(表3)。2.4组织病理学检测各组大鼠肝组织切片HE染色结果显示:模型组肝组织呈广泛而严重的肝细胞脂肪变性坏死,门脉及中央静脉周围炎症细胞浸润,汇管区扩大,大量纤维组织增生,而BDLSC-uPA组肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润及纤维组织增生明显减轻(图5A)。Siriusred染色结果相似:模型组肝组织胶原等结缔组织广泛沉积,并相互交连呈网状;而BDLSC-uPA组肝组织胶原沉积明显减轻(图5B)。计算机扫描分析显示:正常组、模型组、BDLSC组和BDLSC-uPA组肝组织胶原染色面积分别为(0.12±0.03)%、(14.49±1.40)%、(8.25±0.82)%和(5.12±0.40)%,经统计学比较模型组肝组织胶原染色面积均明显大于其他三组(P<0.01);而BDLSC-uPA组肝组织胶原染色面积较BDLSC组明显减轻(P<0.01)。3肝髓细胞培养对肝胞功能的影响肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,以ECM在肝内过多沉积为主要特征。由uPA、纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)构成的级联激活反应是调节ECM沉积的主要途径。uPA可通过激活MMPs,促进ECM成分降解。在急性肝损伤时可加速局部坏死组织和纤维组织成分清除,降低炎症反应;在已形成的肝纤维化中则可降解ECM,逆转肝纤维化。此外,uPA还可通过活化HGF促进肝干细胞分化和肝细胞再生。肝干细胞与uPA基因治疗联合应用时,uPA参与清除坏死组织及降解纤维间隔,促进BDLSC种植、增殖和分化、重建正常的肝组织结构,将有利于肝组织形态和功能恢复。这些作用在纤维分隔较严重的阶段更为重要,同样也是单纯干细胞移植治疗难以实现的目标,同时BDLSC作为uPA的载体细胞,避免了单纯uPA基因治疗的免疫原性和毒性,延长目的基因的表达时间。本研究中首先分离胆总管结扎10d大鼠的骨髓细胞,经体内外筛选培养后,可见培养细胞表达胚胎期肝细胞的标志ALB、AFP和CK18,肝干细胞分化所必需的转录因子HNF-1α、HNF3β、C/EBPα,肝细胞特征性功能蛋白CYP2B1、TTR。结果提示:肝损伤早期,体内可能存在有利于BDLSC增殖和分化的内、外分泌机制,参与构成促进肝干细胞增殖和分化的微环境,从而在体内外均促进骨髓内BDLSC干细胞亚群的克隆增生。此外,本研究采用CCl4建立大鼠肝纤维化模型,一方面由于CCl4诱导的肝纤维化在病理上与人相似,另一方面,CCl4造成一定程度的肝损伤和肝纤维化,有利于BDLSC在肝脏的种植。Terai等将绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因小鼠的骨髓细胞经尾静脉导入CCl4肝纤维化小鼠模型中,4周后发现受体肝脏中有26%供体来源细胞,种植率远高于其他肝损伤动物模型。本研究采用国内外常用的交叉性别移植来验证供体细胞的导入,即用雄性大鼠来源的BDLSC输入雌性肝纤维化大鼠,通过PCR法和Westernblot法检测发现BDLSC组和BDLSC-uPA组肝组织均呈Sry基因阳性,且只有BDLSC-uPA组能检测到导入的人来源的uPA蛋白的表达。结果提示:转基因BDLSC能在CCl4诱导的纤维化肝脏中有效种植且表达