第六章 外源基因的表达1

第六章外源基因的表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。

基因表达：克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。

最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。1基因表达的机制

2基因表达的调控元件

3外源基因表达系统

4基因表达产物的检测和分离纯化第六章外源基因的表达1基因表达的机制1.1外源基因的起始转录1.2mRNA的延伸和稳定性1.3外源基因mRNA的有效翻译1.4表达蛋白在细胞中的稳定性1.5目的基因沉默1.1外源基因的起始转录

外源基因在宿主细胞中有效表达是基因工程的核心问题外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子诱导型启动子：组成型启动子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子如T7噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。1.2mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。

mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体菌。真核细胞来说，则需要考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。1基因表达的机制1.1外源基因的起始转录1.2mRNA的延伸和稳定性1.3外源基因mRNA的有效翻译1.4表达蛋白在细胞中的稳定性1.5目的基因沉默1.3外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。真核细胞mRNA的5‘非翻译区含有共同的序列5’-CCA（G）CCATGG-3‘。不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（majorcodon）稀有密码子（rarecodon）如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的稀有密码子，其表达效率就低。1基因表达的机制1.1外源基因的起始转录1.2mRNA的延伸和稳定性1.3外源基因mRNA的有效翻译1.4表达蛋白在细胞中的稳定性1.5目的基因沉默1.4表达蛋白在细胞中的稳定性

外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素。（1）构建融合蛋白表达系统。（2）构建分泌蛋白表达系统。

（3）构建包涵体表达系统。（4）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。1基因表达的机制1.1外源基因的起始转录1.2mRNA的延伸和稳定性1.3外源基mRNA的有效翻译1.4表达蛋白在细胞中的稳定性1.5目的基因沉默1.5目的基因沉默基因沉默的作用机制位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：基因沉默（genesilencing）是导致外源基因不能正常表达的重要因素。共抑制（cosuppression）是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。1基因表达的机制

2基因表达的调控元件

3外源基因表达系统

4基因表达产物的检测和分离纯化第六章外源基因的表达2基因表达的调控元件2.1启动子2.2增强子2.3终止子2.4衰减子2.5绝缘子2.6反义子2.1启动子启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。*启动子的特征序列特异性方向性位置特性种属特异性TTGACATATAAT转录起始点5’3’-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45原核生物的PromoterRNApolIITFIIDTAFs

TBPPolIII启动子

TFIIIBTFIIICTBPRNApolIII

PolI启动子RNApolISL1

UBF1

TBPPolII启动子转录起始点TATA

2基因表达的调控元件2.1启动子2.2增强子2.3终止子2.4衰减子2.5绝缘子2.6反义子2.2增强子增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。增强子的特性：双向性。重复序列。增强子行使功能与所处的位置无关。特异性。增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。2基因表达的调控元件2.1启动子2.2增强子2.3终止子2.4衰减子2.5绝缘子2.6反义子2.3终止子本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。2.4衰减子

衰减子（attenuator）是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终止信号序列，又称弱化子。弱化子色氨酸浓度高时色氨酸浓度低时2.5绝缘子绝缘子（insulator）：既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；2.6反义子反义RNA（antisenceRNA）：同某种天然mRNA反向互补的RNA分子称为反义RNA。反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。反义子在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。反义RNA作为调节物质的作用机制：与mRNA上核糖体结合位点结合，使得翻译不能起始；与mRNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物；与转录产物结合，使转录提前终止。1基因表达的机制

2基因表达的调控元件

3外源基因表达系统

4基因表达产物的检测和分离纯化第六章外源基因的表达3外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统基因表达载体受体细胞基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。3.1大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌——革兰氏阴性细菌；目前应用最广泛的基因表达系统。大肠杆菌表达系统的优越性：①掌握了大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有深刻了解；②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；③实验已经证明，许多克隆的真核基因，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。3.1.1大肠杆菌基因表达载体3.1.2宿主菌3.1.3常见的大肠杆菌表达系统3.1.4外源基因在大肠杆菌表达的形式3.1.5外源基因的高效表达策略3.1.1大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统（1）DNA复制及重组载体的选择系统复制子常见的复制子pMB1、p15A、ColE1:松弛复制型，每细胞质粒拷贝数10～20个。pSC101:严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。选择标记绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，多为氨苄青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等。原因：许多质粒本身带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。大肠杆菌基因表达载体的3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统（2）外源目的基因的转录系统包括启动子和转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，在不同的宿主中表达效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。启动子外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。选择可调控的强启动子是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT转录终止子一方面，它使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量；另一方面，正常转录终止子的存在能够防止产生不必要的转录产物，有效地控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统（3）蛋白质的翻译系统在原核生物中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码子于SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5′端非翻译序列和蛋白编码区的5′端序列等。蛋白质的翻译系统核糖体结合位点（SD序列）翻译起始密码子翻译终止密码子核糖体结合位点（RBS）SD序列与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合，它对mRNA的翻译起着决定性的作用。大肠杆菌SD序列的碱基组成、与起始密码子之间的距离和碱基组成对保证准确和高效翻译很重要。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCA翻译起始密码子AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）翻译终止密码子翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。主要密码子和稀有密码子如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的稀有密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表