不同运动方式对后路固定大鼠腓肠肌湿重比、单收缩最大张力、肌肉生长抑制素gdf-8mrna表达的影响

不同运动方式对后路固定大鼠腓肠肌湿重比、单收缩最大张力、肌肉生长抑制素gdf-8mrna表达的影响

由于四肢固定，骨骼肌肉的肌腱变形是康复医学面临的一个难题。早期体育不仅可以预防早期肌肉萎缩的发生，而且可以促进废除后肌肉收缩的恢复。它具有明显的效果和易于操作的特点。然而，关于肌肉萎缩的起源原因、发生机制和促进肌肉收缩恢复的机制尚不完全清楚。实验证明肌肉生长抑制素(GDF-8)参与了骨骼肌疾病的发生,是影响骨骼肌生长发育的重要候选基因之一,其基因多态性与人的运动能力密切相关。本研究通过固定大鼠后肢建立废用性肌萎缩动物模型,观察不同运动方式(跑台、游泳)下废用性肌萎缩大鼠腓肠肌单收缩最大张力和GDF-8mRNA表达的变化,探讨GDF-8在废用性肌萎缩的产生和运动恢复中所起的作用。1材料和方法1.1动物饲养分组:单笼饲养,自然恢复2月龄雄性SD大鼠40只,体重245.14±12.02g(上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供),随机分为对照组、模型组、游泳组、跑台组和自然恢复组,每组8只。大鼠单笼饲养,自由进食、饮水,以国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。环境温度18~24℃,相对湿度45%~55%,每天光照时间12h,大鼠饲养笼具、饮水瓶定期消毒,使用垫料均经高压灭菌。1.2大、中、小强度游泳、跑台运动对照组大鼠进行笼养,不做任何处理。其他4组按照Josza等的方法,将大鼠右后肢用可塑性石膏采用足跖管型固定至膝上1cm处,膝关节固定于屈曲位100°,踝关节固定于跖屈位60°,以便小腿的肌肉保持于松弛位,共4周。期间每天检查固定情况,依大鼠啃咬、淤血或固定不适的情况随时进行调整。石膏浸液掺入苦味酸,以防大鼠啃咬。游泳组、跑台组于右后肢固定4周后解除固定,先笼养2天,再进行2天适应运动,然后分别进行3周小强度游泳、跑台运动。游泳组大鼠适应性运动时间为每天30分钟,水温30~32℃;正式运动时间为每天60分钟,每周6天。跑台组适应性运动时跑速为18米/分,每次30分钟;正式运动时的跑速为20米/分,每次60分钟,每周6天。自然恢复组于右后肢固定4周后解除固定,再笼养3周。1.3大鼠的死、引分别在大鼠后肢固定4周前、后和再训练3周后,用天平称动物体重。模型组大鼠于右后肢固定4周后处死、取材。自然恢复组、游泳组、跑台组、对照组7周后同时处死、取材。以2%戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉大鼠,固定在鼠台上。由起点至止点完整解剖左、右后肢腓肠肌,去除肌肉上附着的组织后,在电子天平上称重,并计算固定侧肌湿重/对侧肌湿重,即右侧肌肉湿重/左侧肌肉湿重。1.4指标测定1.4.1初长度游离腓肠肌的远端,用丝线将其与张力换能器相连,使肌肉处于最适初长度。将刺激电极与腓肠肌表面接触,不断增加刺激强度,采用BL-420生物机能系统(成都太盟科技有限公司)记录腓肠肌单收缩的最大张力。1.4.2实时荧光定量pcr检测大鼠基因的表达取各组大鼠腓肠肌的外侧部100mg左右,Trizol抽提试剂盒提取腓肠肌总RNA,紫外分光光度计测定提取的总RNA的吸光度值。常规方法MLV逆转录酶合成cDNA,扩增反应在RocheDiagnostics产品LighterCycler2.0型荧光实时定量PCR仪上进行。应用TaKaRa公司SYBRGreenⅠ嵌合荧光RealTimePCR试剂盒,20μl反应体系包括SYBRPremixExTaq(2×)10μl,上下引物(10μM)各0.4μl和2μl待检cDNA。设计大鼠基因上下游引物,引物跨外显子,以保证在基因非多态区和用以排除RNA样本中可能存在的DNA污染,同时检测看家基因β-actin水平作为RNA定量标准。引物序列如下:GDF-8基因上游引物:5’CAAGCGGATGGAAAGCC3’;下游引物:5’TGCCAAATACCAGTGCC3’。看家基因β-actin上游引物:5’CGTTGACATCCGTAAAGACC3’;下游引物:5’TAGAGCCACCAATCCACACA3’。反应条件:95℃预变性30秒后进入PCR循环,循环参数为95℃变性5秒,55℃退火20秒,72℃延伸15秒,扩增40个循环,在延伸阶段检测荧光信号。然后95℃0秒,65℃30秒,95℃0秒进行熔解曲线分析。根据2-ΔCt值计算mRNA表达的相对定量。1.5显著性检验所有数据用MicrosoftExcel处理,结果用平均值±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,组间差异采用t检验,P<0.05为具有显著性差异,P<0.01为具有极显著性差异。2结果2.1各组大鼠体重、体重变化比较如表1所示,固定前各组大鼠体重均无显著性差异,固定4周后模型组与对照组、游泳组、跑台组和自然恢复组相比,体重显著降低(P<0.01);训练3周后,跑台组体重显著低于自然恢复组、游泳组(P<0.05)。2.2各组肠肌的3gf-8mna表达比较与对照组相比,模型组的固定侧肌湿重/对侧肌湿重和单收缩最大张力均显著降低(P<0.01),腓肠肌GDF-8mRNA表达显著升高(P<0.05)。训练3周后,游泳组、跑台组的损伤侧肌湿重/对侧肌湿重、腓肠肌单收缩最大张力高于自然恢复组,但无统计学意义(P>0.05);游泳组、跑台组腓肠肌GDF-8mRNA表达低于自然恢复组,其中跑台组显著低于自然恢复组(P<0.05)。3肉的恢复及肌肉生长抑制素的应用肢体制动、长期卧床等均可引起骨骼肌发生废用性萎缩,管型石膏固定肢体引起肌肉萎缩最接近临床肢体制动造成的废用性肌萎缩。反映骨骼肌萎缩程度的简易指标是靶肌湿重比,即固定侧肌湿重/对侧肌湿重,湿重比越小,表示肌萎缩越明显。本研究发现,模型组固定侧肌湿重/对侧肌湿重显著低于对照组,表明4周后肢固定造成大鼠出现废用性肌萎缩,同时发现废用性肌萎缩大鼠的体重增长速率减慢,腓肠肌的单收缩最大张力显著降低,提示4周后肢固定抑制了大鼠的生长和肌肉力量的增长。有动物实验研究表明,适宜的体育运动促进了萎缩肌肉的恢复,是预防和治疗废用性肌萎缩的重要方式。Kannus等研究结果显示跑台运动提高了萎缩肌肉的毛细血管密度和肌纤维面积,其效果强于自然恢复。本研究结果显示,与自然恢复组相比,游泳组、跑台组的损伤侧肌湿重/对侧肌湿重、腓肠肌单收缩最大张力有升高趋势,但无统计学意义。1997年,McPherron等研究发现了一种分泌型生长、分化因子GDF-8,其在骨骼肌中特异性表达,对肌肉生长有负调控作用,该基因突变可导致骨骼肌肥大,因此称为肌肉生长抑制素。研究发现GDF-8mRNA和蛋白表达受肌肉负荷的影响,在失重、卧床等导致肌肉负荷降低的情况下,肌肉GDF-8mRNA表达升高。本研究采用石膏固定造成大鼠废用性肌萎缩模型,结果发现4周后肢固定引起肌肉承受负荷降低,腓肠肌GDF-8mRNA表达显著升高,提示GDF-8可作为评定废用性肌萎缩程度的参考指标。Wehling等报道大鼠在10天的后肢悬吊过程中每天进行30分钟跑台运动,跖肌肌肉重量与对照组相比无显著性差异,而GDF-8mRNA表达明显低于对照组。Roth等研究发现年轻个体经过9周抗阻训练,力量、骨骼肌体积增大的同时,肌肉生长抑制素表达显著降低。以上结果提示,运动提高了肌肉负荷,从而引起GDF-8mRNA表达降低,故GDF-8可能参与了运动改善废用性肌萎缩的恢复机制。本研究结果