egcg对人肝细胞损伤的保护作用

egcg对人肝细胞损伤的保护作用

肝损伤是由多种肝病引起的共同病理基础。肝肿瘤的坏死、炎症反应和释放因素与各种肝脏疾病的形成有关。近年的研究表明,绿茶中的茶多酚具有广泛的药理作用,主要集中在抗肿瘤、抗氧化、保护心血管及抗衰老等方面。而近年的研究发现,茶多酚中含量最多、抗氧化能力最强的成分EGCG对肝细胞损伤具有一定的保护作用。笔者拟观察EGCG对CCl4所致的人肝细胞损伤的保护作用,并初步探讨其作用机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1细胞L02:人肝细胞,由中山大学药学院动物实验中心提供。1.1.2测试对象EGCG(纯度≥98%),由中山大学药学院中药与海洋药物研究室提供。1.1.3培养基和试剂维生素E[广州星群(药业)股份有限公司;批准文号:国药准字H44023178;批号:20041205];胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批号:051220);RPIM1640培养基(美国Gibco公司,CatNO.31800-022,批号:2535081);胰蛋白酶(1∶250)(Sigma公司),AMRESCO分装;二甲基亚砜(DMSO),AMRESCO分装0231,纯度>99.0%。谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(批号:060301)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号:060131)均由中生北控生物工程公司提供。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号:20060811);丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)试剂盒(批号:20050809)。其余试剂均为国产分析纯。1.1.4仪器、试药与仪器TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂);SW-CJ-2F型双人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);HHS-4型电热恒温水浴锅(上海沪南科学仪器联营厂);7550紫外可见光光度计(惠普上海分析仪器有限公司);SQLF37XB倒置显微镜(LeicaPotugal公司);ThermoLabsystemsMultiskanMK3GSX-230酶标仪[JOLImark(映美)公司]。1.2方法1.2.1ccl4培养基EGCG用PBS配制成溶液。阳性药:VitE用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成溶液(DMSO浓度小于0.5%)。试验中分别设正常组、模型组、EGCG组(1.00×10-4、5.00×10-5、2.50×10-5、1.25×10-5mol/L),以及阳性药(1.00×10-4mol/L)组共7个组。CCl4造模液的配制:以CCl4原液4.82ml溶于DMSO5.18ml制成5000mmol/L的CCl4液,以含10%胎牛血清的1640液稀释,配成含10mmol/LCCl4的1640培养基。H2O2造模液的配制:以30%H2O2溶液22μl溶于9.978ml的1640培养液,制成20mmol/L的H2O2液。1.2.2dmso正常组和模型组的制备将生长融合的人肝细胞(L02)以1×105个/孔的浓度接种于96孔板,待细胞贴壁后,吸弃培养液,各组分别按“1.2.1”相应浓度给予含样品培养液200μl,正常组和模型组给予等量含DMSO的培养液为对照。培养24h后,除模型组外其余各组换新鲜1640培养液200μl,模型组给予等量上述CCl4造模液,作用4h后,各组吸取细胞培养上清液,换新鲜培养液继续培养12h,吸取培养液,按试剂盒操作方法测定上清液中ALT、LDH的含量。1.2.3dmso的dmso活性将生长融合的人肝细胞(L02)以1×105个/孔接种于96孔板,待细胞贴壁后,吸弃培养液,各组分别按“1.2.1”相应浓度给予含样品培养液200μl,正常组和模型组给予等量含0.5%DMSO的培养液为对照。培养24h后,除模型组外其余各组换新鲜的1640培养液200μl,模型组同时给予等量CCl4造模液,作用4h后,吸取细胞培养上清液,换新鲜培养液继续培养12h,各组分别吸取细胞培养上清液,按试剂盒操作方法测定上清液SOD含量,然后每孔加蒸馏水150μl,-75℃反复冻融细胞4次,取细胞悬液按试剂盒操作方法测定细胞内MDA含量。1.2.4织物织物的制备将生长融合的人肝细胞(L02)以1×105个/孔接种于96孔板,待细胞贴壁后,吸弃培养液,各组分别按“1.2.1”相应浓度给予含样品培养液190μl,正常组和模型组给予等量含0.5%DMSO的培养液为对照。培养24h后,各组给予培养液20μl,造模组给予H2O2造模液20μl(终浓度相当于200μmol/L)。作用2h后,各组每孔加MTT20μl,4h后,小心吸弃上清,每孔加DMSO150μl,振摇10min,使沉淀充分溶解,酶标仪在492nm处测定各组吸光度(A)值。1.2.5织物织物制备将生长融合的人肝细胞(L02)以1×105个/孔接种于96孔板,待细胞贴壁后,吸弃培养液,各组分别按“1.2.1”相应浓度给予含样品培养液180μl,正常组和模型组给予等量含0.5%DMSO的培养液为对照,培养24h后,各组给予培养液20μl,造模组给予H2O2造模液20μl(终浓度相当于200μmol/L)。作用2h后,吸取细胞培养上清液,换新鲜培养液继续培养12h,吸取培养液,按试剂盒操作方法测定上清液中AST、LDH含量。1.3统计学处理方法试验数据均采用SPSS11.0统计软件进行统计,结果用平均值±标准偏差即MEAN±S.D.表示,组间差异比较采用独立样本t-test分析,计算P值。2结果与分析2.1材料保护用于保护ccl4人类肝脏损伤l022.1.1对小鼠细胞上清液相关指标的影响细胞培养液中加入CCl4后,肝细胞出现核溶解,细胞膜破损,细胞结构不清,上清液上有少量脱落细胞。与正常对照组相比,肝细胞损伤模型组培养上清液中ALT、LDH含量明显升高(P<0.001,P<0.01);EGCG1.25×10-5、2.50×10-5、5.00×10-5、1.00×10-4mol/L剂量组的细胞上清液中ALT含量与模型组相比明显降低(P<0.05,P<0.001),呈一定的剂量依赖性;且EGCG2.50×10-5、5.00×10-5、1.00×10-4mol/L剂量组的细胞上清液LDH含量与模型组相比也明显降低(P<0.05),并呈一定的剂量依赖性。结果提示,EGCG在体外对CCl4致肝细胞损伤具有直接地保护作用(表1)。2.1.2各组大鼠肝脏抗氧化能力、肝胰腺组织病理学指标比较与正常对照组相比,肝细胞损伤模型组SOD明显降低(P<0.01):EGCG1.00×10-4及5.00×10-5mol/L剂量组SOD含量与模型组相比没有差异,1.25×10-5及2.50×10-5mol/L剂量组可使SOD活性有一定程度地增加(P<0.001);与正常对照组相比,肝细胞损伤模型组MDA明显升高(P<0.001),EGCG各剂量组均可以降低MDA含量(P<0.01,P<0.001);5.00×10-5、1.00×10-4mol/L剂量组与模型组比较,可以明显降低MDA含量(P<0.001)。结果提示,EGCG在体外对CCl4致肝细胞的损伤可通过抗脂质过氧化而起保护作用(表2)。2.2通过测试材料保护28二对肝脏损伤l02的影响2.2.1各组大鼠肝脏od值的比较肝细胞存活率与OD值成正比。与正常对照组相比,肝细胞损伤模型组OD值明显下降(P<0.01);与模型组比较,EGCG各剂量组OD值明显升高(P<0.01,P<0.001),使肝细胞存活率提高。这表明,EGCG对肝细胞的过氧化氢损伤具有一定的保护作用(表3)。2.2.2各组小鼠肝脏损伤模型中ast、ldh的比较细胞培养液中加入H2O2后,肝细胞出现核溶解、细胞膜破损、细胞结构不清等现象,且上清液中有少量脱落细胞。与正常对照组相比,肝细胞损伤模型组培养上清液中AST、LDH明显降升高(P<0.001);各剂量EGCG组的AST和LDH与模型组相比也明显降低,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),且呈一定的剂量依赖性。结果提示,EGCG在体外对H2O2致肝细胞损伤具有直接地保护作用(表4)。3ecgg对慢性肝损伤的保护作用对离体细胞的研究,既可排除整体水平时神经体液的调节作用,又可排除离体器官水平时不同细胞之间的相互影响,从而可以观察药物对肝细胞的直接作用。在多种肝病(包括炎症/免疫介导肝细胞损伤、酒精性肝损伤和缺血再灌注性肝损伤等)的肝细胞损伤中,氧化应激是它们的共同损伤机制。CCl4可经肝细胞的细胞色素P450Fe2+作用产生O-2,并通过自由基反应扩展程序产生CCL3·和CCL3O·O等自由基。同时,CCl4还可促进SOD等抗氧化酶消耗增多而水平下降,导致清除自由基能力也下降,损伤进一步加重。H2O2可直接弥散入细胞内与各种细胞成分相互作用,且在富含铁的肝细胞内也转变为OH·,OH·等自由基可致DNA键断裂,并与细胞的重要成分起反应,亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA),引发膜脂质过氧化链式反应,双链脂肪酸过氧化(聚合)即使MDA形成增多,肝细胞膜通透性增加,使ALT、AST与LDH释放增加。SOD是体内清除自由基、抑制自由基反应的酶系之一,它能抑制黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,减少自由基的产生,减轻肝细胞损伤,SOD的活性降低则自由基清除不足。据报道,各型肝病患者SOD的活性均明显降低,且与肝脏病理损伤的严重程度呈正相关。在脂质过氧化反应中,MDA是其分解的终产物之一,MDA被作为自由基产生的间接指标,能对膜结构产生严重损伤。在细胞膜中富含多不饱和脂肪酸,极易受自由基攻击,发生脂质过氧化反应,反应的终产物MDA能进入膜磷脂的水相,和膜蛋白、膜磷脂上的NH2交联形成Schiff碱,使细胞膜变硬,膜流动性降低,通透性增加,从而导致膜的功能损伤或丧失,肝细胞释放大量ALT、AST与LDH。因此,ALT、AST、LDH、SOD及MDA可反映出肝细胞损伤的程度和药物对肝细胞的保护作用。据此,本模型选择测定培养上清液中ALT、