高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时检测中药材中的6种砷形态

高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时检测中药材中的6种砷形态

中医学是中医的传统医学，其质量是中医药发展的基础。但是近年来,许多中药材中砷含量严重超标,制约了中药材走向世界。各国进出口中药材质量控制标准对砷总量均做了严格规定。然而,砷元素的毒性不仅取决于其总量,更取决于其存在的化学形态,例如无机砷的毒性最大,甲基胂、二甲基胂毒性较小,而砷甜菜碱、砷糖通常被认为是无毒的。虽然砷元素本身具有强烈的致癌作用,但是很多复方传统中药含有砷成分,大量的研究证实,砷作为某些中药中的有效成分对疾病的治疗起着关键作用,例如雄黄(四硫化四砷,As4S4)、砒霜(三氧化二砷,As2O3)已经作为抗血癌药物进入临床阶段。因此,研究中药材中砷的毒性及药效,仅测定砷总量是不够的,应同时对砷形态加以研究。目前,中药材中砷形态分析的报道较少。本课题组融合高效液相色谱色谱(HPLC)高效分离的特点及电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)高灵敏度的元素特异检测手段于一体,对6种中药材中的多种砷形态进行初步探讨。1实验部分1.1仪器、试药与标准1100型高效液相色谱(美国Agilent公司),HamiltonPRP-X100(250×4.1mm;10μm)阴离子交换色谱柱;7500a型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)(美国Agilent公司);SpeedwaveMW-3+微波消解系统;Milli-Q超纯水处理系统;快速漩流浓缩仪。HNO3、H2O2、CH3OH均为优级纯;碳酸铵为分析纯;超纯水(≥18.2MΩ)。标准参考物质TORT-2;三碘化砷、五氧化二砷;二甲基胂酸;甲基胂酸、砷胆碱、砷甜菜碱。1.2仪器条件优化液相色谱条件:阴离子交换色谱柱HamiltonPRP-X100(250×4.1mm;10μm);流动相为:A:H2O,B:50mmol(NH4)2CO3(pH9.5),二元泵梯度洗脱:(1)0～15min,A:100%～0%,B:0%～100%;(2)15～30min,A:0%～100%,B:100%～0%;流速:1.5mL/min,进样量:20μL。ICP-MS条件:用10μg/L的Li、Y、Ce和Tl混合标准溶液对仪器条件进行优化,使仪器灵敏度、氧化物、双电荷等各项指标达到测定要求。RF功率:1350W,载气流速:0.90L/min,混合气流速:0.15L/min,采用时间分辩分析模式。由于35Cl和仪器所用的高纯载气(氩气)易形成75ClAr+,干扰75As的测定,因此仪器同时监测75As,35Cl等信号,用以排除75ClAr+干扰峰。1.3样品处理1.3.1微波消解法准确称取0.2g粉碎后的中药材于聚四氟乙烯消解罐,加入5mL硝酸密封后放入微波消解仪中运行消解程序,待程序执行完毕冷却后,打开消解罐,加入1mLH2O2,反应20min。然后将样品转移至干净的PET塑料瓶中,稀释定重至25.00g,即为待测样液。1.3.2样品中砷的提取盐酸浸提:准确称取粉碎后中药材样品1.00g于15mL具塞刻度离心管中,加1:10(V/V)HCl10mL,混匀,置于50℃水浴锅中24h,期间多次振摇,使试样充分浸提。冷却、过滤,取2mL滤液于PET瓶中,加超纯水定重至20.00g,用于砷的形态分析。同样方法提取标准参考物TORT-2中的砷化学形态。超声溶剂提取:准确称取粉碎后中药材样品1.00g于离心管中,加入10mL甲醇/水(V/V=1:1)超声30min,然后置于离心机中以6000r/min旋转15min。小心移出上层清液于100mL圆底烧瓶中。重复上述步骤3次,将3次合并液在40℃水浴中旋转蒸发干,所剩残渣用超纯水溶解,定重至5.00g,即为待测样液。2结果与讨论2.1种药材中砷含量测定在砷的形态分析前,采用微波消解-ICP/MS法对6种中药材试样中的总砷含量进行了测定,结果见表1。发现除全蝎外,其它5种中药材砷含量均符合我国药用植物及制剂进出口绿色行业标准(砷≤2.0μg/g),但对比最严格的美国FDA药品与功能性食品标准中砷限量(≤0.02μg/g),6种中药材砷含量均超标。此标准对中药材中的砷含量进行限定时,未对有毒的无机砷形态进一步规定,值得探讨。2.2在分析硫异叶结构的方法中2.2.1各砷形态标准曲线的建立将浓度为0.00、10.00、100.00μg/L的6种砷形态混合标样用HPLC-ICP/MS分析,分离结果见图1,以所得6种砷形态的峰面积作工作曲线,在0～100μg/L内以As计呈线性相关,回归方程见表2。由于ICP-MS灵敏度高、响应与化合物结构无关,因此各种砷形态的峰面积(以As计)只与各砷形态的浓度呈线性关系,当各砷形态的浓度为0.00时,其峰面积相应也应为0,因此本实验中标准曲线过原点。对浓度为10.00μg/L的混合标样重复测定7次,计算各砷形态RSD;采用逐级稀释法,对标准溶液进行逐级稀释,以3倍的峰高为仪器检出限,测得的检出限见表2。2.2.2asb的提取效率采用超声溶剂萃取法对标准参考物质TORT-2中的砷形态进行提取,用所建立的HPLC-ICP-MS分析,结果见表3,其中AsB的提取效率为73.8%,与文献中提及的AsB沾水溶性砷形态的73%一致,证明本方法有较好的准确性。2.2.3hplc-icp-ms分析对动植物中药材样品中的砷形态进行“原位”提取非常重要,直接决定了其中所含砷元素对药效影响的评价。为了考察提取步骤对砷形态分析的影响,以龙虾肝胰腺标准物质TORT-2作为参考物,分别采用HCl浸提(HCl)和超声溶剂萃取(SON)两种方法对其进行提取比对,其HPLC-ICP-MS分析结果见表3。由上述表可以看出,标准物质TORT-2中最主要的砷形态是AsB,且用盐酸浸提法提取出的AsB效率明显好于超声溶剂萃取,提取出的砷形态种类也较多,原因可能是HCl的极性较强,易与样品中的砷形态化合物发生作用,浸提出较多的砷形态。另外,用甲醇/水超声提取时总砷提取效率达到120%,原因是甲醇可提高As的离子化效率,从而增强75As的信号。因此,如果提取液中的甲醇不能完全蒸干,就会使总砷提取效率明显偏高。2.3各药材中砷形态的含量用HCl浸提法对北龙胆、合欢花、红花、人工养殖全蝎、野生全蝎和桑螵蛸中存在的砷形态进行提取,其结果如表4所示。从表中可以看出,上述6种中药材中的砷主要以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的无机砷形态存在,全蝎和红花中As(Ⅲ)含量比As(Ⅴ)高,其它4种中药材中均是As(Ⅴ)形态比As(Ⅲ)含量高。另外全蝎、野生全蝎和桑螵蛸3种动物药材中还存在微量的AsB。可见,中药材中所含的砷形态并非全是毒性较高的无机砷形态,因此有关中药质量控制标准中应进一步限定无机砷形态的含量。另外作者还对比了人工养殖全蝎和野生全蝎中存在的砷形态差异,发现人工养殖全蝎和野生全蝎中AsB和As(Ⅴ)形态含量无明显差别,而人工养殖全蝎比野生全蝎含有更多的As(Ⅲ)形态。结果表明,同种药材受不同的环境影响,会产生一定的差别。据文献报道,动物体中的砷经过体内代谢主要以砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、砷糖等有机砷形态存在,而人工全蝎和野生全蝎中的砷均主要以有毒的无机As(Ⅲ)、As(Ⅴ)形态存在,只有很少一部分砷经过甲基化及进一步代谢成砷甜菜碱(AsB)等几乎无毒的有机砷形态。众所周知,As(Ⅴ)和As(Ⅲ)具有很高的毒性,但是食用这些中药材却有治疗疾病的作用,因此清楚解释中药材中无机砷的作用机理有十分重要的意义。3盐酸浸提法提取砷形态的最佳方法是相对于as、dma、mma、mma、mma、asc的提取利用HPLC-ICP/MS同时分析了六种中药材中存在的砷形态