蒸发光检测器原理及技术应用

大纲常规检测器的回顾ELSD的检测原理ELSD与常规检测器的比较ELSD在药物分析上的优点ELSD的维护质量保证最新的发展总结常规检测器的回顾

紫外可见UV/Vis

示差折光RI

荧光Fluorescence

质谱MassSpectrometry检测器的应用分布UV/Vis65%RI&ELSD10%ECD10%FLuorescence8%MS4%其它3%紫外/可见检测器UV/VIS优点：易于操作可靠性费用相对低廉溶剂梯度兼容对样品没有破坏性相对灵敏度高紫外/可见检测器UV/VIS局限性没有好的发光基团的化合物响应较差溶剂的使用上受紫外截止波长的限制荧光检测器Fluorescence优点：很好的灵敏度很好的选择性受流速和温度的变化影响很小荧光检测器Fluorescence局限性线性范围窄操作复杂-需要对化合物和仪器的变化了解透彻某些物质如氧气会熄灭荧光-必须严格脱气能够自然产生荧光的化合物不是很多衍生方法复杂示差折光检测器RI优点：通用性-对几乎所有的物质具有相应宽的动态线性范围易于操作示差折光检测器RI局限性检测灵敏度不高对于温度和压力的波动敏感平衡慢检测既有正峰也有负峰不能进行梯度洗脱流动相预先混合后的效果好于泵在线混合的质谱MS优点灵敏度高选择性好提供化学结构信息质谱MS局限性购买费用高操作复杂需要经常维护蒸发光散射检测器ELSD发展历史检测原理局限性优点在药物分析中的应用发展历史

第一台商业化的产品出现在80年代初期•

最早的应用集中在聚合物的分析上•90年代初期，更多其它方面的应用•

目前，应用在广泛的领域独特的检测方法检测三部曲雾化溶剂的蒸发检测第一部：雾化色谱柱流出物通过喷雾器针孔与氮气混合形成均匀的雾状液滴第二部：溶剂的蒸发液滴通过加热的漂移管溶剂蒸发只有样品颗粒保留第三部：检测样品颗粒通过流动池激光“撞击”颗粒被散射光电二极管检测散射光检测角度为90℃，避免虚假信号(>90℃折射/衍射光；<90℃反射光)两种类型ELSDA型-所有液滴进入漂移管及流动池(又称为“无气溶胶分流NoAerosolSplitting”)B型-部分液滴分流排掉；只有一部分进入漂移管及流动池(“气溶胶分流AerosolSplitting”)A型ELSD-不分流操作所有样品从喷雾器进入漂移管及流动池需要较高温度才能完全蒸发流动相；A型ELSD只有不分流一种操作模式B型ELSD-气溶胶分流操作部分样品被排掉较低的温度已足够蒸发所有溶剂

B型ELSD只有分流一种操作模式Alltech2000(ES)型ELSD唯一提供两种操作模式的ELSD，在任何流动相及样品分析条件下均达到最佳结果一台仪器，两种操作撞击器(Impactor)关-所有液滴进入漂移管及流动池(A型ELSD-无分流)撞击器(Impactor)开-部分液滴被排除，只有一部分进入漂移管及流动池(B型ELSD-气溶胶分流)采用新型专利“气溶胶分流技术”

USPatent#6229605

撞击器关模式撞击器与气溶胶流向平行所有样品流过漂移管到达流通池最适用于非挥发性样品及挥发性溶剂(大部分为有机)NebulizerImpactorDriftTubeDrainOpticsExhaustDriveShaftNebulizerOpticsImpactor‘Off’撞击器开模式撞击器垂直于气溶胶流向，部分液滴碰上撞击器从废液管排掉；其余穿过撞击器，经过漂移管到达流动池最适用于半挥发性样品及低挥发性溶剂(大部分为水溶液)NebulizerImpactorDriftTubeDrainOpticsExhaustDriveShaftNebulizerImpactor‘On’Optics撞击器关-最适合非挥发性样品Column: Alltech700CHCarbohydrateColumn 10µm,300x6.5mmMobilePhase: 100%WaterFlowrate: 0.5mL/min1.蜜三糖(50µg/mL)2.

乳糖(50µg/mL)3.

葡萄糖(50µg/mL)4.

甘露糖(50µg/mL)Column: Alltech700CHCarbohydrateColumn 10µm,300x6.5mmMobilePhase: 100%WaterFlowrate: 0.5mL/min#9206#9205Impactor‘On’Impactor‘Off’碳水化合物非挥发性样品在撞击器“关”的情况下也不挥发，全部进入流动池，得到最高灵敏度

撞击器关-最适合挥发性溶剂有机溶剂在较低温度蒸发，在撞击器“关”的情况下，也会完全蒸发，B型ELSD任何条件下均分流，造成样品损失，降低检测灵敏度Column: AlltechEconosphere®,C18, 5µm,150x4.6mmMobilePhase: Methanol:Water(90:10)Flowrate: 0.8mL/minColumn: AlltechEconosphere®,C18, 5µm,150x4.6mmMobilePhase: Methanol:Water(90:10)Flowrate: 0.8mL/min1.

n-癸基-b-D-吡喃糖苷(5µg/mL)2.n-辛基-b-D-吡喃糖苷(5µg/mL)3.n-十二烷基-b-D-吡喃糖苷(5µg/mL)葡萄糖苷分析Impactor‘On’Impactor‘Off’#9180#9179撞击器开-最适合半挥发性样品在撞击器开情况下，可以较低温蒸发溶剂，防止半挥发性样品蒸发防腐剂分析Column: AlltechEconosphere®,C18, 5µm,150x4.6mmMobilePhase: Methanol:Water(90:10)Flowrate: 0.8mL/minColumn: AlltechEconosphere®,C18, 5µm,150x4.6mmMobilePhase: Methanol:Water(90:10)Flowrate: 0.8mL/min1.羟基苯甲酸甲酯2.羟基苯甲酸乙酯3.羟基苯甲酸丙酯4.羟基苯甲酸丁酯#9202Impactor‘Off’Impactor‘On’#9201撞击器开-在几乎室温下检测半挥发样品Column: Prevail™CarbohydrateES,5µm,250x4.6mmMobilePhase:Acetonitrile:0.04%AmmoniumHydroxide(80:20)Flowrate: 1.0mL/min1.

Glycerol甘油ELSD的局限性1.只能使用挥发性的流动相2.

样品的挥发性必须要小于流动相3.

检测器响应是非线性的挥发性的流动相改性剂#1VolatileMobilePhaseModifierspKapKbpHRangeBPMPAcidsTrifluoroaceticAcid三氟乙酸0.313.7072.4°CFormicAcid甲酸3.7510.25100.7°CAceticAcid醋酸4.759.25116.0°CCarbonicAcid碳酸6.377.63—BasesAmmonia氨水9.254.75-33.35°CMethylamine甲胺10.813.1916.6°CEthylamine二乙胺10.663.34-6.3°CTriethylamine三乙胺11.012.9989.3°CBuffersAmmoniumFormate甲酸胺3.0-5.0120°CPyridiniumFormate甲酸吡啶翁3.0-5.0AmmoniumAcetate乙酸胺3.8-5.8111°CPyridiniumAcetate乙酸吡啶翁4.0-6.0AmmoniumCarbonate(forreversephase)碳酸胺(用于反相)8.0(adjusted)AmmoniumCarbonate碳酸胺5.5-7.5and9.3-11.3挥发性的流动相改性剂#2VolatileMobilePhaseModifierspKapKbpHRangeBPMPIon-PairReagentsPentafluoropropionicAcid五氟丙酸~0.696-97°CHeptafluorobutyricAcid七氟丁酸~0.6120°CNonafluoropentanoicAcid九氟戊酸140°CPentadecafluoroocatanoicAcid十五氟辛酸~0.6189°CTridecafluoroheptanoicAcid十三氟庚酸~0.6175°C如何应对非线性响应的检测器？选择2阶方程或者幂指曲线方程使用曲线的仅仅线性部分使用log/log双对数方法产生线性曲线在中国药典2005版中，中药计算采用两点双对数方法,抗生素计算采用三点双对数方法功能强大的HPLC检测器通用性高-可检测任何挥发性低于流动相的化合物灵敏度好-比示差及低波长紫外灵敏一致的响应-给出准确的样品浓度用途广泛-梯度相容，改善分离及缩短分析时间示差与ELSD的比较 示差检测器的限制 ELSD优点温度变化会引起基线不稳定 不受环境温度影响可能出现负峰均是正峰不可以用梯度洗脱梯度洗脱兼容受溶剂峰干扰溶剂无响应，无溶剂峰灵敏度差ng级的检测限ELSD不会出负峰五糖,1.5mg/mLELSD RI RI (反转极性)ELSD相对RI，提高了检测灵敏度和基线稳定性RIELSD10277102781.

Fructose果糖2.

Glucose葡萄糖3.Sucrose蔗糖Column: Prevail™CarbohydrateES,5µm,53x7mm(PartNo.35104)MobilePhase:Acetonitrile:Water(75:25)Flowrate: 2.0mL/minColumnTemp:30°C碳水化合物的梯度洗脱#7576(Isocratic)1.核糖2.木糖3.果糖4.葡萄糖5.蔗糖6.麦芽糖7.乳糖8.棉子糖1.果糖2.葡萄糖3.蔗糖4.麦芽糖5.乳糖#7570(Gradient)Carbohydrates紫外-可见光检测器的缺点UV的局限性ELSD的优点

只能检测吸收紫外或可见光 •检测挥发性低于溶剂的任的化合物 何化合物检测基于样品的消光系数

•检测基于样品浓度•低波长紫外检测作梯度洗脱时 •梯度洗脱时基线稳定出现基线漂移 •溶剂峰会干扰

•溶剂没有响应，无溶剂峰•溶剂选择受其紫外末端吸收限制

•可用任何挥发性的溶剂

甾体化合物#79411.雌酮-3-硫酸钠,100ng2.

b-雌二醇-17-b-D-葡萄糖苷酸钠,100ng3.5b-孕烷-3a,20a-二醇-葡萄糖酸苷,220ng#7940

Column: Alltima™C18,5µm,150x2.1mm (PartNo.88370)MobilePhase:

A:0.1%TFAinWater

B:0.1%TFAinMethanolGradient:

Time: 0 10 18

%B: 60 100 100FlowRate: 0.2mL/min10446ELSD显示在UV谱图中未检测到的成分

Lotrimim®AFTopicalSolution1.PEG2.ClotrimazoleColumn: Alltima™C18,5µm,150x4.6mm(PartNo.88302)MobilePhase:

A:Water B:MethanolGradient:

Time: 0 8 10 2025

%B: 30 50 100 100 30FlowRate: 1.0mL/minColumnTemp.: 40°C#10446#10447ELSD比UV更能准确反映样品实际的量1:1混合物1.Ephedrine麻黄素2.Caffeine咖啡因1045010449Column: Alltima™HPEPSC18,5µm,150x4.6mm(PartNo.87715)MobilePhase: 1%AceticAcid:Methanol:Acetonitrile(70:20:10)FlowRate: 1.0mL/minELSD检测没有发光团的化合物不需要衍生1.lauricAcid2.MyristicAcid3.PalmiticAcid4.StearicAcid5.ArachidicAcid6.BehenicAcid9539Column: Prevail™OrganicAcid,5µm,150x4.6mm(PartNo.88640)

MobilePhase:(75:25)Acetonitrile:Methanol

FlowRate:1.0mL/min脂肪酸ELSD在分离使用的溶剂选择上有特点1.LGG2.LGL3.LLL4.OGL5.PGL6.OLL7.OGO+PLL8.OOO10047Column: Alltima™C18,5µm,250x4.6mm(PartNo.88056)

MobilePhase:

A:AcetonitrileB:Dichloromethane

Gradient: Time: 0 40

%B: 30 50FlowRate: 1.0mL/minTriglyceridesinEveningPrimoseOil月见草油中的甘油三酸酯荧光检测器的缺点大多需要柱前或柱後衍生

无需衍生荧光检测器的限制 ELSD的优点柱前衍生法分析氨基酸

1. 天门冬氨酸

2. 谷氨酸

3. 丝氨酸

4. 甘氨酸

5. 组氨酸 6. 苏氨酸

7. 丙氨酸 8. 精氨酸

9. 脯氨酸

10. 酪氨酸

11. 蛋氨酸

12. 缬氨酸

13. 半胱氨酸

14. 异亮氨酸

15. 亮氨酸

16. 苯丙氨酸

17. 赖氨酸

#7596#5164ELSD对无衍生氨基酸分析

1.Gly2.Ser/Asn3.Asp4.Gln5.Ala/Thr6.Glu7.Cys/Lys8.His9.Pro10.Arg11.Val12.Met13.Tyr14.Ile15.Leu16.Phe17.TrpColumn: Prevail™C18,5µm,250x4.6mm(PartNo.99210)MobilePhase:

A:5mMHeptafluorobutyricAcid,pH1.0w/0.7%TFAB:AcetonitrileGradient:

Time: 0 6 8 25

%B: 0 0 15 35FlowRate: 1.0mL/min尽管MS是通用性的检测器，ELSD有自己的优势投入和操作的成本低操作容易维护简单定量准确

对于色谱条件的要求在ELSD和MS上是相似的，所以ELSD方法能够方便的应用在MS上不需要修改。在ELSD上进行MS的方法研究，能够节省MS用于实际样品的分析

并联使用UV/ELSD/MS能够得到最多的结构和浓度信息1.Aspartame2.Hydrocortisone3.Reserpine4.TerfenadineColumn: ZORBAX®StableBondC18,3.5µm,50x4.6mm (PartNo.835975-902)MobilePhase:

A:0.025%FormicAcidinWater

B:0.025%FormicAcidinAcetonitrileGradient:

Time: 0 1 5 5.1

%B: 25 0 0 25FlowRate: 1.0mL/minColumnTemp:30°C#10456#10458#10457总结:用ELSD替代或补充现有检测器的益处消除衍生简化方法比RI有更好的灵敏度和稳定性给其它检测器作补充，能够看到哪些物质没有检测到能够得到更准确的样品量的信息ELSD用于药物分析的特点：通用性的检测器-可以使用微径柱-条件方便放大到制备-在极端的梯度条件下进行快速分离检测没有发光团的化合物-Lipids磷脂-Polymers聚合物-Surfactants表面活性剂-Carbohydrates碳水化合物2005版中国药典中用ELSD检测的药品名称序号产品名称检测化合物色谱条件药典页码1黄芪

黄芪甲苷C18柱，乙腈：水=32：68一部P212

2炙黄芪

黄芪甲苷C18柱，乙腈：水=32：68一部P213

3银杏叶

萜类内酯白果内酯C18柱，甲醇:四氢呋喃：水=25：10：65

一部P220

4银杏叶提取物

萜类内酯白果内酯C18柱，正丙醇：四氢呋喃：水=1：15：84一部P282

5知母

拔契皂苷元

C18柱，甲醇：水=95：5一部P148

6意苡仁

甘油三油酸酯

C18柱，乙腈：二氯甲烷=65：35一部P260

7浙贝母

贝母素

C18柱，乙腈：水：二乙胺=70：30：0.3

一部P205

8补中益气丸（水丸）黄芪甲苷C18柱，乙腈：水=35：65一部P4809硫酸卡那霉素卡那霉素

C18柱，0.2mol/L三氟乙酸溶液：甲醇=95：5

二部P724

10硫酸庆大霉素

庆大霉素小诺霉素

C18柱，0.2mol/L三氟乙酸溶液：甲醇=92：8二部P730

11硫酸依替米星

依替米星奈替米星C18柱，0.2mol/L三氟乙酸溶液：甲醇=84：16二部P74012硫酸小诺霉素

小诺霉素/庆大霉素C1aC18柱，0.2mol/L三氟乙酸溶液：甲醇=94：6二部P718在ELSD上用微径柱检测1.

VitaminA

(100ngon-column)2.

VitaminE

(160ngon-column)3.

VitaminK1

(130ngon-column)Column: Alltima™C18,3µm,150x1mm(PartNo.88384)MobilePhase:Methanol:Chloroform(90:10)FlowRate: 50µL/min#10279制备时通过ELSD控制馏分收集器，过滤UV无吸收化合物Column: Alltima™C18,5µm,150x10mm(PartNo.81102)MobilePhase:Water:Acetonitrile(55:45)FlowRate: 5.0mL/minColumnTemp.: 25°C1.Ethinamate(5.0mg/mL)#10438ELSD对流动相的组成改变不响应，允许在极端梯度条件下的快速分离Column: Platinum™C18,3µm,20x4.6mmMobilePhase:A:0.05%FormicAcidinWater

B:0.05%FormicAcidinAcetonitrileGradient:

Time: 0 3 7 10

%B: 5 90 90 5 FlowRate: 1.0mL/min1.

Aspartame

2.

Cortisone

3.

Reserpine

4.

DioctylPhthalate

#10273ELSD对氨基葡萄糖有比RI和UV更好的响应Column: Prevail™CarbohydrateES,5µm,150x4.6mm(PartNo.35102)MobilePhase: Acetonitrile:Water(65:35)FlowRate: 1.0mL/min1.Glucosamine(1mg/mL)#10412#10413#10411使用ELSD可以梯度洗脱完全分离及检出多种磷脂

Column:

AllsphereSi,3µm,100x4.6mmMobilePhase:A:IPA:HEX:H2O:NH4OH (57.8:40:2:0.2)

B:IPA:HEX:H2O:NH4OH (51.8:40:8:0.2)Gradient: Time:0715

%B:0100100Flowrate:

1.25mL/min1.

磷脂酰肌醇(100µg/mL)2.

磷脂酸(100µg/mL)3.

磷脂酰丝氨酸(100µg/mL)4.

磷脂酰胆碱(100µg/mL)5.

鞘磷脂-DoublePeak(100µg/mL)#9187ELSD检测糖醇-高灵敏度和稳定的基线

Column: Prevail™CarbohydrateES,5µm,250x4.6mm(PartNo.35101)MobilePhase: Acetonitrile:Water(70:30)FlowRate: 1.0mL/min1.iso-Erythritol异赤藻糖醇2.Xylitol木糖醇3.Mannitol甘露醇4.Maltitol麦芽糖醇#9352糖醇氨基糖苷类抗生素的ELSD分析(中国药典2005)

Column: ApolloC18,5µm,250x4.6mmMobilePhase:0.2MTrifluoroaceticAcid:Methanol(94:6)FlowRate: 0.6mL/min1.Sulfate2.GentamicinC1a3.GentamicinC24.GentamicinC2b5.GentamicinC2a6.GentamicinC1#10425庆大霉素C组分

*中检所抗生素室银杏叶提出物中内酯含量的ELSD测定(中国药典2005)

分析方法使用AlltechPlatinumC18柱水/甲醇/四氢呋喃(75：20：10)，流速1ml/min.银杏叶提出物的内酯类成份决定了其药理作用，HPLC-RI法灵敏度与稳定性均不理想；若采用紫外分析因为内酯类成份吸收差，最大吸收波长在219nm，受试剂末端吸收影响很大。1.银杏苦内酯C2.白果内酯3.银杏苦内酯A4.银杏苦内酯B

*北京市药品检验所黄芪中黄芪甲苷的ELSD分析(CHP2005)

黄芪甲苷常作为指标性成份用于黄芪药材的质量监控，因为只在220nm有弱的末端吸收，过去未能使用HPLC法定量，ELSD有通用响应，使用HPLC-ELSD法干扰少，分离度高.1.黄芪甲苷分析方法使用ODS柱，乙腈/水(36：64)，流速0.7ml/min.同一样本进样5次峰面积的RSD是0.67%,精密度较高。不同产地的三个样本给出黄芪甲苷含量为0.1090%、0.1206%及0.1689%

*南京中国药科大学西洋参中拟人参皂苷F11含量西洋参含多种人参皂苷类活性成份，其中拟人参皂苷F11为特征成份，皂苷类不吸收紫外，需要ELSD检测1.拟人参皂苷F11分析方法使用AlltechPlatinumC18柱，乙腈/水(30：70)，流速1ml/min.以F11色谱峰计算柱效是2605，F11与相邻色谱峰分离度为1.4同一样本进样六次F11峰面积的RSD是2.2%,精密度较高同一批样本制备5份测定F11含量，平均值是0.2821%,RSD2.2%不同产地的四个样本给出F11含量从0.1728%至0.2861%，差异较大

*中国药品生物制品检定所中药室人参中皂苷含量分析1.人参皂苷Rh12.人参皂苷Rg23.人参皂苷Rg14.人参皂苷Rg35.人参皂苷Rf6.人参皂苷Re7.人参皂苷Rd8.人参皂苷Rc9.人参皂苷Rb210.人参皂苷Rb1

*韩国汉城大学药学院a.

白参正丁醇溶解部分色谱图b.

红参正丁醇溶解部分色谱图ELSD校正和维护维护

-清洗

-多长时间？校正

-温度

-气流量

-激光功率ELSD清洗需要对流路进行清洗

-Drifttube漂移管

-Nebulizer雾化器

-Opticswindows光池

-Lighttrap光阱多长时间

-根据样品，方法和使用频率而定

-通常每半年一次IQ,OQ,PQ服务国际质量认证GMP，GLP要求仪器安装及使用需要通过严格管理，包括详细记录使用情况，定期校正IQ-安装认证OQ-操作认证，包括仪器操作参数用校正计量仪器测试PQ-性能认证，按出厂指标验证性能符合规格在ELSD2000ES包装中随机带有认证文件ELSD2000ES光路和电子元件进行更新布儒斯特角光阱和光阱尾吹30mW的激光光源光池涂四氟乙烯的抗腐蚀涂层降低背景噪音，比2000ELSD提高一个数量级的灵敏度关于布儒斯特角

当反射光线和折射光线的传播方向互相垂直时,入射光线的偏振角称为布儒斯特角.当透镜只能通过垂直方向的偏振光时,便可挡住部分散射的光线.自然光在两种各向同性媒质分界面上反射、折射时，反射光和折射光都是部分偏振光。反射光中垂直振动多于平行振动，折射光中平行振动多于垂直振动。ELSD2000ES性能更新灵敏度的挑战一种措施是仅仅增加光强，但是同时会增加基线的噪音，导致LOD和信噪比没有变化。ELSD2000ES克服这种障碍，专利设计的布儒斯特角光阱，当光强增加时，信号的增强远大于噪音的增加。2000ES结合布儒斯特角光阱和30mW的光源为一体。ELSD2000ES灵敏度更新对相同的浓度的样品有多于10倍的S/N增长•增强LimitsofDetection(LOD)灵敏度比较–2000ESvs20002000ES对相同量的氢化可的松增加灵敏度1.Hydrocortisone(100ngoncolumn)Column: Alltima™C18,5µm,4.6x250mm (PartNo.88056)MobilePhase:

Water:Acetonitrile(55:45)FlowRate: 1.0mL/min总结:ELSD用于药物分析的优势通用性

-分析样品中几乎所有的峰都能检测到

-改进定量方法

-更精确的评估峰纯度

灵敏度

-检出限达到ng级(2000ES更优)

梯度兼容性

-在坡度梯度中保持稳定的基线LockoutSpecifications•UserInterface:FullcolorWindows®basedGraphicalLCDwithalphanumerickeypad•Sevenlanguagechoicesforuserinterface•MethodWizard•Self-diagnostictests•Servicescreens•Helpscreens•650nm,30mWlaserdiode•Removableimpactor•Easyaccesstoallpartsneedingregularcleaning•AbilitytophysicallycleandrifttubeWhoaretheCompetitors?CompetitionSummary•Sedex–Models55,60LT,75,85,4-channel•PolymerLaboratories–Models1000,1000µ,2100•Waters–Model2420•ESA–Chromachem,alsosellSedexinwesternUS•SofTa–Models100,200,200S,300,400•Shimadzu–ELSDLTandLTII(privatelabelofSedex75and85)•Schambeck–ZAM3000?Thecompetitionspecificationcomparisonsheetispostedontheintranetunderproductandmarketingsupport.Thishasbeenupdatedwiththespecsfromthe3300.SedexModel:60LT 75 85 754Strengths:-Toughcompetitorwithsoleproductfocus -Unitisveryeasytouse -HighsensitivityLimitations:-Lackofhighendfeatureslikedigitalgascontrol -Largesize

Varian(PolymerLabs)

Strengths:

-Smallsize,nicelook -Easytouse -OnlyELSDwithhigh tempGPCcapability

Limitations:

-Lowsensitvity -Havetobuyseparate unitformicroanalysis ratherthandifferent nebulizerModels:1000,2100,1000µModel:100021001000µWatersModel2420

Strengths:

-Smallestsizeandstackable -Onlymanufacturerthatcanoffer completesy