实验设计(从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖角度)检测免疫细胞的数目和活性

医学免疫实验——检测免疫细胞的数目和活性免疫实验三(回忆一下)010203检测某产品是否有免疫增强作用可以从淋巴细胞的数目和活性检测密度梯度离心法溴花二氨基异硫氢化物法(AET)免疫磁性微珠别离法流式细胞仪检测技术(FCM)免疫增强的表现淋巴细胞的数目和活性还有其他检测指标吗？实验四设计性实验：常见细胞免疫检测II【实验任务】市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之〔从影响淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度考虑〕。【目的要求】一、学会设计实验，从淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖的角度证实某产品有免疫增强作用。二、掌握淋巴细胞转化试验的原理及临床实用价值。三、了解E花环形成的原理，学会用E玫瑰花试验鉴定和计数T淋巴细胞的方法。【实验材料】一.肝素〔每毫升含100单位〕，PHA〔每毫升含1000微克)二.199或1640培养液〔内含20%灭火小牛血清，青霉素100单位/毫升链霉素100微克/毫升〕。三.0.5%绵羊红细胞悬液〔用Hanks液配制〕：吸收过的胎牛血清。取经56度30分钟加热灭火后的胎牛血清加半量压积绵羊红细胞混合后，37度水浴20分钟，2000转/别离心10分钟，取上清液即成。四.Hanks液，人抗凝血，淋巴细胞分层液，离心机等。试剂的相关说明肝素:一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。PBS:磷酸缓冲盐溶液(phosphate

buffer

saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广;而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。

PBA:苯硼酸Hanks液:生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液(BalancedSaltSolution,BSS)，简称H。主要用于配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞组织培养液。瑞氏姬姆萨染液：为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。环磷酰胺:作为免疫抑制剂PHA：植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)，是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞――淋巴细胞香菇多糖：香菇多糖(1entinan，LNT)香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，是香菇的主要有效成分，是一种宿主免疫增强剂(hostdefensepotentiator，HDP)，临床与药理研究说明，香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等作用。淋巴细胞淋巴细胞(lymphocyte)是白细胞的一种，是体积最小的白细胞，由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，按其发生迁移、外表分子和功能的不同，可分为T淋巴细胞(又名T细胞)、B淋巴细胞(又名B细胞)和自然杀伤(NK)细胞。T细胞和B细胞都是抗原特异性淋巴细胞，它们的最初来源是相同的，都来自造血组织。T淋巴细胞随血循环到胸腺，在胸腺激素等的作用下成熟，而B细胞在骨髓中分化成熟。实验动物分组对照组、实验组处理因素干预免疫功能检测指标确立对照组、实验组机体免疫功能检测一、讨论〔一〕设计性方案要点实验方案〔二〕淋巴细胞功能检测的主要内容T细胞功能测定B细胞功能测定单核巨噬细胞、NK细胞等功能测定细胞因子的检测CD分子、外表受体、粘附分子的检测1、T细胞功能测定〔1〕T细胞转化、增殖试验①H3-TdR掺入②细胞能量代谢测定〔MTT检测法〕③形态学计数〔2〕迟发性超敏反响的检测〔3〕T细胞分泌功能的检测〔4〕流式细胞仪对T细胞功能的检测〔5〕T细胞介导的细胞毒试验：CTLH3-TdR掺入法原理：H3-TdR掺入法检测淋巴细胞LDL-R的活性：细胞分裂增殖所需的大量胆固醇主要通过内源性胆固醇合成，以及加速细胞膜LDL-R介导的特异性结合，摄取血LDL中的外源性胆固醇而获得，当用mevinolin(胆固醇合成的限速酶HMG-CoA复原酶的抑制剂)阻断细胞内源性胆固醇的合成，并使细胞外环境中LDL浓度降低至无非特异性外源胆固醇摄取时，细胞分裂生长完全取决与细胞膜外表LDL-R活性，掺入3H-TdR量与细胞生长成正比例关系〔2〕H3-TdR掺入法检测细胞增殖：细胞发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中参加氚标记的胸腺嘧啶核苷〔3H-TdR〕，可被细胞摄入而掺入DNA中，测定3H-TdR的掺入量，可判定细胞的增殖程度。T细胞转化、增殖试验:H3-TdR掺入T细胞毒性试验TPHA母测转化率ConA增殖加H3-TdRTTT测掺入量CTL+靶-51Cr靶细胞溶解，51Cr释放测放射活性酶联免疫斑点试验〔ELISPOT〕B2、B细胞功能测定溶血空斑试验B浆+温育1-3h绵羊红细胞补体有丝分裂原浆B+溶血空斑实验溶血空斑实验原理将绵羊红细胞免疫的家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后参加琼脂糖凝胶中，其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑，一个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量反映机体的体液免疫功能。酶联免疫斑点试验〔ELISPOT〕①

稳定、特异，且抗原用量少；②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞利用FCM技术进行细胞分选3、细胞因子的检测〔1〕免疫学检测法〔2〕生物学活性检测法〔3〕分子生物学测定法细胞因子的检测有助于了解该细胞因子在免疫调节中的作用，以及鉴定别离提纯后的淋巴细胞的功能。以细胞因子为抗原的检测法测定细胞因子相关的生物学活性用基因的技术检测细胞因子含量以及预测合成量4、CKR、CD、AM、外表受体的检测检测方法目前大多采用间接荧光、FCM检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。上述分子除表达于细胞膜外表外，还以可溶性形式存在于体液中。二,淋巴细胞转化实验测定淋巴细胞功能的一种方法。人类T、B淋巴细胞外表有丝裂原受体，T、B淋巴细胞能分别与不同的丝裂原结合，发生淋巴细胞的转化增殖反响。根据淋巴细胞转化率，可以间接判断机体免疫状态。操作：淋巴细胞转化试验〔一〕原理：T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异丝裂原〔PHA、PWM和ConA〕刺激均能使细胞发生形态改变而转化为淋巴母细胞。T淋巴细胞转化率的上下可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数〔包括过渡型、母细胞和分裂相淋巴细胞)。细胞免疫缺陷时，患恶性肿瘤或某些其他疾病时，转化率明显降低。淋巴细胞的转化标准方法：提前三天给小鼠注射PHA0.5ml，6mg/kg，一天一次，连续三天。剪断小鼠尾巴，向洁净载玻片上滴一滴血，用另一块洁净的推片以450角推成血膜〔头、体、尾清楚〕。枯燥后，瑞氏姬姆萨染液染色：滴3-5滴A液于载玻片1min，6-10滴B液,3min后充分水洗。镜检，计算淋巴细胞的转化率：油镜下观察玻片的头、体、尾三段。每段各一纵列〔以减少推片中细胞分布不均的误差〕。Howtomakebloodsmears血涂片质量评价头体尾

分明厚

薄

均

匀长

度

适

中结果与结果分析TPHA母ConA增殖细胞因子TTTPHA48~72

h淋巴母细胞：增殖状态下的淋巴细胞，体积增大，RNA和蛋白质合成增多。计算一般认为转化率的正常值为60～70%推片每张玻片计数200—400个细胞，计算转化率其中头部50-100,体部50-100，尾部100-200MTT检测法

淋巴细胞转化实验)又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT复原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒〔Formazan〕并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜〔DMSO〕能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。MTT检测法本卷须知：MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT

吸光度最好在0-0.7

范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT检测法本卷须知：MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

三、绵羊红细胞玫瑰花环试验测定淋巴细胞数量和功能的一种方法。人类T淋巴细胞外表具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成E花环，T细胞为红细胞花环形成细胞。根据E玫瑰花环形成率，可以间接判断机体细胞免疫免疫状态。E花环T材料：1.肝素，淋巴细胞分层液人的正常血液2.0.5%绵羊红细胞悬液〔用Hanks液配制〕，Hanks液3.吸收过的胎牛血清〔取经56度30分钟加热灭火后的胎牛血清加半量压积兔红细胞混合后，37度水浴20分钟，2000转/分钟离心10分钟，取上清液即可。〕4.灭菌注射器，针头，试管，吸管等。原理人T淋巴细胞外表的CD2分子即绵羊红细胞受体(ER),在一定的实验条件下,可与绵羊红细胞(SRBC)结合,形成玫瑰花结,称为E玫瑰花环试验玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E—玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞外表有红细胞受体,因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰把戏的细胞团。在红细胞中,以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体,所以不能形成E—玫瑰花环,以资鉴别1.淋巴细胞的提取：〔1〕取人抗凝血2毫升，加2毫升Hanks液使之稀释。加于2毫升淋巴细胞分层液液面之上〔沿管壁轻轻参加，勿使两液相混〕。〔2〕2000转/别离心30分钟，吸淋巴细胞到另一个试管中加5倍体积的Hanks液洗1--2次，〔1500转/别离心10分钟〕弃上清即可。2加吸收过的胎牛血清0.1ml，0.5%绵羊红细胞悬液0.2ml，于淋巴细胞中。混合后，37度水浴5分钟。3.500转/别离心5分钟，放4度冰箱中2小时后，弃大局部上清。方法与结果：4.染色及观察轻轻悬浮沉积的细胞。向悬液中滴一滴美蓝液，混合，10分钟后取一滴放载玻片上，加盖玻片镜检。高倍镜或油镜下计数200个淋巴细胞，凡结合3个或3个以上的绵羊红细胞者为阳性，计算花环形成细胞的百分率。正常值65%左右。方法与结果：思考题检测T、B淋巴细胞功能的实验主要有哪些？淋巴细胞转化试验有何临床实用意义?影响淋巴细胞转化试验的因素有哪些?E玫瑰花试验有何临床实用意义?1.T淋巴细胞受特异性抗原或非特异性等刺激后，发生母细胞转化，DNA合成增加。可由此了解T细胞的应答功能，这反映出受试者T细胞总体水平的应答功能，判断细胞免疫状态和探讨发病机制：

(l〕转化率增高：只有Down综合征患者外周血淋巴细胞对PHA刺激较正常人敏感，微量PHA即可使本病患者T细胞发生转化。

(2〕转化率降低：细胞免疫缺陷或功能低下者，其转化率可明显低于正常，如运动失调性毛细血管扩张症，本病由于胸腺发育不良，细胞免疫能力低下，OT反响阴性。此外，如各种恶性肿瘤、霍奇金病、淋巴瘤、淋巴肉芽肿等疾病时均可低于正常值。

2．估计疾病的疗效和预后：恶性肿瘤或慢性白色念珠菌病，经转移因子或免疫增强剂治疗后，其转化率可由治疗前的低值转变为正常，反之则预后不良。

3．寻找迟发型变态反响的原因：在临床上常由于服用某种药物而发生迟发型变态反响疾病，为了寻找病因，可将患者外周血淋巴细胞与可疑药物共同培养，假设转化率高于对照药物，即可判明病因。

4．选择适宜的移植供体：混合淋巴细胞培养。

淋巴细胞转化试验的临床实用意义影响淋巴细胞转化试验的因素有哪些⑴、受体细胞转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。另外还应根据载体的性质及实验的目的选择适宜的宿主。此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过屡次转接或储存于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或缺乏均会影响转化率。⑵、载体DNA和重组DNA方面载体本身性质决定了转化的上下，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。⑶、操作方面感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏感，难以转化成功。为防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作均应在无菌条件下进行，所有器皿最