时间分辨乙肝应用课件VIP

时间分辨乙肝应用1放射免疫分析技术radioimmunoassay

RIA同位素高度灵敏＋免疫反应特异性灵敏度高:达到ng甚至pg水平特异性强重复性高

标本用量少极大地推动了临床和科研进步标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。2缺点3125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差,导致试剂盒批间、批内的变异较大;标准曲线有效期短,必须每次定标,造成浪费。操作繁琐,出报告时间长。无法保存备用。放射性(125I),对环境的污染及对身体的危害,差不多为重视环保的国家逐步取消。(如整个欧洲仅尚存几个放免试验室)酶免疫分析法enzyne

immunoassay

EIA酶的高效催化＋免疫反应特异性幸免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。操作简单,不需要特别设备,容易推广。

曾经一度被认为是取代放免的检测手段。4缺点5对底物的显色遵循比尔定律,标准曲线的直

线范围窄灵敏度、重复性不及放免,易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响,导致稳定性不行。化学发光免疫分析法(CLIA)chemiluminescen

immunoassay光反应的高度灵敏＋免疫反应特异单个样本检测速度快,适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。6缺

点7发光过程短,样品不能重复检测。本底较高,易受环境物质干扰。试剂稳定性较差,需多次定标。检测精度不高,在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂;试剂价格高。电化学发光免疫分析(ECL)electrochemiluminescence电化学＋免疫反应80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。8电化学发光底物-三联吡啶钌

N羟基琥珀酰胺(NHS)酯9电极表面的电化学发光反应10本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。能够作急诊非开放性试剂系统。试剂价格过高。11免疫荧光测定技术(IFA)Immunofluorescence

assay12荧光物质＋免疫反应细胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高本底高时间分辨荧光免疫分析技(TRFIA)Time-Resoled

Fluoroimmunoassay镧系元素标记技术＋免疫反应13一、基本原理固相Ab受检抗原Eu标记抗体14Excitation15ExcitationExcitationExcitationExcitiatatitoionnExcitiatatitoionn二、TRFIA的主要特点16(一)灵敏度高、特异性强酶联免疫(精度:10-9mol/L)放射免疫(精度:10-12mol/L)化学发光(精度:10-15mol/L)电化学发光(精度:10-17mol/L)时间分辨荧光(精度:10-18mol/L)生物芯片17试剂DELFIAImmuliteACS-180AFP0、1-1000IU/ml0、2-300IU/ml1、0-1000IU/mCEA0、1-500ng/ml0、2-500ng/ml0、5-100ng/mlHCG0、5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/LTSH0、005-100μU/ml0、002-75μU/ml0、03-150μU/mlFSH0、05-256mU/ml0、1-170mU/m0、3-200mU/ml18Prog 0、08-120nmol/LProlactin

0、04-250ng/ml无0、5-150ng/ml0、1-40ng/ml0、3-200ng/ml以上数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书标记物具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素:15种Eu、Tb、

Sm、

Nd、

DyEu螯合物激发光19Eu螯合物荧光的特点高强度荧光

长寿命Eu螯合物714000ns20200800400

600荧光强度激发短寿命荧光白蛋白4.1ns球蛋白3.0nsFITC

4.5ns测量时间新循环1

Eu螯合物的荧光衰变时间特别长,极大地降低了检测背景。1000次循环/s2

stokes位移大,激发光谱与发射光谱无重叠,特别容易排除散射光对发射光谱的影响、stokes位移:最大激发波长至最大发射波长之间的距离21激发光发射光Eu螯合物荧光光谱300

400

500

600波长nm荧光强度273nm异硫氰酸荧光素发射光谱300400

500

600波长nm荧光强度发射光激发光2250nmEu螯合物荧光光谱300

400

500

600波长nm荧光强度异硫氰酸荧光素发射光谱300

400

500

600波长nm荧光强度3

激发光谱带较宽、可增加激发能,提高灵敏度234

发射光谱特别窄,50%的发射光谱宽度∠10nm,利用615±5范围的滤光片,只允许此波段内发射光通过并被检测,排除其它波长的荧光,一方面降低了背景,另一方面使能量消耗减少,提高提高检测灵敏度。异硫氰酸荧光素发射光谱300

400

500

600波长nm荧光强度Eu螯合物荧光光谱300

400

500

600波长nm24荧光强度5

Eu螯合物有相对高的比活性比活性:单位时间内,每个标记分子的可探测事件的数目荧光物质相对比活性特别高 原因:在测定时,荧光物质可反复被激活。基态激发态激发光跃迁25发射荧光常用标记物的相对比活性26125I标记物1个可探测事件/s/7、5*106分子1个可探测事件/s/标记分子特别多个可探测事件/s/标记分化学发光标记物荧光标记物子(二)线性范围宽27,28标准曲线稳定试剂保质期长0.5

1251020

50

100

200

500U/L51002000Cps.10

3DELFIA

hFSHN=6时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定,同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标(三)重复性好29TRFIA检测HBsAg的重复性同一标本连续20次检测,CV值∠2％。同一批(10个)标本连续3天检测,其CV值=2、9%。检测后反应板连续3天重复阅读,CV∠1％60030300700-

501000100200时间延迟(微秒)强度500发射光波长(纳米)利用不同波长和不同时间检测,在同一孔中可测量多个镧系元素的量(四)同一标本孔同时检测多个项目技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零本底、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记标记位点多,可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性,高精确度试剂保质期至少一年

标准曲线保留时间长

同一批次只需两点定标多标记单,双,三,四标记同一试剂盒可同时测多个项目

31三、应用32内分泌科检查甲状腺系列:

TSH,Ultra

TSH,T3,T4,

FT3,FT4,TBG,TG糖尿病系列:

Insulin,

C-Peptie生长激素类:

hGHCortisol其他:妇产科检查FSH,LH,HCG,ProlactinE2,E3,Testo,Prog,SHBGPSA33hTG,肿瘤科检查AFP

CEAβ-2

MicroNSEPAPPSA

EQMCA-199PSA(Free/Total)CA-50

CA-125CA-153*

CA-724*CY-211*遗传科检查产前筛查:

hAFP/

βHCG

,PAPPA新生儿筛查:Neo-TSH,Neo-T4,Neo-IRT,34

Neo-17a-OH

Prog,PKU核酸探针及基因杂交检测,多标记定量PCR检测。肝炎系列甲肝,乙肝,丙肝血液科检测Ferritin,Vit贫血检查:B12,Folic

acid白血病:免疫细胞分型等细胞学检查细胞毒试验等多种检测项目,细胞质及组织化学分析等多种检测项目酶类检测及细胞受体检测(包括MHC,HLA等多种检测)科研工具单标记检测,双标记检测,三标记检测,四标记检测35时间分辨荧光免疫测定技术36在病毒性肝炎诊断和疗效监测中的应用病毒性肝炎的种类Hepatitis

A

VirusHepatitis

B

VirusHepatitis

C

VirusHepatitis

D

VirusHepatitis

E

VirusHepatitis

G

VirusTTV37Hepatitis

Gvirus

(HGV)38Science、1996

Jan

26;271(5248):505-8、An

RNA

virus,

hepatitis

G

virus

(HGV),from

the

plasma

of

a

patient

with

chronichepatitis、entire

genome

(9392

nucleotides)encoding

a

polyprotein

of

2873aminoacids、HGV

was

associated

with

acute

andchronic

hepatitis、The

virus

is

transfusion-transmissible、It

has

a

global

distributionpresent

within

the

volunteer

blooddonor

population、39964099000102039798HGVand

GBV-C

were

two

isolates

of

thesame

virus、The

HGV/GBV-C

genomesequence

and

organization

are

closely41r

e

l

a

t

e

d t

o h

e

p

a

t

i

t

i

s

C v

i

r

u

s、infection

is

mon

and

frequently

persists

inhumans,infection

has

not

been

found

to

beassociated

with

any

known

disease

state、(acute

or

chronic

hepatitis)grow

in

lymphocytes

,

not

inhepatocytes,42Recent

studies

suggest

:43GBV-C

infection

in

HIV-positive

people

isassociated

with

prolonged

survival、coinfection

of

human

lymphocytes

withGBV-Cand

HIV

lead

to

decreased

HIV

replication、HGV

may

provide

novel

approaches

for

treatingHIV

and

AIDS、TT

virus

(TTV)found

in

1997

from

a

hepatitis

patientwithout

virus

markers、However,the

realimpact

of

TTV

on

liver

diseases

remainsuncertain

to

date、Due

to

the

lack

ofsuitable

cell

systems

to

support

the

growthof

TTV,the

biology

of

TTV

is

still

obscure、44HBsAgHBcAgHBV

DNAPolymerase45一、HBV的主要生物学性状HBV感染 病毒在体内大量复制病毒核酸进入血液分子生物学方法核酸定性或定量免疫反应释放病毒蛋白(Ag)刺激机体产生抗体血清学方法病毒抗原或抗体临床诊断和疗效观察二、HBV感染诊断的主要实验室指标46血清免疫学检测的临床意义HBV感染诊断的主要指标判断机体对HBV的免疫状况主要指标判断病程的主要指标47Acute

Hepatitis

BDNA4-12周1-2周2周－3月3－6月潜伏期潜伏 急性后期 早期急性期康复期痊愈标志物相对浓度有

传

染

性可能有传染

性有免力血清学转换期HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBc

IgMAnti-HBeAnti-HBs4疫8Chronic

HBV

Infection潜伏期(4-12周)急性感染(6个月)慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBc

IgMHBeAgAnti-HBeDNA493

HBV血清学标志物与HBV

DNA的关系血清学标志物:50反映机体对病毒的免疫状况,病程,判断病情。不能完全反映病毒在体内复制状况。HBVDNA反映病毒在体内复制水平,观察药物疗效,部分“

小三阳”及低水平病毒复制时出现阴性。不能反映机体的免疫状况和病情三、

时间分辨荧光检测

HBsAg与其它方法的比较51TRFIA与Elecsys

Systems

2010检测

HBsAg定性结果比较52TRFIAElecsys

Systems

2010阳性阴性合计阳性60060阴性04040总数6040100灵敏度＝〔40／(0＋40)〕×100％＝100％53灵敏性＝〔60／(0＋60)〕×100％＝100％两者符合率

100％与

EIA

检测

HBsAg定性结果比较54TRFIAEIA阳性阴性合计阳性59160阴性04040总数5941100与Elecsys

Systems

2010检测

HBsAg定量结果比较Elecsys

Systems

2010

检测

HBsAg(COI)与TRFIA检测HBsAg(ng/L)的相关性＝0、98755TRFIA在乙肝“两对半”定量检测应用56一、 极大地提高了检测的灵敏度TRFIA检测HbsAg灵敏度可达0、2ng/ml,而酶标(ELISA)检测HbsAg灵敏度是2ng/ml,也就是说只有血清中的HbsAg达到2ng/ml酶标才会呈阳性。1、缩短急性乙肝HBsAg

检测“窗口期”572、如病毒发生变异后,表达量较低,常规

ELISA测不出抗原,而TRFIA定量具有极高的灵敏度,可发现并极有估计同时检测出HbsAg和抗-Hbs。3

可发现低浓度HbsAg携带者。特别是一些群体如医护工作者、病人家属等,由于长期紧密接触,但又非直截了当经血传播感染成急性乙肝,而是长期少量感染,并刺激机体产生一定的免疫力,估计呈低浓度感染,特别应当引起人们的足够重视,紧密关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者。58二、

动态观察疗效和病情监测。59疾病的发生、发展、疗效、预后是一个动态的变化的过程,TRFIA定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起一个全程动态检测的作用,能够为医生对病情疗效作出合理的解释提供依据,指导治疗。1、定量分析HbsAg和抗-Hbs的浓度变化,能够预见急性乙肝是否处于恢复期。如HbsAg浓度降低,抗-Hbs的浓度逐渐升高,可说明病情正往恢复期发展。反之,HbsAg浓度处于较高水平或上升趋势,而抗-Hbs一直处于较底水平,则容易发展为慢性乙肝或携带者。602、定量分析HbeAg和抗-Hbe的浓度变化,能够反映病情变化和治疗效果。明确检测HbeAg向抗-Hbe转换的时期,即表现为HbeAg浓度下降和抗-Hbe浓度升高的过程。高浓度的HbeAg还可间接提示病毒处于高复制状态,具有较高的传染性。高浓度的抗-Hbe一方面提示病情的好转,而在某些时候(如肝功能指标特别差)估计与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。613、抗-Hbc浓度的高低能够反映病毒感染的状态。乙肝急性感染常常呈现高浓度的抗-Hbc,恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。624有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定,活动性往往呈进行性变化。63三、 血清HBV-DNA荧光定量PCR测定能