DB15-T 3170-2023 籽用西葫芦种子病毒RT-PCR检测技术规程

发布B内蒙古自治区地方标准DB15/T3170—TechnicalcodeofpracticeforRT-PCRdetectionofseed-usedpumpkin(CucurbitapepoL.)seedvirusDB15/TDB15/T3170—II 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC25）归口。DB15/TDB15/T3170—本文件适用于籽用西葫芦种子中黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）黄瓜花叶病毒cucumbermosaic西瓜花叶病毒watermelonmosaicvirus小西葫芦黄化花叶病毒zucchiniyellowmosaic1DB15/TDB15/T3170—4试剂与材料PremixPremixTaqCMV病毒检测上游引物CMV-F:5´-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3´CMV-R:5´-WMVWMV-F:5´CCAGTGGCAAAGGTGATA-3´WMV-R:5´TGCTGCGTCTGAGAAATG-3´485bpAA.2ZYMV病毒检测上游引物ZYMV-F:5´-ATGCAGAGGCACCATACAT-3´，下游引物ZYMV-R:5´-TACTGCATTGTGTTCACACC-3´283bpAA.3)。TE（4.6）10μmol/L。TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix5仪器和设备Nanodrop2200mL0.5mol/LEDTA-Na2)溶液(pH8.0)186g70100mL12120min。1mol/ITris-HCI)溶液(pH8.0)121.1g800mLpH8.01000mL12120min。TEpH8.0)10mL4.52mL4.41000mL12120min。1×TAE。250.0mg10mL12h250.0mg10mL50.0g30mL3100mL4℃下保存。DNA100bp～500bpDNADB15/TDB15/T3170—6对照设置2mL1mLTRIzolRNA。1.8～2.0RT-PCR以总RNAcDNA1μgRNA1μLAnchoredTS1μL1μLgDNARemover，轻轻混匀，4230min。855sec终止反应，-20℃冰箱保存备用。3DB15/TDB15/T3170—表1PCRPremix10μmol/L10μmol/L补足ZYMV50），721min，35；7210min，4PCR扩增片段是否为目的DNA8.4.3CMVCMVCMVCMVCMVCMVCMVRNA，RT-PCRWMVWMVWMVWMVWMV4DB15/TDB15/T3170—55WMVWMVRNA，RT-PCR判定条件：RT-PCR283bp（BB.2ZYMVZYMVZYMVZYMVZYMVZYMVRNART-PCRDB15/TDB15/T3170—附录注1：序列方向为5´-3´注2：5´下划线为PCR方法上游引物序列，3´下划线为PCR6DB15/TDB15/T3170—7附录图B.1RNACMV/WMV/ZYM