体内药物分析课件

藥物分析與生物藥物分析

緒論一．藥物分析的性質

药物分析是以药品质量控制为研究目的一门学科。主要运用化学、物理学或生物学等学科的方法和技术研究各种药物及其制剂（合成药物、天然药物、生物药物及其制剂，中药制剂）的质量控制方法。1．綜合性

常规化学分析；仪器分析；计算药物分析；

X-射線衍射，熱分析；

DNA、蛋白質、基因分析，免疫分析，細胞分析，體內藥物分析。2．指導性

眼睛學科，先峰學科我國中藥製劑目前存在的問題：缺乏明確的品質控制標準，不能很好地打入國際市場。二．藥物分析的主要任務1．常規藥品檢驗藥物分析的主體、核心。分析對象主要是各藥廠生產的常規製劑（已用於臨床）及原料藥、醫院製劑。2．為新藥研究服務如新藥品質標準的制定藥物動力學研究新原料藥的合成，天然產物的研究：結構鑒定，藥物與雜質的分離3．研究藥物分析新方法、新技術分析手段的發展：化學分析

紙色譜、TLC

GC（填充柱、毛細管柱）

HPLC

CE、CEC

各種聯用技術分析狀態的發展：靜態分析

即時動態分析分析對象的發展：血漿

多細胞

單細胞、單分子手性藥物分析的發展：外消旋體

左、右旋體分別分析研究目的：以新方法、新技術本身為主要目的

---基礎理論研究以分析對象為主要目的---應用研究4．與藥物分析有關的其他工作三．藥品品質標準是國家對藥品品質規格及檢驗方法所作的技術規定，是藥品生產、供應、使用、檢驗和管理部門共同遵循的法定依據。包括：國家藥品標準：藥典、中國生物製品規程等部頒標準：如中國醫院製劑規範地方標準四．藥典pharmacopoeia是記載藥品標準的法典。凡是藥典收錄的藥品，其品質不符合規定標準的均不得出廠，不得銷售，不得使用。（一）中國藥典1．沿革：已出版：1953，1963，1977，1985，1990，1995，2000年版2．基本結構和主要內容ChP由凡例、正文、附錄和索引四部分組成。（1）凡例

1）標準規定：對有關規定、要求和含義等所作的說明。如避光是指用不透光的容器包裝；陰涼處系指不超過20oC等

2）檢驗方法和限度

ChP收載的原料藥及製劑均應按規定方法進行檢驗；或將其他方法與規定方法對照。限度不是真實含量。若未規定上限，系指不超過101.0%。

3）標準品和對照品

指用於鑒別、檢查和含量測定的標準物質。不包括色譜用的內標。標準品：是指用於生物檢定、抗生素或生化藥品中含量或效價測定的標准物質，按效價單位或µg計。對照品：除另有規定外，均按乾燥品或無水物計算後使用。

4）計量：法定計量單位

5）精確度精密稱定：準確至所取重量的千分之一。稱定：準確至所取重量的百分之一。取用量約若干：指該量不得超過規定量的±10%。精密量取：指量取體積的準確度應符合該體積移液管的精密度要求。稱取、量取：其精確度可根據數值的有效數位來確定。如稱取0.1g，指稱取重量可在0.06-0.14g範圍內；2g-----1.5-2.5g；2.0g----1.95-2.05g;2.00g---1.995g-2.005g恒重：小於0.3mg按乾燥品（或無水物，或無溶劑）計算：除另有規定外，應取未經乾燥（或未去水或未去溶劑）的供試品進行試驗，測得乾燥失重後，再在計算時從取用量中扣除．空白試驗：不加供試品或以等量溶劑替代供試液，同法操作所得結果。試驗溫度：如不說明，系指室溫，通常以25±2℃為准。

6）包裝、標籤（2）正文

收載不同藥品、製劑的品質標準。

藥品名稱包括：中文名（中國藥品通用名稱），中文拼音名稱和英文名稱。

*中藥材不使用英文名稱，而採用拉丁名稱。（3）附錄主要內容：製劑通則，生物製品通則，通用檢測方法，生物檢定法，試藥與試液，溶液配製，原子量表等（4）索引：中（按中文拼音順序排列）、英文（二）常用外國藥典１．美國藥典USP與美國國家處方集NF(Nationalformulation)合併出版；從2002年起，USP-NF將原來的每5年一版改為每年出一版，最新版為USP26-NF21。同時還發行了亞洲版。２．英國藥典BP也有《英國國家處方集》配套出版。３．日本藥局方JP４．歐洲藥典Ph.Eur.有英文和法文兩種文本。五．藥品檢驗工作的基本程式1．取樣從大量樣品中取出少量樣品，應考慮取樣的科學性、真實性和代表性。取樣基本原則：均勻、合理。2．藥物的鑒別：判斷藥品的真偽根據藥物的化學結構和理化性質進行某些化學反應，根據反應現象判斷；或測定理化常數或光譜特徵，來判斷。其他包括藥品的外觀、顏色、氣味等的鑒別。應結合多個鑒別試驗結果進行判斷，而不能以單個鑒別試驗判斷，否則會誤判。3．藥物的檢查

主要指純度檢查：是限度檢查4．藥物的含量測定測定主要有效成分的含量。

**第3和第4項可用來判斷藥品品質的優劣。5．檢驗報告的書寫完整、清楚地記錄原始資料，並寫出檢驗報告（給出結論）。六．全面控制藥品品質的科學管理良好藥品實驗研究規範（goodlaboratorypractice,GLP）即藥品非臨床研究品質管理規範。科學、可靠的研究方法才能得出有效、可靠的實驗數據，故需對新藥研究條件作嚴格規定。良好藥品臨床試驗規範（goodClinicalpractice,GCP）

GCP可保護受試者的安全和權利，有助於保證提供有價值的臨床研究資料。良好藥品生產規範（goodmanufacturepractice,GMP）即藥品生產品質管理規範良好藥品供應規範（goodsupplypractice,GSP）保證藥品在運輸、貯存和銷售過程中的品質SomeJournalsor→電子資源→ElsvierSDOSJournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysisJournalofChromatographyAJournalofChromatographyBAnalyticalChimicaActaTalantaTrendsinAnalyticalChemistryJournalofElectroanalyticalChemistryAnalyticalChemistryJournalofMedicinalChemistryMolecularPharmaceuticsBiomacromoleculesBiochemistryAnalyst

ElectrophoresisJournalofPharmaceuticalScienceJournalofSeparationScienceChiralityJournalofMicrocolumnSeparationJournalofMassSpectrosmetryLuminescenceBiomedicalChromatographyBiopharmaceuticsanddrugDispositionDrugdevelopmentResearchElectroanalysisJournalofBioluminescenceandChemiluminescenceSingleMolecules藥學學報中國藥學雜誌藥物分析雜誌藥學通報國外醫學-藥學分冊藥學進展化學學報分析化學高等學校化學學報色譜化學進展各主要大學學報第一章藥物的鑒別試驗

（identificationtest）第一節概述

ChP和其他各國藥典所收載的藥物項下的鑒別試驗方法，僅適用於貯臧在有標籤容器中的藥物，用以證實是否為所標示的藥物。這些方法不能用於鑒別未知物。一．鑒別專案（一）性狀：包括外觀、色澤、臭、味、溶解度及一些物理常數。（二）一般鑒別試驗（generalidentificationtest,GIT）GIT僅適用於確認單一的化學藥物，對多種化學藥物的混合物或有干擾物質存在時，除另有規定外，不適用。GIT只能證實藥物的類別，將藥物與其它類別的藥物區分開，不能證實是哪一種藥物。（三）專屬鑒別試驗（specificidentification,SIT)在GIT的基礎上進行，可證實藥物屬於某類藥物的哪一種。SIT根據每種藥物化學結構的差異及其所引起的物理化學特性的差異，採用靈敏、選擇性強的定性反應進行。二．鑒別試驗條件1．溶液的濃度：主要指被鑒別藥物的濃度，但其他試劑的濃度也應注意控制，特別是以化學反應產生的化學現象為依據進行鑒別的情況。藥物+試劑

產物（顏色、沉澱等）2．溶液的溫度影響化學反應的快慢。一般溫度每升高10℃，可使反應速度增加2-4倍。3．溶液的酸鹼度溶液的酸鹼度應能使各反應物有足夠的濃度處於反應活化狀態，並使反應生成物處於穩定、易於觀測的狀態。4．干擾成分採用專屬性更高的鑒別反應或將干擾成分分離除去，以消除干擾。５．試驗時間對有機化合物的化學反應影響較大。因為有機反應能否進行，取決於舊共價鍵斷裂和新共價鍵形成的難易，而這些共價鍵的更替需要一定時間。三．鑒別試驗的靈敏度sensitivity

１．反應靈敏度最低檢出量（minimumdetectablequantity,mmin）：應用某一反應，在一定反應條件下，能觀測出反應結果所需的供試品的最小量。最低檢出濃度（minimumdetectableconcentration,Cmin）：應用某一反應，在一定反應條件下，能觀測出反應結果所需的供試品的最小濃度。**檢測限（limitofdetection,LOD）zeptomole:10-21zmol；attomole:10-18amolfemtomole:10-15fmol；picomole:10-12pmolnanomole:10-9nmol2.空白試驗blanktest消除試劑和器皿可能帶來的影響。在與供試品鑒別試驗完全相同的條件下，除不加供試品外（或以等量溶劑替代供試液），其他試劑同樣加入進行的試驗。3．提高反應靈敏度的方法1）消除干擾：如螢光法需濾出天然光和激發光的干擾。2）改進觀測方法：如將目視觀測溶液的顏色改為可見分光光度法。3）加入與水互不相溶的有機溶劑：濃集有色生成物（脂溶性）於有機溶劑中→顏色加深，易觀察。第二節藥物的一般鑒別試驗一．鑒別方法（一）化學鑒別法

1．幹法：無溶劑參與反應焰色試驗：鑒別鹽的類型氣體產生法：在適當溫度條件下，加熱使供試品分解，生成有特殊氣味的氣體。２．濕法：鑒別反應在適當溶劑中進行，發生易於觀測的化學變化，如顏色、沉澱、氣體、螢光等。１）呈色反應鑒別法：常用反應有：三氯化鐵呈色反應：適用於含Ar-OH或可產生Ar-OH的藥物。異羥肟酸鐵反應：多適用於芳酸及其酯類、醯胺類。印三酮呈色反應：多適用於含脂肪胺基的藥物。重氮化-偶合顯色反應：適用於含Ar-NH2

或能產生Ar-NH2

的藥物。氧化還原顯色反應２）沉澱生成反應鑒別法與重金屬離子的沉澱反應：重金屬指比重大於5的金屬，如Cu，Ni，Pb，Zn，Sn，W等。與硫氰化鉻銨（雷氏鹽）的沉澱反應：主要適用於生物鹼及其鹽、具有芳香環的有機堿及其鹽。

3）螢光反應鑒別法螢光：是分子吸收了較短波長的光（激發光，通常為可見和UV光），在很短時間內發射出的較長波長的光。除去激發光源後，螢光立即熄滅。

常用螢光發射形式：藥物本身在UV或可見光下發射螢光----自發螢光。藥物溶液+硫酸呈酸性後，發射；藥物+Br2反應後，發射；藥物+間苯二酚反應後，發射----衍生後發螢光。４）氣體生成反應鑒別法

氨氣（胺氣）生成法：適用於胺（銨）類、醯胺類及醯脲類藥物。藥物經強鹼處理後，加熱，可產生NH3or胺氣。

H2S氣體生成法：適用於含硫藥物。經強酸處理，加熱，產生H2S。碘蒸氣生成法：適用於含碘有機藥物。經直火加熱，生成紫色碘蒸氣。醋酸乙酯生成法：適用於含醋酸酯的藥物和乙醯胺類藥物。二．電磁輻射與電磁波譜1.光：是一種電磁輻射（即電磁波）。具有波粒二相性。光的波動性：用波長、波數和頻率表徵

ν=c/λ光的微粒性：用每個光子具有的能量表徵

E=hνh=6.63×10-34J.S2.電磁波譜γ射線→X射線→UV→可見→紅外→微波→無線電波波長逐漸變長三．電磁輻射與物質的相互作用常見電磁輻射與物質相互作用的術語：１．吸收：是原子、分子或離子吸收光子的能量（等於基態和激發態能量之差），從基態躍遷至激發態的過程。２．發射：是物質從激發態躍遷回基態，並以光的形式釋放能量的過程。３．散射：是光通過介質時，與介質分子發生彈性碰撞所致，碰撞時沒有能量交換，光頻率不變，但光子的運動方向發生改變。三．電磁輻射與物質的相互作用４．拉曼散射：是光通過介質時，與介質分子發生非彈性碰撞所致，碰撞時不僅光子的運動方向發生改變，而且還有能量交換，光頻率發生變化。５．折射和反射６．干涉和衍射四．光學分析法的分類

表1:原理分析方法輻射的發射1)發射光譜法2）螢光光譜法3）火焰光度法輻射的吸收1）比色法2）分光光度法（可見，紫外，紅外等）

3）原子吸收法4）核磁共振法輻射的散射1）拉曼散射2）散射濁度法輻射的折射折射法輻射的衍射1）X-射線衍射法2）電子衍射法輻射的旋轉1）偏振法2）旋光法3）圓二色光譜法（一）光譜法與非光譜法１．光譜法：利用物質的光譜進行定性定量和結構分析的方法。有3種基本類型：吸收光譜法、發射光譜法和散射光譜法光譜（spectrum）是物質與輻射能相互作用時，物質內部發生能級躍遷所產生的輻射能強度隨波長變化的圖譜。

2．非光譜法：不涉及物質內部能級的躍遷，即不以光的波長為特徵訊號，僅測量電磁輻射的某些基本性質（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所發生的變化。（二）原子光譜法和分子光譜法原子光譜法：以測量氣態原子或離子外層或內層電子躍遷所產生的光譜。線狀光譜。分子光譜法：是分子中電子能級、振動能級和轉動能級發生變化產生的光譜。帶狀光譜。IR,UV,分子螢光等。（三）吸收光譜法與發射光譜法吸收光譜：是物質吸收相應的輻射能而產生的光譜。利用物質的吸收光譜進行定性定量及結構分析的方法為吸收光譜法。如UV-Vis,IR,NMR發射光譜：是物質的原子、離子或分子受到輻射能、熱能、電能或化學能的激發躍遷至激發態後，又從激發態回到基態時以輻射的方式釋放能量而產生的光譜。如原子發射光譜法，原子螢光光譜法，分子螢光光譜法，磷光光譜法等．五．光譜分析儀器研究吸收或發射的電磁輻射強度與波長關係的儀器稱分光光度計。其組成圖大致如下：輻射源→分光系統→樣品池→檢測器→訊號處理及顯示器1．分光系統將複合光分解成單色或有一定波長範圍的譜帶。分為單色器和濾光片。單色器由入射狹縫、出射狹縫、准直鏡和色散元件組成。其中色散元件是心臟，有棱鏡和光柵。濾光片有：帶通濾光片：只能分出一個波長帶；截止濾光片：只能消除給定波長以上或以下的所有輻射。凹口濾光片：2．檢測器：多採用光電轉換器，包括量子化檢測器（如光電倍增管）和熱檢測器（如真空熱電偶）．第二章紫外-可見分光光度法一．基本原理和概念UV-Vis是研究物質在紫外-可見光區（UV:200-400nm，Vis:400-800nm）分子吸收光譜的分析方法。（一）UV-Vis的常用概念1．吸收光譜吸收度或透光率與波長的關係曲線。2．吸收峰及最大吸收波長λmax3.峰穀及最小吸收波長λmin4.肩峰(shoulderpeak):在一個吸收峰旁邊產生的一個曲折。5．末端吸收（endabsorption）：在圖譜短波端呈現強吸收但不成峰形的部分。（二）定量原理——Lambert-Beer定律A=-lgT=ECL描述物質對單色光吸收的強弱與吸光物質的濃度與厚度間關係的定律。吸收係數可用於定性定量。百分吸收係數：指在一定波長下，溶液濃度為1%（W/V,g/ml）,溶液厚度為1cm時的吸光度．摩爾吸收係數ε：指在一定波長下，溶液濃度為1mol/L,溶液厚度為1cm時的吸光度.ε=(M/10)×

M為摩爾品質吸光度的加合性：混合組分的吸光度是各組分吸光度的和。（三）定性依據

吸收光譜：最大吸收波長吸收係數兩波長處吸收度比值（四）影響測定準確性的因素1．偏離Beer定律的因素光學因素：單色光不純，比色皿厚度的均勻度不合要求。

化學因素：若溶液為膠體溶液或混濁，則入射光通過溶液時部分光會散射或反射而損失；溶液中的溶質因濃度改變而發生解離、締合、與溶劑相互作用等變化，使吸收發生改變，偏離Beer定律。2．透光率測定誤差來自儀器的噪音

可見，濃度相對誤差取決於透光率及其測量誤差的大小。A在0.2－0.7範圍時，濃度測量值的相對誤差較小。二．紫外-可見分光光度計1．光源鎢燈和鹵鎢燈：發可見光氫燈和氘燈：發紫外光2．單色器3．吸收池光學玻璃吸收池：只能用於可見光區。熔融石英（氧化矽）吸收池：在紫外光區和可見光區都可用。4．檢測器常用光電倍增管、光二極體陣列檢測器（photo-diodearraydetector）三．UV-Vis分析方法（一）定性鑒別

UV-Vis一般採用對比法進行定性鑒別。將試樣的吸收光譜特徵與標準化合物的吸收光譜特徵進行對照比較。１．對比吸收光譜特徵數據２．對比吸收度或吸收係數的比值可消除溶液濃度和吸收厚度的影響。３．對比吸收光譜的一致性（二）純度檢查1．雜質檢查2．雜質的限量檢查：後面講（三）定量測定1．測定方法的建立（１）查文獻，根據化學結構確定有無紫外吸收（２）測定條件的選擇：通過測定吸收光譜，確定波長：一般選擇

max，以提高靈敏度並減少誤差；或無干擾且吸收度較大的峰對應的波長；不選擇末端吸收波長。溶劑的選擇：（３）估算靈敏度，決定取樣量標準曲線線性範圍的吸收度最好在0.2-0.7之間。（4）空白液：一般以空白體液的提取液為空白，消除體液中其他物質的干擾。2．單組分的定量方法1）吸收係數法：單色光很純時採用

C=A/(εl)2）校正曲線法必須使用相同儀器，且固定工作狀態和測定條件，否則吸光度和濃度之間的關係就會偏離線性。３）對照法

Cx=(Ax/As)×Cs

Cs:標準溶液的濃度。在相同儀器、相同波長下測定。標準物和試樣為相同物質。３．同時測定多組分的定量方法

—計算分光光度法樣品中有兩種組分共存時，各組分吸收光譜相互重疊的程度主要三種：各組分的吸收峰處，其他組分沒有吸收：可按單組分的測定方法，分別在各自的吸收峰處測定。各組分的吸收光譜有部分重疊：可先在λ1處按單組分測定法測得混合溶液中a組分的濃度Ca，再在λ2處測定混合溶液的吸收度A2(a+b),則可根據吸收度的加和性計算組分b的濃度Cb.

A2(a+b)=A2a+A2b=E2a×Ca+E2b×Cb各組分的吸收光譜完全重疊（相互干擾）：最常見的情況。可採用以下方法測定。１）差示分光光度法（differencespectrophotometry）不需事先分離，能消除背景吸收和干擾物對供試液測定的影響。測定方法與原理：取兩份相等的供試液，製成兩種不同的化學環境（如在其一中加酸或堿，改變pH；或在其一中加入能與供試品發生化學反應的試劑），供試品在不同的化學環境中以兩種不同的化學形式存在（如分子型與離子型，氧化型與還原型），且兩種化學形式的吸收光譜有顯著差異；而背景吸收和干擾物的吸收不受化學環境的影響。將兩份供試液稀釋到相同濃度，分別置於樣品池和參比池中，於適當波長處測定吸收度的差值(∆A)，即可對供試品進行定量。二．電磁輻射與電磁波譜1.光：是一種電磁輻射（即電磁波）。具有波粒二相性。光的波動性：用波長、波數和頻率表徵

ν=c/λ光的微粒性：用每個光子具有的能量表徵

E=hνh=6.63×10-34J.S2.電磁波譜γ射線→X射線→UV→可見→紅外→微波→無線電波波長逐漸變長三．電磁輻射與物質的相互作用常見電磁輻射與物質相互作用的術語：１．吸收：是原子、分子或離子吸收光子的能量（等於基態和激發態能量之差），從基態躍遷至激發態的過程。２．發射：是物質從激發態躍遷回基態，並以光的形式釋放能量的過程。３．散射：是光通過介質時，與介質分子發生彈性碰撞所致，碰撞時沒有能量交換，光頻率不變，但光子的運動方向發生改變。三．電磁輻射與物質的相互作用４．拉曼散射：是光通過介質時，與介質分子發生非彈性碰撞所致，碰撞時不僅光子的運動方向發生改變，而且還有能量交換，光頻率發生變化。５．折射和反射６．干涉和衍射四．光學分析法的分類

表1:原理分析方法輻射的發射1)發射光譜法2）螢光光譜法3）火焰光度法輻射的吸收1）比色法2）分光光度法（可見，紫外，紅外等）

3）原子吸收法4）核磁共振法輻射的散射1）拉曼散射2）散射濁度法輻射的折射折射法輻射的衍射1）X-射線衍射法2）電子衍射法輻射的旋轉1）偏振法2）旋光法3）圓二色光譜法（一）光譜法與非光譜法１．光譜法：利用物質的光譜進行定性定量和結構分析的方法。有3種基本類型：吸收光譜法、發射光譜法和散射光譜法光譜（spectrum）是物質與輻射能相互作用時，物質內部發生能級躍遷所產生的輻射能強度隨波長變化的圖譜。

2．非光譜法：不涉及物質內部能級的躍遷，即不以光的波長為特徵訊號，僅測量電磁輻射的某些基本性質（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所發生的變化。（二）原子光譜法和分子光譜法原子光譜法：以測量氣態原子或離子外層或內層電子躍遷所產生的光譜。線狀光譜。分子光譜法：是分子中電子能級、振動能級和轉動能級發生變化產生的光譜。帶狀光譜。IR,UV,分子螢光等。（三）吸收光譜法與發射光譜法吸收光譜：是物質吸收相應的輻射能而產生的光譜。利用物質的吸收光譜進行定性定量及結構分析的方法為吸收光譜法。如UV-Vis,IR,NMR發射光譜：是物質的原子、離子或分子受到輻射能、熱能、電能或化學能的激發躍遷至激發態後，有激發態回到基態時以輻射的方式釋放能量而產生的光譜。如原子發射光譜法，原子螢光光譜法，分子螢光光譜法，磷光光譜法等．五．光譜分析儀器研究吸收或發射的電磁輻射強度與波長關係的儀器稱分光光度計。其組成圖大致如下：輻射源→分光系統→樣品池→檢測器→訊號處理及顯示器1．分光系統將複合光分解成單色或有一定波長範圍的譜帶。分為單色器和濾光片。單色器由入射狹縫、出射狹縫、准直鏡和色散元件組成。其中色散元件是心臟，有棱鏡和光柵。濾光片有：帶通濾光片：只能分出一個波長帶；截止濾光片：只能消除給定波長以上或以下的所有輻射。凹口濾光片：2．檢測器：多採用光電轉換器，包括量子化檢測器（如光電倍增管）和熱檢測器（如真空熱電偶）．第二章紫外-可見分光光度法一．基本原理和概念UV-Vis是研究物質在紫外-可見光區（UV:200-400nm，Vis:400-800nm）分子吸收光譜的分析方法。（一）UV-Vis的常用概念1．吸收光譜吸收度或透光率與波長的關係曲線。2．吸收峰及最大吸收波長λmax3.峰穀及最小吸收波長λmin4.肩峰(shoulderpeak):在一個吸收峰旁邊產生的一個曲折。5．末端吸收（endabsorption）：在圖譜短波端呈現強吸收但不成峰形的部分。（二）定量原理——Lambert-Beer定律A=-lgT=ECL描述物質對單色光吸收的強弱與吸光物質的濃度與厚度間關係的定律。吸收係數可用於定性定量。百分吸收係數：指在一定波長下，溶液濃度為1%（W/V,g/ml）,溶液厚度為1cm時的吸光度．摩爾吸收係數ε：指在一定波長下，溶液濃度為1mol/L,溶液厚度為1cm時的吸光度.ε=(M/10)×

M為摩爾品質吸光度的加合性：混合組分的吸光度是各組分吸光度的和。（三）定性依據

吸收光譜：最大吸收波長吸收係數兩波長處吸收度比值（四）影響測定準確性的因素1．偏離Beer定律的因素光學因素：單色光不純，比色皿厚度的均勻度不合要求。

化學因素：若溶液為膠體溶液或混濁，則入射光通過溶液時部分光會散射或反射而損失；溶液中的溶質因濃度改變而發生解離、締合、與溶劑相互作用等變化，使吸收發生改變，偏離Beer定律。2．透光率測定誤差來自儀器的噪音

可見，濃度相對誤差取決於透光率及其測量誤差的大小。A在0.2－0.7範圍時，濃度測量值的相對誤差較小。二．紫外-可見分光光度計1．光源鎢燈和鹵鎢燈：發可見光氫燈和氘燈：發紫外光2．單色器3．吸收池光學玻璃吸收池：只能用於可見光區。熔融石英（氧化矽）吸收池：在紫外光區和可見光區都可用。4．檢測器常用光電倍增管、光二極體陣列檢測器（photo-diodearraydetector）三．UV-Vis分析方法（一）定性鑒別

UV-Vis一般採用對比法進行定性鑒別。將試樣的吸收光譜特徵與標準化合物的吸收光譜特徵進行對照比較。１．對比吸收光譜特徵數據２．對比吸收度或吸收係數的比值可消除溶液濃度和吸收厚度的影響。３．對比吸收光譜的一致性（二）純度檢查1．雜質檢查2．雜質的限量檢查：後面講（三）定量測定1．測定方法的建立（１）查文獻，根據化學結構確定有無紫外吸收（２）測定條件的選擇：通過測定吸收光譜，確定波長：一般選擇

max，以提高靈敏度並減少誤差；或無干擾且吸收度較大的峰對應的波長；不選擇末端吸收波長。溶劑的選擇：（３）估算靈敏度，決定取樣量標準曲線線性範圍的吸收度最好在0.2-0.7之間。（4）空白液：一般以空白體液的提取液為空白，消除體液中其他物質的干擾。2．單組分的定量方法1）吸收係數法：單色光很純時採用

C=A/(εl)2）校正曲線法必須使用相同儀器，且固定工作狀態和測定條件，否則吸光度和濃度之間的關係就會偏離線性。３）對照法

Cx=(Ax/As)×Cs

Cs:標準溶液的濃度。在相同儀器、相同波長下測定。標準物和試樣為相同物質。３．同時測定多組分的定量方法

—計算分光光度法樣品中有兩種組分共存時，各組分吸收光譜相互重疊的程度主要三種：各組分的吸收峰處，其他組分沒有吸收：可按單組分的測定方法，分別在各自的吸收峰處測定。各組分的吸收光譜有部分重疊：可先在λ1處按單組分測定法測得混合溶液中a組分的濃度Ca，再在λ2處測定混合溶液的吸收度A2(a+b),則可根據吸收度的加和性計算組分b的濃度Cb.

A2(a+b)=A2a+A2b=E2a×Ca+E2b×Cb各組分的吸收光譜完全重疊（相互干擾）：最常見的情況。可採用以下方法測定。１）差示分光光度法（differencespectrophotometry）不需事先分離，能消除背景吸收和干擾物對供試液測定的影響。測定方法與原理：取兩份相等的供試液，製成兩種不同的化學環境（如在其一中加酸或堿，改變pH；或在其一中加入能與供試品發生化學反應的試劑），供試品在不同的化學環境中以兩種不同的化學形式存在（如分子型與離子型，氧化型與還原型），且兩種化學形式的吸收光譜有顯著差異；而背景吸收和干擾物的吸收不受化學環境的影響。將兩份供試液稀釋到相同濃度，分別置於樣品池和參比池中，於適當波長處測定吸收度的差值(∆A)，即可對供試品進行定量。設x、y分別代表兩種不同化學環境中供試品的兩種不同化學形式，它們在測定波長處的吸收度以Ax和Ay表示；背景吸收和干擾物的吸收度為Az，則：

∆A=A樣品–A參比

=（Ax+Az）-(Ay+Az)=Ax–Ay=εxCL-εyCL=(εx–εy)CL具體測定方法有3種（見《體內藥物分析》p82）：

1)利用最大吸收波長處的吸收度差定量；

2)利用最小吸收波長處的吸收度差定兩；

3)利用差示光譜中最大吸收與最小吸收之差定量。2)雙波長分光光度法一般用雙波長分光光度計測定。A.等吸收點雙波長法原理：以a、b兩組分為例。選擇兩個測定波長，使干擾組分a在兩波長處有等吸收，而待測組分在兩波長處的吸收度有顯著差別。測定混合物溶液在兩波長處的吸收度之差即可對待測組分進行定量。∆A=Aλ2(a+b)-Aλ1(a+b)

=(Aλ2a+Aλ2b)-(Aλ1a+Aλ1b)=Aλ2b-Aλ1b=(ελ2b-ελ1b)CbL2)雙波長分光光度法B.係數倍率法當干擾組分沒有等吸收波長或雖有等吸收波長而待測組分的∆A較小時，等吸收點雙波長法則不能使用。可用係數倍率法。原理：在選定的兩波長處，利用雙波長分光光度計的信號放大裝置，將一個波長處的吸收信號放大k倍，使干擾組分a在兩波長的吸收度相等,

即Aλ1a=kAλ2a。測定混合物溶液在兩波長處的吸收度之差即可對待測組分進行定量。

∆A=kAλ2(a+b)-Aλ1(a+b)=(kAλ2a+kAλ2b)-(Aλ1a+Aλ1b)=kAλ2b-Aλ1b=(kελ2b-ελ1b)CbL當k=1時，即是等吸收點法。應選擇使k值盡可能接近於1的波長對進行實驗。3）導數分光光度法A導數光譜的波型和特點零階光譜的極大在奇數階的導數光譜中相應於0，在偶數階的導數光譜中相應於極值（極大和極小交替出現）；零階光譜的拐點在奇數階的導數光譜中產生極值，在偶數階的導數光譜中相應於0；隨著導數階數增加，極值數量增加（導數階數+1），譜帶邊窄，分辨能力提高。因此導數光譜在定性分析中十分有用。B消除干擾組分吸收的原理若干擾組分的吸收對波長呈線性，可用一階導數法消除干擾：

A總

=εCL+(aλ+b)dA/dλ=(dε/dλ)CL+a定量參數D=（dA/dλ）峰

-（dA/dλ）穀

=[（dε/dλ）峰

-（dε/dλ）穀]CL對給定波長，(dε/dλ)峰、(dε/dλ)穀為常數第三章螢光分析法

fluorometry一.概述

fluorometry是根據物質螢光譜線的位置及強度進行物質鑒定和含量測定的方法。靈敏度比UV-Vis法高，但重現性不如UV-Vis法。光致發光：常見光致發光有螢光和磷光。化學發光（Chemiluminescence,CL）：是指吸收了化學反應能的原子或分子由激發態回到基態時產生的一種光輻射現象。分子螢光：待測物質是分子。原子螢光：待測物質是原子。激發光：UV-Vis光，IR光，X-射線等

二．基本原理（一）分子螢光的產生1．振動弛豫vibrationalrelaxation：處於激發態各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發態的最低振動能級的過程。振動弛豫屬於無輻射躍遷，因為能量不是以光輻射的形式放出的。2．內部能量轉換internalconversion：受激分子由高電子能級以無輻射方式轉移至低電子能級的過程。3．外部能量轉換externalconversion:溶液中的激發態分子與溶劑分子或與其他溶質分子之間相互碰撞而失去能量，並以熱能的形式釋放能量的過程。4．螢光發射：物質分子從激發態的最低振動能級返回基態時，以輻射形式發射光量子，這些光量子就稱為螢光。由於振動弛豫、內部能量轉換和外部能量轉換損失了部分能量，故螢光的波長總比激發光波長長。

(二)激發光譜和發射光譜激發光譜（excitationspectrum）：表示不同激發波長的光引起物質發射某一波長螢光的相對效率。繪製激發光譜曲線時，固定發射單色器在某一波長，通過激發單色器掃描，以不同波長的光激發物質，記錄螢光強度對激發光波長的關係曲線，即得激發光譜。類似於吸收光譜。發射光譜（或稱螢光光譜，fluorescencespectrum）：表示在所發射的螢光中，各種波長螢光組分的相對強度。繪製發射光譜時，使激發光的波長和強度保持不變，通過發射單色器掃描以檢測各種波長下相應的螢光強度。記錄螢光強度對發射波長的關係曲線，即得螢光光譜。激發光譜和發射光譜可用於鑒別螢光物質，且是選擇測定波長的依據。

(三)螢光效率

（fluorescenceefficency）即螢光量子效率，指激發態分子發射螢光的光子數與基態分子吸收激發光的光子數之比。φf=發射螢光的光子數/吸收螢光的光子數一般在0—1之間。(四)有機化合物分子結構

與螢光的關係能發射螢光的物質需同時具備2個條件：有強的紫外-可見吸收：具有π-π*躍遷的長共軛分子有；具有一定的螢光效率：有剛性平面結構的分子有。1.長共軛結構與螢光的關係：含芳香環或芳香雜環的物質具有長共軛的π-π*躍遷，能產生螢光。π電子共軛程度越大，則螢光強度越大，螢光波長也長移。

λex205nmλex286nmλem356nmλem278nmλem321nmλex404nmφf=0.11φf=0.29φf=0.362.分子的剛性與螢光的關係：在相同的長共軛分子中，分子的剛性越強，螢光效率越大，螢光波長越長。

φf=0.2φf=1.03.取代基與螢光的關係

給電子取代基：-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-NR2,-CN能增加分子的π電子共軛程度，螢光效率提高，螢光波長長移。吸電子取代基：-COOH,-NO2,-C=O,-NO,-F,-Cl,-Br,-I等。能減弱分子的π電子共軛程度，螢光效率減弱甚至熄滅。(五)螢光試劑與弱螢光物質或不顯螢光的物質作用，得到強螢光性衍生物。常用試劑：螢光胺，鄰苯二甲醛（OPA）,丹醯氯，丹醯肼，8-羥基喹啉（常用於無機離子的衍生）等。(六)影響螢光強度的外部因素1.溫度：一般，溫度升高，溶液中螢光物質的螢光強度和螢光效率降低。因溫度升高，分子運動速度加快，分子碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加。2.溶劑極性:一般，溶劑的極性增加，螢光波長長移，螢光強度增加。因極性溶劑中，π-π*躍遷的能量差減小，使激發波長和螢光波長均長移，躍遷幾率增加，螢光強度增加。粘度：粘度減小，分子碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，螢光減弱。3.酸度：當螢光物質本身是弱酸或弱鹼時，溶液的酸度對其螢光強度影響較大。因螢光物質有其最適宜的發射螢光的存在形式。苯胺：pH7-12,主要以分子形式存在，-NH2能提高螢光效率。發射藍色螢光。當溶液的pH<2或pH>13時，以離子形式存在，不能發射螢光。4.螢光熄滅劑quenchingmedium：能與螢光物質相互作用,使其螢光強度降低或熄滅的物質。螢光熄滅劑會使螢光分析產生誤差。螢光熄滅法：如果一種螢光物質在加入某種熄滅劑後，螢光強度的降低和螢光熄滅劑的濃度成線性關係，則可利用這一性質測定螢光熄滅劑的含量。5.散射光：一束光照在溶液中時，與溶液中的物質分子相互碰撞，使光子的運動方向發生改變而向不同角度散射，這種光稱散射光。又分為：瑞利光（Reyleighscatteringlight）：光子與物質分子發生彈性碰撞時，產生的散射光。其波長與入射光波長相同。拉曼光（Ramanscatteringlight）：光子與物質分子發生非彈性碰撞時，光子把部分能量轉移給物質分子或從物質分子獲得部分能量，而發射出比入射光稍長或稍短的光，這種光稱拉曼光。散射光對螢光測定有干擾，尤其是比入射光波長更長的拉曼光，干擾更大。

三.螢光定量分析（一）定量原理

螢光強度正比於被螢光物質吸收的光強度：F=K(I0-I)根據beer定律：I=I010-ECL,則F=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL)=KI0[1-(1++++……)]=KI0[2.3ECL---…)]當濃度很小時（即當ECL

0.05時），上式簡化為：

F=2.3KI0ECL

即低濃度時，溶液的螢光強度與螢光物質的濃度成線性關係。且與受下列因素的影響：螢光量子效率；入射光強度；化合物的吸收係數。（二）定量方法1．標準曲線法：以空白溶液調0（螢光強度為0），以標準系列中最大濃度的標準溶液調100%（螢光強度為100%）。2．對照法：若標準曲線通過0點，可用對照法定量。

Cx=×Cs當空白溶液的螢光強度不能調到0時，必須扣出。四．螢光分光光度計1．激發光源：汞燈，氙燈，鐳射2．濾光片：2個，激發濾光片位於光源和樣品池之間；螢光濾光片位於樣品池和檢測器之間。3．樣品池4．檢測器：PMT收集螢光的方向:與激發光源的方向垂直五．測定方法的建立1．根據文獻及結構,判斷物質的螢光性質2．作激發光譜和螢光光譜，選擇最佳激發波長和發射波長3．定性方法：比較待測組分與標準品的最大發射波長、螢光強度、螢光光譜等。3．定量方法：一.概述重要性:

歷史上兩次諾貝爾化學獎都直接與色譜研究相關1948年瑞典科學家Tiselins因電泳和吸附分析的研究獲獎；1952年英國的Martin和Synge因發展了分配色譜獲獎。色譜法的創建:色譜法創始於20世紀初，1903年由俄國植物學家Tsweet發現,並於1906年發表論文,將這種方法命名為“色譜”。二.色譜法分類1.按流動相與固定相的分子集聚狀態分：流動相可為氣體、液體和超臨界流體；固定相可為液體和固體；以化學鍵合固定相進行的色譜法稱為鍵合相色譜法。2.按操作形式分：柱色譜法，平面色譜法，毛細管電泳法等3.按色譜過程的分離機制分：分配色譜法，吸附色譜法，離子交換色譜法，空間排阻色譜法，CE,CEC等.三．基本原理和概念（一）色譜過程實現色譜操作的基本條件：必須具備相對運動的兩相，即：固定相（stationaryphase）：固定不動；流動相（mobilephase）：攜帶試樣向前移動的流動體。色譜過程：組分分子在流動相和固定相間多次分配的過程。（二）色譜流出曲線和有關概念1．色譜流出曲線和色譜峰1）色譜流出曲線：由檢測器輸出的回應信號對時間作圖所得到的曲線，即色譜圖。2）基線：在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線。反映儀器（主要是檢測器）的噪音隨時間的變化。3）色譜峰：正常峰：對稱形正態分佈曲線。拖尾峰（tailingpeak）：前沿陡峭，後沿平緩。前延峰（leadingpeak）：後沿陡峭，前沿平緩。對稱因數fs(symmetryfactor)或拖尾因數（tailingfactor）:fs=W0.05h/2A=(A+B)/2AW0.05h為0.05倍色譜峰高處的色譜峰寬。A,B分別為0.05倍色譜峰高處的色譜峰前沿、後沿與色譜峰頂點至基線的垂線之間的距離。fs=0.95-1.05對稱峰;小於0.95為前延峰;大於1.05為拖尾峰.描述色譜峰的參數：峰高和峰面積：用於定量；保留值：定性；峰寬：衡量柱效。2．保留值1）保留時間（retentiontime,tR）：從進樣到某組分在柱後出現濃度極大時的時間間隔。2）死時間(deadtime,t0)：不被固定相吸附或溶解的組分的保留時間。3)調整保留時間（adjustedretentiontime,t’R）:t’R=tR–t04)保留體積（retentionvolume,VR）:從進樣到某組分在柱後出現濃度極大時,所需通過色譜柱的流動相體積。

VR=tR×Fc流動相流速（體積流速，ml/min）越大，保留時間越短，二者的乘積不變，即VR與流動相流速無關。5）死體積（deadvolume,V0）:

從進樣器至檢測器的流路中未被固定相佔有的空間。是色譜柱中固定相顆粒間間隙、進樣器到色譜柱間導管的容積、柱出口導管及檢測器內腔容積的總和。

V0=t0×Fc

死時間相當於流動相充滿死體積所需的時間。6）調整保留體積（adjustedretentionvolume,V’R）7)相對保留值（relativeretention,rorα）:

色譜系統的選擇性指標。8）保留指數（retentionindex,I）

GC中，把組分的保留行為換算成相當於正構烷烴的保留行為，即以正構烷烴作為組分相對保留值的標準，用2個保留時間緊鄰待測組分的基準物質來標定組分，這個相對值稱保留指數。又稱Kovats指數。

Ix=100[z+n]z和z+n為正構烷烴的碳原子數,n一般為13．色譜峰高和峰面積1）peakheight,h2)peakarea,A4.色譜峰區域寬度1）標準差（standarddeviation,σ）:0.607倍峰高處的峰寬之半。2）半峰寬（peakwidthathalfheight,W1/2）

W1/2=2.355σ3)峰底寬（peakwidth,W）:通過色譜峰兩側拐點作切線，在基線上所截得的距離

W=1.699W1/2=4σ5.分離度(resolution,R)R=R=1.5時，兩峰完全分開，稱基線分離。（三）分配係數與色譜分離1．分配係數和容量因數分配係數（distributioncoefficient,K）:

在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相和流動相中的濃度之比

K=Cs/CmK與組分、固定相和流動相的性質和溫度有關。在固定相、流動相和溫度一定時，K是組分的特徵參數。容量因數（capacityfactor,k）在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相和流動相中的品質之比

k=ms/mm=(CsVs)/(CmVm)=K×(Vs/Vm)2．K和k與保留時間的關係設流動相的線速度為u，樣品組分的速度為v，將二者之比稱為保留比:R’=v/u(1)

在定距展開的柱色譜中，v=L/tR,u=L/t0,則：

R’=t0/tR(2)

因t0近似於組分在流動相中的時間tm，溶質分子只有出現在流動相中時才能隨流動相前移故保留比與溶質分子在流動相中的分數有關：R’=R’=(3)由（2）和（3）式，得：tR=t0(1+k)(4)tR=t0(1+K)(5)(5)式為色譜過程方程，表示保留時間與分配係數的關係容量因數與保留時間的關係：

k=3．色譜分離的前提兩組分A和B:tRA=t0(1+KA)tRB=t0(1+KB)

∆tR=tRA-tRB=t0(KA–KB)兩組分如果被分離，保留時間必須不等，則兩組分的K必須不等，-------色譜分離的前提。或∆tR=tRA-tRB=t0(kA–kB),即容量因數不等是分離的前提。四．基本類型色譜方法及其分離機制（一）分配色譜法分離原理：利用被分離組分在固定相或流動相中的溶解度差別進行分離

K=Cs/Cm=(Xs/Vs)/(Xm/Vm)Xs:溶解在固定相中的組分溶質分子

Xm:溶解在流動相中的組分溶質分子包括：氣液分配色譜法;液液分配色譜法(正相分配色譜和反相分配色譜)（二）吸附色譜法分離原理：利用被分離組分對固定相表面吸附中心吸附能力的差別進行分離。吸附過程是組分分子和流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心的過程。吸附係數Ka=(Xa/Sa)/(Xm/Vm)Xa:被吸附的組分分子

Xm：流動相中的組分溶質分子

Sa:吸附劑的表面積包括：氣固吸附色譜法和液固吸附色譜法。（三）離子交換色譜法分離原理：利用被分離組分離子交換能力的差別進行分離。

RSO3-H++Na+RSO3-Na++H+

用通式表示：

R-B++A+=R—A+B+

離子交換反應的選擇性係數：

KA/B==KA和KB為分配係數，KA/B越大，說明A的交換能力越大。固定相：離子交換樹脂交聯度交換容量粒度影響保留行為的因素：溶質離子的電荷和水合半徑離子交換劑的交聯度和交換容量流動相組成和pH（四）空間排阻色譜法又稱分子排阻色譜法，凝膠色譜法（gelchromatography分離原理：利用被分離組分分子的線團尺寸差異進行分離。在高分子溶液中，相同成分的分子的線團尺寸與其分子量成正比，因此組分按分子量大小差異進行分離。滲透係數Kp=[Xs]/[Xm]

Kp由溶質分子的線團尺寸和凝膠孔隙大小所決定。凝膠孔隙一定時，分子的線團尺寸越大，越不易進入凝膠孔隙。固定相：凝膠．主要性能參數：1）平均孔徑2）排斥極限：化合物的分子量達到一定值時，就不能進入凝膠的任何孔隙，這一分子量為凝膠的排斥極限；3）分子量範圍：排斥極限與全滲透點（Kp=1）之間的分子量範圍。流動相：應能溶解樣品組分，同時還必須能潤濕凝膠；粘度低總結：根據色譜過程方程：

tR=t0(1+K

)上述各種色譜法中，K分別為分配係數，吸俯係數，選擇性係數和滲透係數，Vs分別為色譜柱內固定相體積，吸附劑表面積，離子交換劑總交換容量和凝膠孔內總容積。五．色譜法基本理論1．塔板理論在解釋流出曲線的形狀、評價柱效等方面比較好。假設：在色譜柱內一小段長度H內，組分可以在2相中瞬間達到分配平衡。樣品和新鮮流動相都加在第0號塔板上。試樣的縱向擴散可以忽略。分配係數在各塔板上是常數。理論塔板高度H（plateheight,heightequivalenttoatheoreticalplate）:

H=L/n理論塔板數n(thenumberoftheoreticalplates):

n=16(tR/W)2=5.54(tR/W1/2)2

1．經典平板電泳的最大局限：

高壓電場產生的焦耳熱效應，導致電泳區帶展寬，分離度降低。這種影響還會由於電場強度的增大而迅速加劇，極大地限制了高電壓的使用，難以提高電泳分離速度。.CE概述

2．CE及其特點毛細管電泳或高效毛細管電泳（CE或HPCE）是以高壓直流電場為驅動力，荷電粒子在毛細管內按其電泳淌度或/和分配係數不同進行分離的一種電泳新技術。和平板電泳相比，CE過程在散熱效率極高的毛細管內進行，從而可引入高電場強度，全面改善分離品質。CE最顯著特點:高效、快速和樣品用量少。3．CE與HPLC的比較CE優勢：柱效更高，分析速度更快，而樣品用量僅為HPLC的幾百分之一；同時，它不需高壓泵輸送系統，溶劑消耗極少，成本相對較低；另外，通過簡單的操作模式和緩沖液體系改變，CE即可實現不同理化性質樣品組分的有效分離，而為了達到類似目的，HPLC需要價格相對昂貴的色譜柱和有機溶劑。3．CE與HPLC的比較CE不足：由於進樣量小，採用柱上線上檢測，光徑長度短，其靈敏度不如HPLC；同時由於電滲流難以定量控制及進樣精確性的影響，CE的分離重現性和定量準確性也比HPLC遜色。4．CE發展趨勢目前，CE仍然是分析化學的一個熱門研究分支，其理論、儀器、應用等各方面都在不斷發展。其中CE在生物學、醫學和藥學領域的應用已相當廣泛，分離分析對象涉及到多肽、蛋白質、核酸、氨基酸、有機藥物、無機離子等多種物質以及單個細胞中各種化學成分。4．CE發展趨勢最新版中國藥典（2000年版）和美國藥典（第26版）均已收錄CE。在今後較長一段時間內，CE將和HPLC並駕齊驅，互為補充，成為生物醫藥學領域的一種重要分離分析工具。二．CE基本理論1．電泳和電泳淌度電泳是帶電粒子在電場作用下的定向遷移。電泳分離是基於組分在電場作用下的差速遷移進行的。帶電粒子在電場下的遷移速度（電泳速度）為：

νe=μeE(1)

式中E為電場強度，是指單位距離的電壓降（V/cm）；μe為電泳淌度，是指單位電場下帶電粒子的遷移速度。對給定粒子、分離介質和操作溫度，電泳淌度為一常數。

處於電場中的帶電粒子以遷移速度νe運動時，受到電場力和粘滯阻力（或稱摩擦力）兩種力的作用，對電場力（FE）有：

FE

=qE(2)而粘滯阻力（FF）正比於粒子的遷移速度，方向與電場力相反：

FF

=fνe

(3)對於球形粒子，f由Stokes定律給出：

f=6πηr(4)式中q為粒子電荷，f為摩擦係數，η為介質粘度，r為粒子半徑。當電場力與摩擦力相對平衡時，離子以穩定速度運動。即：

qE=6πηrνe

(5)顯然，電泳淌度為：

μe

=(6)可見，粒子半徑越小、粒子所帶電荷越多、分離介質的粘度越小，電泳淌度越大。電泳淌度不同是電泳分離的基礎。2.電滲流

電滲流（electrophoresisflow,EOF）或電滲是毛細管內溶液在電場作用下整體朝一個方向運動的現象。形成：對石英毛細管來說，一般情況下，由於矽醇基（-SiOH）電離，管壁表面帶負電，為了保持電荷平衡，溶液中水合陽離子被吸附到表面附近，形成雙電層。當在毛細管兩端加電壓時，雙電層中的陽離子向陰極遷移，由於離子是溶劑化的，因此帶動了毛細管中的整體溶液向陰極遷移，其過程如圖2-1。石英毛細管中的EOF通常是從陽極流向陰極。Figure2-1SchematicofcreatingEOF.EOF大小可用電滲速度（νeo）或電滲淌度（μeo）來表示：

νeo

=E

(7)

μeo=(8)

式中ξ

為雙電層的Zeta電位，ε為分離介質的介電常數。電滲速度可用實驗方法求得：

νeo

=l/teo

(9)

式中l為毛細管有效長度（從進樣端至檢測窗的長度），teo為電滲流標記物（中性物質）從進樣端遷移至檢測窗所需時間。EOF的特點：

(1)平面流型

EOF的一個重要特點是具有平面流型，電滲速度的徑向分佈幾乎是均勻的，不引起樣品區帶擴散。

HPLC中,由於泵驅動,液體和固體表面接觸處的摩擦力會導致壓力下降,因此HPLC的液體流型則是拋物線型，柱管中心速度為平均速度的兩倍，使樣品區帶大大展寬（見圖2-2）。

Figure2-2SchematicoftheflowshapeandthesamplepeaksinCE(a)andHPLC(b).（2）電滲速度大EOF的速度一般比荷電粒子的電泳速度大,因而可以使所有樣品組分（正離子、中性分子、負離子）沿相同方向遷移，實現一次CE操作同時完成正、負離子和中性分子的分離分析。各組分從進樣端遷移到檢測窗所需時間（遷移時間）取決於電滲速度和組分電泳速度的向量和，遷移過程如圖2-3所示。

Figure2-3SchematicforthemigrationofdifferentsamplesinCE.影響EOF的因素（1）電場強度

EOF與電場強度成正比。當毛細管長度固定時，與外加電壓V成正比。但V太高時，由於毛細管不能有效地散失產生的焦耳熱，EOF會偏離線性。（2）緩衝液組成、濃度和pH

對同一種緩衝液，EOF隨濃度增加而降低。因濃度增加，雙電層厚度變薄，Zeta電勢下降，EOF減小。對石英毛細管，pH增加，Si-OH易電離，負電荷密度增大，

Zeta電勢增高，EOF增大。（3）毛細管材料

（4）緩衝液添加劑

中性鹽：增加緩衝液離子強度，抑制矽醇基電離，EOF降低。缺點是熱效應大，電流升高。

兩性離子：如三甲銨基甲內鹽(CH3)3-N+-CH2-COO-。可增加緩衝液離子強度，抑制矽醇基電離，EOF降低。但不增加電流。

表面活性劑：如烷基季銨鹽

有機溶劑：影響機理複雜（5）柱溫：

T升高，CEbuffer粘度降低，EOF增大。3．柱效和分離度CE的柱效用理論塔板數（thenumberoftheoreticalplates,N）表示，其運算式來源於色譜理論：

N=（μe

+μeo）

(10)

式中μe

為電泳淌度，μeo為電滲淌度，V為操作電壓，l為毛細管有效長度，D為溶質的擴散係數，L為毛細管總長度。

實際理論塔板數可以直接從電泳圖譜中求得：

N=5.54(tm/W1/2)2(11)

式中tm

為遷移時間，W1/2為半峰寬。由式（11）求得的柱效總是小於由式（10）計算的理論值。影響CE柱效的因素:CEbuffer和溶質本身,主要是自熱、擴散和吸附;1)自熱在毛細管內產生徑向溫度梯度,進而產生徑向粘度梯度,使帶電粒子的遷移速度產生徑向不均勻分佈,EOF的平面流型被破壞,導致區帶展寬.2)擴散:主要是溶質的縱向擴散3)吸附:靜電吸附和疏水作用引起的吸附系統本身,如進樣和檢測.CE中兩相鄰組分的分離度可用下列公式表示：

Rs=(12)

式中為兩組分電泳淌度之差，為兩組分平均電泳淌度。可見，分離度不僅取決於兩組分的電泳淌度，