《基于质谱的定量蛋白质组技术规程》征求意见稿

1基于质谱的定量蛋白质组技术规程对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号4缩略语MS：质谱分析法(massspectrometry)TMT：串联质量标记定量蛋白质组(tandemmasstDDA：数据依赖质谱扫描模式采集(datadependentacquisitioDIA：数据非依赖质谱扫描模式采集(dataindependentacquisitioMS2：二级质谱检测(massspectrometry2）2血液等非目标检测污染物a；1.2其他动物来源组织如肝脏、心脏等可采用灌流方式去血b；2.1木本植物的花、叶等，草本科植物，藻类，蕨类植物和大型真菌等的柔软组织，推荐样品2.3富含杂质或蛋白质含量低的植物样品，如树根、树皮、木质部、韧皮部组织等，应采集样36.2所有前处理步骤应尽量保证在冰上或4℃下低温操作，并尽可能缩短操作时间以减小蛋白质降解6.4应使用旋盖密封管或气密性好的容器保存样品，以免液氮速冻或低温保存时因气压变化造成管盖1.4进一步破碎组织块，可选择液氮研磨、匀浆或加入合适直径的研磨珠后使用组织破碎仪将组织破碎a；在低温下超声破碎，或用涡旋振荡器剧烈振荡，使其尽可能均匀溶于裂解液中。骨但也需要尽可能减少不必要蛋白质裂解液10添加。即100的蛋白质裂解2.3加入蛋白质裂解液溶解样品后，需在低温下（如冰浴）超声破碎，或用涡旋振荡器3.1菌体样品因具细胞壁结构，可采用液氮研磨、超声或高压细胞破碎仪等方法将菌体3.2部分细菌（尤以革兰阳性菌为甚）细胞壁非常厚，需要使用较强的破碎条件，如增44新鲜培养 IgD,IgE等），会极大降低质谱对其他中、低丰度蛋白7唾液、羊制剂Cocktail，Tris/HCl（pH强强强强强好是是否否是否否否否否高高高高高BCA试剂盒BCA试剂盒BCA试剂盒BCA试剂盒否否否否否是是否否是否否否否否型5d)此步骤获得的蛋白质样品可直接进行后续实验，也可分装保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步c)此步骤获得的蛋白质样品可直接进行后续实验，也可分装保存至-80℃冰箱/液氮罐中。此步9蛋白质样品质量控制凝胶成像仪扫描获得样品的完整蛋白质组条带。样品结果判定及对应解决方法见表背景干净，可明显分辨蛋白质梯状条带，在不同分子量间分布均匀，同类样品间蛋白质条带整体和局部无明显差异，各泳道/再次实验，重新提取蛋白质，再次质检判定是提取不充分导致条带差异过大还是样蛋白质分布不均匀，出现如：分布在某一范围分子量的蛋白质条带过少，或样品条蛋白质提取效率低，提取不充蛋白质条带中横纹、纵纹较多，或背景较蛋白质样品中盐类等杂质含量使用有机溶剂如丙酮、甲醇沉淀蛋白质后无明显梯状蛋白质条带、条带出现拖尾、采集新鲜样品，注意操作手法，重新进行10.1超滤管辅助的蛋白质酶解（Filter-aidedsamplepr68MUrea，100mMTris/HCl，pH8.0~），7的三(2-羧乙基)膦（Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP）和终浓度为40mM的2-氯乙酰胺），8上步骤1滤出液合并，收集管底部共得到50μL酶解后的样品（如果体积有损失，加入9））05可每周用标准品质控一次经软件搜库后鉴定的蛋白质数量与该机器MA,USA）。b)HCD-MS/MS：分辨率：30000；NormalizedAGCtarget：200%；最大注入时间：80ms；碰撞A：0.1%FA，99.9%H2O；MS参数设置m/z；MS/MS参数设置~0.95sec~0.95secMS/MS扫描速度）：12.1.5蛋白质定性标准：PrecursorThreshold：1.0%FDR，ProteinThre12.2.5蛋白质定性标准：PrecursorThreshold：1.0%FDR，ProteinThre12.3.6根据主要质控参数评分综合评判数据质A.1.质控雷达图片离子的数目，不同颜色代表不同样品。在离子的数目，不同颜色代表不同样品。在色谱图梯度内果。（DeltaRT/iRT推荐阈值为±2min；A.7.FWHMDistribution（半峰宽分布）图A.7显示每个样品中所有母离子的半峰宽分布，其中横坐A.8.Datapointsperpeak（每个峰采集的数据点）采集的点的数目分布。推荐为5个～10个点为好，点数太少会使定量的准确度降低，而点数太多会使得大于350表示色谱柱性能较好。而采用高性能商品柱的1小时梯度峰容量则通常大于4A.10.MS1MassAccurac下校正后MS1水平质量精度应小于5ppm。矫正前的MS1偏差尽量不A.11.MS2MassAccurac后平均质量精度。质量精度计算为实际检测到的m/z-理论m/z）/理论m/z。单位为ppm。通常情况图A.12为各样品的肽段母离子、肽段和蛋白A.13.MissedC