GBT 34224-2017 生物产品中功能性微生物检测

GB/T34224—2017生物产品中功能性微生物检测Methodfordeterminationoffunctionalmicroorganisminbiologicproducts中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局GB/T34224—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。IlGB/T34224—2017生物产品中功能性微生物检测1范围本标准适用于生物产品中植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus母(Saccharomycescerevisiae)的检验。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测RB/T151食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南SN/T0330出口食品微生物学检验通则SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程SN/T2660食品微生物实验室菌种保藏方法3术语和定义3.1注：本标准中的生物产品特指功能性微生物经过工业化生产扩繁后加工制成的活菌制剂及添加了该类制剂的3.23.32GB/T34224—20174.2实验室生物安全要求应符合GB19489的规定。4.3实验室人员应满足GB4789.1的规定。4.4菌株保存应符合SN/T2632和SN/T2660的规定。4.5培养基和试剂的质量要求应符合G4.6实验室质量控制应符合GB/T27405的规定。确定度评估按照RB/T151的要求执行。5.1.2冰箱：2℃~5℃。5.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。3GB/T34224—201710倍系列稀释厌氧培养，37℃±1℃,48h±2h挑选平板上5个边缘透明、整齐的菌落分别厌氧培养，37℃±1℃,24h±2h形态学鉴定生化鉴定报告称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。5.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。5.4.2.2另取1mL无菌一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液4GB/T34224—20170.1mL接种于MRS琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。5.4.4菌落计数5.4.4.1选取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。5.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。5.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5.4.5鉴定5.4.5.1菌落挑选和纯培养挑选平板上5个边缘透明、整齐的菌落分别转入MRS肉汤培养基37℃±1℃厌氧培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。5.4.5.2形态学鉴定革兰氏染色，镜检。植物乳杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈直杆状，长度3.0μm～8.0μm,单个、成对或成链状，通常缺少鞭毛，无芽孢。5.4.5.3生化鉴定使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.1。乳杆菌属常见菌种主要鉴别特征参见附录C中表C.1。5.5结果计算5.5.1每个平板中植物乳杆菌的数量每个平板中植物乳杆菌菌落数的计算见式(1):式中：a——每块平板上的植物乳杆菌菌落数；b——挑取后经证实为植物乳杆菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。…………5.5.2菌落总数的计算方法5.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中植物乳杆菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。5.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(2)计算：5GB/T34224—2017n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约6.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。6GB/T34224—2017嗜酸乳杆菌的检验程序见图2。厌氧培养，37℃±1℃,48h±2h厌氧培养，37℃±1℃,24h±2h形态学鉴定报告1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。6.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。7GB/T34224—2017根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液0.1mL接种于MRS琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。6.4.4菌落计数6.4.4.1选取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。6.4.5.1菌落挑选和纯培养挑选平板上5个凸起、表面粗糙、边缘卷曲的菌落分别转入MRS肉汤培养基37℃±1℃厌氧培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。6.4.5.2形态学鉴定革兰氏染色，镜检。嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈杆状，两端圆，长度0.9μm～6.0μm,单个、成对或成链状，无鞭毛，无芽孢。6.4.5.3生化鉴定使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.2。乳杆菌属常见菌种主要鉴别特征参见附录C中表C.1。6.5结果计算6.5.1每个平板中嗜酸乳杆菌的数量每个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的计算见式(3):式中：a——每块平板上的嗜酸乳杆菌菌落数；b——挑取后经证实为嗜酸乳杆菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。…………6.5.2菌落总数的计算方法6.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中嗜酸乳杆菌菌落数的8GB/T34224—2017平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。6.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(4)计算：N——样品中菌落数；…………∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。6.6.1结果判定若样品菌落符合嗜酸乳杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为嗜酸乳杆菌。6.6.2结果报告6.6.2.1定性报告在25g(mL)样品中检出或未检出嗜酸乳杆菌。菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。7枯草芽孢杆菌7.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。7.1.1恒温培养箱：37℃±1℃。7.1.2冰箱：2℃~5℃。7.1.3恒温水浴箱：80℃±1℃。7.1.4天平：感量为0.1g。7.1.5均质器及无菌均质袋、均质杯。7.1.6振荡器。7.1.7无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。7.1.8无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。7.1.9无菌培养皿：直径90mm。7.1.10显微镜：10倍～100倍。7.1.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。7.2培养基和试剂7.2.1营养琼脂培养基：见A.3。7.2.2营养肉汤培养基：见A.4。9GB/T34224—20177.2.5细菌生化鉴定试剂盒。枯草芽孢杆菌的检验程序见图3。1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。7.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合GB/T34224—2017均匀，制成1:100的样品匀液。7.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。7.4.3培养根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度水浴80℃±1℃维持10min,吸取菌液0.2mL接种于营养琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃培养箱中培养48h±2h。7.4.4.1选取特征菌落数在20CFU～200CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于20CFU的平板记录具体菌落数，大于200CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。7.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。7.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7.4.5鉴定7.4.5.1菌落挑选和纯培养挑选平板上5个表面粗糙、不透明，灰色或微黄色的菌落分别转入营养肉汤培养基37℃±1℃培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。7.4.5.2形态学鉴定革兰氏染色，镜检。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈杆状，长度1.5μm～3.0μm,无荚膜，周生鞭毛，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。7.4.5.3生化鉴定使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.3。7.5.1每个平板中枯草芽孢杆菌的数量每个平板中枯草芽孢杆菌菌落数的计算见式(5):a——每块平板上的枯草芽孢杆菌菌落数；b——挑取后经证实为枯草芽孢杆菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。GB/T34224—20177.5.2菌落总数的计算方法7.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中枯草芽孢杆菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。7.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(6)计算：N——样品中菌落数；…………ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。若样品菌落符合枯草芽孢杆菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为枯草芽孢杆菌。7.6.2结果报告在25g(mL)样品中检出或未检出枯草芽孢杆菌。菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。8地衣芽孢杆菌8.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。8.1.1恒温培养箱：37℃±1℃。8.1.2冰箱：2℃~5℃。8.1.3恒温水浴箱：80℃±1℃。8.1.4天平：感量为0.1g。8.1.5均质器及无菌均质袋、均质杯。8.1.6振荡器。8.1.7无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。8.1.8无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。8.1.9无菌培养皿：直径90mm。8.1.10显微镜：10倍～100倍。8.1.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。GB/T34224—20178.2.5细菌生化鉴定试剂盒。地衣芽孢杆菌的检验程序见图4。报告1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。GB/T34224—20178.4.2样品稀释8.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。8.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度水浴80℃±1℃维持10min,吸取菌液0.2mL接种于营养琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃培养箱中培养48h±2h。8.4.4菌落计数8.4.4.1选取特征菌落数在20CFU～200CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于20CFU的平板记录具体菌落数，大于200CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。8.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。8.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。8.4.5.1菌落挑选和纯培养挑选平板上5个白色不透明、湿润、边缘光滑的菌落分别转入营养肉汤培养基37℃±1℃培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。8.4.5.2形态学鉴定革兰氏染色，镜检。地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，呈杆状，长度1.5pm～3.5μm,单个、成对或短链状排列，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。8.4.5.3生化鉴定用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.4。8.5结果计算8.5.1每个平板中地衣芽孢杆菌的数量每个平板中地衣芽孢杆菌菌落数的计算见式(7):式中：a——每块平板上的地衣芽孢杆菌菌落数；…………GB/T34224—2017b——挑取后经证实为地衣芽孢杆菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。N——样品中菌落数；∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。在25g(mL)样品中检出或未检出地衣芽孢杆菌。菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约9粪肠球菌9.1.2冰箱：2℃~5℃。9.1.9显微镜：10倍～100倍。GB/T34224—20179.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。9.2.3无菌生理盐水：见A.10。9.2.5细菌生化鉴定试剂盒。粪肠球菌的检验程序见图5。1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mLGB/T34224—2017预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。9.4.2样品稀释无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。9.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。9.4.3培养根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液0.1mL接种于KF链球菌琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。9.4.4菌落计数9.4.4.1选取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。9.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。9.4.4.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。9.4.5鉴定9.4.5.1菌落挑选和纯培养挑选平板上5个暗红色至粉红色，表面光滑，周边整齐菌落分别转入肠球菌肉汤培养基37℃±1℃恒温培养箱内增菌培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。9.4.5.2形态学鉴定革兰氏染色，镜检。粪肠球菌为革兰氏阳性球菌，呈球形或椭圆形，直径0.5μm～1.0μm,成对或短链状排列，无芽孢。9.4.5.3生化鉴定使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.5。肠球菌属常见菌种主要鉴别特征参见附录C中表C.2。9.5结果计算9.5.1每个平板中粪肠球菌的数量每个平板中粪肠球菌菌落数的计算见式(9):GB/T34224—2017式中：a——每块平板上的粪肠球菌菌落数；b——挑取后经证实为粪肠球菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。9.5.2菌落总数的计算方法9.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中粪肠球菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。9.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(10)计算：式中：N——样品中菌落数；…………∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。9.6报告9.6.1结果判定若样品菌落符合粪肠球菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为粪肠球菌。9.6.2结果报告9.6.2.1定性报告在25g(mL)样品中检出或未检出粪肠球菌。9.6.2.2定量报告菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。10屎肠球菌10.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。10.1.1恒温培养箱和恒温厌氧培养箱：37℃±1℃。10.1.2冰箱：2℃~5℃。10.1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。10.1.5振荡器。10.1.6无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。10.1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。GB/T34224—201710.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。10.2.1屎肠球菌选择性培养基：见A屎肠球菌的检验程序见图6。形态学鉴定生化鉴定报告1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。GB/T34224—2017应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。10.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。10.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液0.1mL接种于屎肠球菌选择性平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。10.4.4.1选取特征菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。以2,代表一个平板菌落数。挑选平板上5个暗红色至粉红色、表面光滑凸起，周边整齐的菌落分别转入肠球菌肉汤培养基37℃±1℃培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。使用细菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.6。肠球菌属常见菌种主要鉴别特征参见附录C中表C.2。每个平板中屎肠球菌菌落数的计算见式(11):GB/T34224—2017a——每块平板上的屎肠球菌菌落数；…………b——挑取后经证实为屎肠球菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。10.5.2菌落总数的计算方法10.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中屎肠球菌菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。10.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(12)计算：ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。10.6.1结果判定若样品菌落符合屎肠球菌形态学及生化鉴定的特征，可判定为屎肠球菌。10.6.2结果报告在25g(mL)样品中检出或未检出屎肠球菌。菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。11产朊假丝酵母11.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。11.1.1恒温培养箱：28℃±1℃。11.1.2冰箱：2℃~5℃。11.1.3天平：感量为0.1g。11.1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。11.1.5振荡器。GB/T34224—201711.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。28℃±1℃,72h±2h报告1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000质1min～2min制成1:10的样品匀液。GB/T34224—2017应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。11.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。11.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液0.2mL接种于孟加拉红琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于28℃±1℃培养箱中培养72h±2h。11.4.4.1选取特征菌落数在10CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于10CFU的平板记录具体菌落数，大于150CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两以2,代表一个平板菌落数。挑选平板上5个红色、平滑、边缘齐整的菌落分别接种于麦芽汁液体培养基中，28假菌丝或有隔菌丝。使用酵母菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.7。每个平板中产朊假丝酵母菌落数的计算见式(13):GB/T34224—2017式中：…………a——每块平板上的产朊假丝酵母菌落数；b——挑取后经证实为产朊假丝酵母的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。11.5.2菌落总数的计算方法11.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中产朊假丝酵母菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。11.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(14)计算：式中：N——样品中菌落数；…………∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。11.6.1结果判定若样品菌落符合产朊假丝酵母形态学及生化鉴定的特征，可判定为产朊假丝酵母。11.6.2结果报告11.6.2.1定性报告在25g(mL)样品中检出或未检出产朊假丝酵母。11.6.2.2定量报告菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。12酿酒酵母12.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。12.1.1恒温培养箱：28℃±1℃。12.1.2冰箱：2℃~5℃。12.1.3天平：感量为0.1g。12.1.4均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。12.1.5振荡器。GB/T34224—201712.1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。酿酒酵母的检验程序见图8。琼脂平板内28℃±1℃,72h±2h菌落计数形态学鉴定报告称取25g样品，置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液；或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2min制成1:10的样品匀液。GB/T34224—2017应先将其充分摇匀后，以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。12.4.2样品稀释12.4.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。12.4.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。根据对待检样品菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取样品匀液0.2mL接种于孟加拉红琼脂平板内，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后，将平板静置10min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于28℃±1℃培养箱中培养72h±2h。12.4.4.1选取特征菌落数在10CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于10CFU的平板记录具体菌落数，大于150CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。12.4.4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。12.4.5.1菌落挑选和纯培养挑选平板上5个菌落大、红色、平滑、边缘齐整的菌落分别接种于麦芽汁液体培养基中，28℃±1℃恒温培养箱内增菌培养24h～48h后进行形态学、生化鉴定。12.4.5.2形态学鉴定镜检。酿酒酵母呈卵圆形或圆形，直径5.0μm～10.0μm,单个、成双或成簇排列，多边芽殖。12.4.5.3生化鉴定使用酵母菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。鉴定特征见附录B中表B.8。12.5结果计算12.5.1每个平板中酿酒酵母的数量每个平板中酿酒酵母菌落数的计算见式(15):GB/T34224—2017式中：a——每块平板上的酿酒酵母菌落数；b——挑取后经证实为酿酒酵母的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数；C——平板上的所有特征菌落数。12.5.2菌落总数的计算方法12.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中酿酒酵母菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)中菌落总数结果。12.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(16)计算：N——样品中菌落数；…………∑C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d——稀释因子(第一稀释度)。12.6.1结果判定若样品菌落符合酿酒酵母形态学及生化鉴定的特征，可判定为酿酒酵母。12.6.2结果报告12.6.2.1定性报告在25g(mL)样品中检出或未检出酿酒酵母。菌落数小于100CFU时，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。GB/T34224—2017(规范性附录)培养基和试剂A.1MRS琼脂培养基蛋白胨牛肉膏酵母浸膏葡萄糖吐温-80柠檬酸铵乙酸钠硫酸镁硫酸锰磷酸氢二钾蒸馏水20.02.05.00.10.052.015.0gggggggA.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.3±0.2,分装于适宜容器中，121℃灭菌15min。A.2MRS肉汤培养基A.2.1成分蛋白胨牛肉膏酵母浸膏葡萄糖吐温-80柠檬酸铵乙酸钠硫酸镁硫酸锰磷酸氢二钾蒸馏水20.0g2.0g0.05g2.0gA.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.3±0.2,分GB/T34224—2017装于适宜容器中，121℃灭菌15min。A.3营养琼脂培养基A.3.1成分蛋白胨牛肉膏氯化钠蒸馏水5.0gggmLA.3.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.2±0.2,分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。A.4营养肉汤培养基A.4.1成分蛋白胨牛肉膏氯化钠蒸馏水A.4.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.2±0.2,分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。A.5KF链球菌琼脂培养基A.5.1成分月示蛋白胨麦芽糖酵母浸膏甘油磷酸钠氯化钠溴甲酚紫叠氮化钠2,3,5-氯化三苯四氮唑蒸馏水20.010.010.05.01.013.00.40.1gggggmLGB/T34224—2017A.5.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.2±0.2,分装于适宜容器中，煮沸5min,冷至50℃左右，倾入无菌平皿，备用。A.6屎肠球菌选择性培养基A.6.1成分胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖磷酸氢二钠磷酸氢二钾溴甲酚紫叠氮化钠2,3,5-氯化三苯四氮唑蒸馏水20.0g2.0g4.0g4.0g20.0gA.6.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.4±0.2,分装于适宜容器中，煮沸5min,冷至50℃左右，倾入无菌平皿，备用。A.7肠球菌肉汤培养基A.7.1成分牛肉浸膏酵母浸膏牛胆粉氯化钠柠檬酸钠七叶苷柠檬酸铁铵叠氮化钠蒸馏水3.05.010.05.01.00.25gggggmLA.7.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至7.1±0.2,分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。GB/T34224—2017A.8孟加拉红琼脂培养基A.8.1成分蛋白胨5.0g葡萄糖10.0g磷酸二氢钾1.0g硫酸镁0.5g琼脂孟加拉红0.033g氯霉素0.1g蒸馏水1000mLA.8.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min,避光保存备用。A.9麦芽汁液体培养基A.9.1成分麦芽浸粉氯霉素蒸馏水A.9.2制法gmL将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL,于25℃时调节pH至5.6±0.2,分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。A.10无菌生理盐水A.10.1成分氯化钠蒸馏水A.10.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000A.11革兰氏染色A.11.1结晶紫染色液A.11.1.1成分结晶紫mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。GB/T34224—20171%草酸铵水溶液80mLA.11.1.2制法A.11.2革兰氏碘液A.11.2.1成分碘化钾2g蒸馏水300mLA.11.2.2制法A.11.3.1成分蒸馏水90mLA.11.3.2制法A.11.4染色法GB/T34224—2017(规范性附录)功能性微生物生化鉴定特征B.1植物乳杆菌生化鉴定特征表B.1植物乳杆菌生化鉴定特征植物乳杆菌植物乳杆菌甘油—纤维二糖十赤藓醇一麦芽糖十D-阿拉伯糖一乳糖十L-阿拉伯糖一蜜二糖十核糖十蔗糖十D-木糖一海藻糖十L-木糖一菊糖—葡萄糖十棉籽糖十半乳糖十淀粉—果糖十糖原一甘露糖十木