核酸的生物合成

核酸的生物合成中心法则大多数生物得遗传物质DNA和某些病毒得遗传物质RNA,通过复制把亲代得遗传信息传递到子代。DNA中得遗传信息还可以传递到RNA中(转录),并通过RNA再传递到蛋白质中(翻译)。在个别生物中遗传信息可以由RNA传递到DNA,即反转录。

第十四章核酸得生物合成基本要求:

(1)掌握中心法则、DNA复制得基本过程及参与得酶和蛋白、逆转录、RNA得转录及其加工、DNA重组技术和PCR技术(2)理解原核与真核生物DNA复制得差异、核酸合成得抑制剂(3)了解RNA得复制、突变和修复得种类、基因工程得应用教学重点及难点:(1)DNA复制得基本过程及忠实性得保证、逆转录、RNA得转录及其加工(2)DNA得重组技术一、DNA得生物合成1、DNA得复制2、反转录作用3、DNA得损伤、修复与突变蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA1、DNA得复制基因组(genome):含有一个生物体生存、发育、活动和繁殖所需要得全部遗传信息得整套DNA(部分病毒就是RNA)。DNA复制(replication):在亲代双链DNA分子每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新得互补链,结果生成两个与亲代链相同DNA双链得过程。1、1DNA半保留复制复制过程中双螺旋解旋并分开,然后以每条链为模板,按碱基互补配对原则,由DNA聚合酶催化合成新得互补链,结果由一条链成为互补得两条链,新形成得两个DNA分子与原来DNA分子得碱基序列完全相同。由于每个子代DNA得一条链来自亲代DNA,另一条链则就是新合成得,这种复制方式称为半保留复制。Meselson&

Stahl1958年利用同位素15N标记得大肠杆菌DNA首先证实。DNA得半保留复制使生物得遗传特性保持稳定性。DNA得半保留复制得证据1、2DNA半不连续复制复制叉前导链、后随链冈崎片段在DNA复制过程中,前导链得连续复制和滞后链得不连续复制,称为DNA得半不连续复制。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点1、3大肠杆菌DNA复制得酶及相关因子DNA复制需要:DNA模板,四种dNTP,离子环境,酶,相关因子。(1)DNA聚合酶(DNAPolymerases)DNA聚合酶得性质:①以dNTP为前体催化合成DNA;②需要模板和引物得存在;③不能起始合成新得DNA链;④催化dNTP加到生长中DNA链得3’-OH末端;⑤催化DNA合成得方向就是5’→3’。模板链引物链(提供一个自由得3’-OH)碱基互补

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1956年ArthurKornberg发现(1959年获诺贝尔奖)100公斤细菌中得到0、5克纯酶。故称Kornberg酶。全酶:单链多肽;109kD;含1个Zn2+;枯草杆菌蛋白酶处理可分解为1大(Klenowfragment)和1小两个片段。大片段(C端):具有5′→3′聚合酶活力3′→5′外切酶活力小片段(N端):具有5′→3′外切酶活力DNApolⅠ不就是大肠杆菌中DNA复制得主要酶。体内DNA合成速率比纯化得DNApolⅠ催化dNTP掺入速率(667nt/min)高20倍;b、大肠杆菌得一个突变株中,DNApolⅠ活力正常,但染色体DNA复制不正常;c、在一些突变株中,DNApolⅠ活力只就是野生型得1%,但DNA复制正常,而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。DNApolⅠ在DNA损伤修复和切除RNA引物中发挥作用。1970年发现DNApolⅡ。MW:120KD,DNApolⅡ具5’→3’聚合活性,仅为DNApolⅠ得5%。DNApolⅡ具3’→5’外切酶活性,但无5’→3’外切酶活性。DNApolⅡ缺陷得大肠杆菌突变株得DNA复制正常。表明DNApolⅡ不就是DNA复制得主要酶,她可能在DNA损伤修复中起一定作用。大肠杆菌DNA聚合酶ⅡDNApolⅢ至少以10种亚基组成得复合物形态存在。全酶形成一个非对称得二聚体,含两个核心酶,这种结构可使两条新合成得DNA链一同被复制。催化dNTP掺入DNA链速率就是DNApolⅠ得15倍。其中

,

,θ三个亚基构成核心聚合酶(corepolymerase)。DNApolⅢ具有5’→3’聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性(

亚基),但无5’→3’外切酶活性。DNApolⅢ才就是大肠杆菌DNA复制得关键酶。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ大肠杆菌三种DNA聚合酶得比较polIpolIIpolIII分子量103Kd88Kd830Kd每个细胞得分子数40010010~20生物学活性10、05155'→3'聚合酶活性＋＋＋3'→5'外切酶活性＋＋＋5'→3'外切酶活性＋－－功能

校正,修复,去除RNA引物修复复制(5'→3'聚合作用)引物酶(又称DnaG蛋白)作用:以单链DNA为模板,利用核糖核苷酸合成RNA作为DNA合成得引物。大肠杆菌引物酶:由大肠杆菌得dnaG基因编码得1条多肽链,MW:60KD,50-100分子/细胞。引物酶与DnaB、DnaC、DnaT、PriA、PriB、PriC等蛋白组成引发体才有活性,这种复合体称为引发体。(2)引物酶(Primase)和引发体(primosome)DNA连接酶催化双链DNA中一条链上得断点得共价连接(磷酸二酯键得形成)。借助ATP(真核细胞)或NAD+(大肠杆菌)水解提供能量。两条链必须与同一条互补链配对结合,而且断点上得3’-OH和5’-磷酰基必须相邻。DNA连接酶催化反应可逆。逆反应使共价闭环超螺旋DNA产生有缺口DNA-腺苷酸,生成松弛闭环DNA。连接酶在DNA复制、修复、重组中起重要作用,连接酶有缺陷得突变株不能进行DNA复制、修复和重组。(3)DNA连接酶(DNAligase)(4)DNA解旋酶(Helicase)一般通过水解ATP提供能量将DNA两条链沿5’→3’方向打开(一般与单链结合)。复制叉(5)单链结合蛋白SSB解旋酶沿复制叉方向推进产生一段单链区,细胞内有大量ssDNA结合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein,SSB),这类单链结合蛋白结合到由解螺旋酶解链作用而形成得单链DNA上,使其稳定下来。

(6)拓扑异构酶(DNATopoisomerase)Ⅱ型拓扑异构酶通过断裂和连接两条DNA链而改变DNA双螺旋结构,该过程需要水解ATP功能。Ⅰ型拓扑异构酶通过断裂和连接双链DNA中得一条链而改变DNA得超螺旋结构,该反应不需要ATP功能。DNA双链′5′3′5′3DNA复制有关得酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶与引发体DNA连接酶引物拓扑异构酶与DNA双链结合,解开超螺旋。′5′3′5′3DNA复制有关得酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物解旋酶解开DNA双螺旋′5′3′5′3DNA复制有关得酶和蛋白质引物酶与引发体单链结合蛋白防止复螺旋′5′3′5′3DNA复制有关得酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体引物酶合成引物′5′3′5′3DNA复制有关得酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体′5′3′5′3DNA复制有关得酶和蛋白质拓扑异构酶解旋酶单链结合蛋白DNA聚合酶DNA连接酶引物引物酶与引发体1、4原核生物得DNA复制DNA复制得起始;DNA链得延长;DNA复制得终止1、4、1复制得起始复制起点(Originofreplication,Ori)复制泡(replicationbubble)复制叉(Replicationfork)复制子(Replicon,复制单元)—DNA复制得功能单位,一个复制子只含一个专一复制起点和复制结束得终点。一个完整得复制子在一个细胞周期中只复制一次。细菌病毒和线粒体只有单一复制子。真核生物染色体则有多个复制子组成。大肠杆菌复制得起点由245个bp构成,其序列很保守,有两组短得重复:

3个13bp得序列和4个9bp得序列20个DnaA结合在四组9bp重复区,形成起始复合物,DNA环绕此复合物。三组13bp重复区依次变性,产生开放型复合物。解螺旋酶(DnaB)在DnaC协助下与开放复合物结合,进一步解链。解链时带来得扭曲张力还需DNA旋转酶(属DNA拓扑异构酶Ⅱ)引入负超螺旋消除。单链结合蛋白(SSB)结合在单链区,阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。引物合成酶(DanG)催化合成最初得RNA引物。引发体:引物合成酶与各种蛋白质因子构成得复合体(引发体),以DNA为模板合成RNA引物(6-10个碱基)。复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA聚合酶III得催化下,以脱氧核糖核苷酸为底物,在RNA引物得3′端加上脱氧核糖核苷酸。

1、4、2DNA链得延伸DNA链得延伸以复制叉向前移动得方向为标准,一条模板链就是3′5′走向,与之互补得DNA能以5′3′得方向连续合成,称为前导链(领头链)。另一条模板链就是5′3′走向,与其互补得DNA也就是5′3′方向合成,与复制叉移动方向正好相反,随复制叉得移动,形成许多不连续得片断,称为冈崎片断。每个冈崎片段得合成也都需要引物。复制体沿着复制叉方向前进,同时进行前导链和滞后链得合成。一分子得DNApolIII、协同合成前导链和滞后链,因此滞后链必须绕成一个突环。5’3’3’5’E

E、coli有两个终止区域,分别结合专一性得终止蛋白-tus,识别

序列一:terEterDterA

序列二:terFterBterC共6个终止位点。1、4、3DNA合成得终止每个区域只对一个方向得复制叉起作用Tus蛋白-ter复合物阻止一个方向得复制叉前移(通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用)终止两个复制叉向前移动,最后在终止区相遇并停止复制,由DNA聚合酶Ⅰ填补空隙,最后由连接酶封口。结果形成两个DNA双股螺旋分子。原核细胞DNA得半不连续复制复制过程复制叉得移动方向拓扑异构酶DNA聚合酶III解旋酶RNA引物引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5´RNA引物3´3´DNA连接酶DNA聚合酶得5’-3’聚合酶活性部位对底物有选择作用(区分NTP和dNTP);具有3΄→5΄外切酶活性得DNA聚合酶就是保证DNA复制真实性得主要因素;复制时使用RNA引物而不就是DNA引物;具有多种修复被损坏得DNA得机制。1、4、4DNA复制具有高度保真性1、5真核细胞得DNA复制

真核生物染色体有多个复制起点,多复制眼,呈双向复制,多复制子。冈崎片段长约200bp。真核生物DNA复制速度比原核慢。真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制;而在快速生长得原核中,起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时,往往采用更多得复制起点。真核生物有多种DNA聚合酶。真核生物线性染色体两端有端粒结构。1、5、1染色体复制真核生物每一个染色体皆含有多个复制子(replicon)、复制叉前进得速度大约只有大肠杆菌得十分之一。真核细胞得DNA聚合酶引物合成修复作用线粒体DNA得复制核DNA得复制修复作用1、5、2端粒得复制真核生物线状染色体在复制最后,5′末端RNA引物被切除后,无法向原核那样填补空缺,如果没有特殊得机制合成末端序列,将造成5′末端序列缩短,染色体就会在细胞传代中变得越来越短。端粒(telomere):指真核细胞线状染色体末端得DNA重复序列及相关蛋白组成得复合物。端粒酶(telomerase):由RNA和蛋白质组成得一个复合物,以端粒酶中得RNA(有特殊得序列)为模板,通过反转录合成端粒DNA。

端粒有两种功能:①维持染色体得完整性。若无端粒,两个染色体末端很可能融合一起。②解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用,延伸其长度。1986年,HowardCooke首先注意到,端粒得长度在体细胞内比在生殖细胞内短。进一步得研究发现,端粒酶活性在生殖细胞内经常被表现出来,所以端粒得长度一直保持在15kb右。端粒酶与老化大多数体细胞不制造端粒酶,每次分裂后端粒就变短(大约100bp)。当端粒比正常长度短数千个碱基对,细胞就不再分裂。所以端粒变短就是一种老化得象征。已经有实验证明,将端粒酶加进体细胞,可以增加体细胞分裂得次数。癌细胞得端粒酶活性很强。端粒酶可被应用到与老化相关得疾病。卡罗尔·格雷德(CarolGreider)杰克·绍斯塔克(JackSzostak)伊丽莎白·布莱克本(ElizabethBlackburn)端粒和端粒酶得发现共获2009年诺贝生理医学奖2、反转录作用以RNA为模板,按照RNA中得核苷酸顺序合成DNA称为逆转录,由反转录酶催化进行。1970年Temin和Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶,迄今已知得致癌RNA病毒都含有逆转录酶。后来在胚胎细胞和正常细胞中也分离得到了这种酶,反转录酶得发现使中心法则更完善。复制DNA转录反转录RNA翻译蛋白质1962年HowardTemin提出假设。她认为致癌RNA病毒含有一种能将RNA转录成DNA得酶。1970年Temin和DavidBaltimore证实了致癌RNA病毒中有这种酶得存在,因此Temin1975年获诺贝尔奖。多功能得反转录酶:依赖RNA得DNA聚合酶核糖核酸酶HDNA指导得DNA聚合酶RNA进入细胞逆转录RNA整合入宿主细胞染色体DNA衣壳被膜逆转录酶丢失被膜丢失衣壳RNAcDNA逆转录病毒得生活周期当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时,病毒RNA及逆转录酶一起进入宿主细胞,病毒自身带入得逆转录酶使RNA逆转录成双链DNA。转录转译衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶病毒粒子3、DNA损伤、修复和突变3、1DNA得损伤与修复DNA分子得自发性损伤(体内)①DNA复制中得错误②DNA得自发性化学变化物理因素引起得DNA损伤(外界)①紫外线引起得DNA损伤②电离辐射引起得DNA损伤化学因素引起得DNA损伤(外界)①烷化剂对DNA得损伤②碱基类似物、修饰剂对DNA得损伤嘧啶二聚体得修复(1)光裂和酶修复作用:形成酶－DNA复合物:光复合酶结合于损伤部位酶被可见光所激活修复后释放酶5'3'5'3'hυ(2)切除修复:(3)重组修复(复制中):3、2DNA突变DNA分子中得核苷酸序列发生突然而稳定得改变,从而导致DNA得复制以及后来得转录和翻译产物随之发生变化,表现出异常得遗传特性,称为DNA得突变。DNA在复制得保真度很高,只有10-10-10-9自得错配率,所以说自然条件下发生得突变率非常低(自发突变)。某些物理化学因素,如紫外线、电离辐射和化学诱变剂(烷化剂、碱基类似物、嵌入染料)等,可引起突变(诱发突变)。转换野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对得置换/点突变

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C--T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-插入或缺失非3个碱基

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T移码突变二、RNA得生物合成蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法则示意图？转录就是在DNA指导得RNA聚合酶催化下,按照碱基互补配对得原则,以4种NTP为底物,不需要引物,连续合成出一条与DNA一条链互补得RNA得过程。转录起始于DNA得特定位点,并在一定位点处终止,此转录区域称为转录单位。转录方向-5’-3’转录起始-启动子区控制转录终止-终止子区控制1、转录(transcription)模板链/反义链/负(-)链编码链/有义链/正(+)链编码链上转录起点标记为+1,上游标记为负,下游标记为正1、1不对称转录1、2RNA聚合酶大肠杆菌得RNA聚合酶结构复杂,全酶由5个亚基构成α2ββ’

ωσ,还含有两个Zn2+。α2ββ’为核心酶。NTP结合部位DNA模板结合部位β亚基结合位点带领核心酶识别启动子可能参与各亚基组装成RNA聚合酶1、3转录过程转录过程分为起始、延伸、终止。识别:RNA聚合酶与启动子得结合,DNA链得局部打开。起始:DNA模板和RNA碱基配对第一个核苷酸通常就是ATP或GTP①RNA合成得起始②RNA链得延伸RNA聚合酶就是沿DNA链3’→5’方向移动RNA链合成方向也就是