动物细胞融合技术与单克隆抗体课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节动物细胞培养第2章细胞工程动物细胞融合技术与单克隆抗体情境导入问题：为什么要号召新冠感染痊愈者捐献自己的血浆？这样的血浆对新冠重症感染患者有什么作用呢？

血浆中有新冠病毒的抗体,可以用于治疗新冠感染患者。

但一个捐献者的200-300毫升的血浆，如果合格，一般也只能治疗2-3个患者。思考：抗体为什么不人工制备呢？传统抗体如何制备？

抗体是在抗原物质的刺激下，由浆细胞（B淋巴细胞）产生的，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。1.传统抗体制备方法及缺陷缺陷：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原

刺激浆细胞抗体多种B淋巴细胞增殖分化抗原不纯抗体不纯如何解决这个问题呢？病原体表面多个抗原决定簇，被免疫系统视为不同独立的激活信号，形成不同B淋巴细胞每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。思考：有什么方法解决传统抗体制备存在产量低、纯度低、特异性差的问题？1个B淋巴细胞B淋巴细胞群大量单一抗体克隆产生在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的！米尔斯坦【英国】科勒【德国】解决1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞(单克隆抗体)骨髓瘤细胞能无限增殖既能无限增殖，又能产生足够数量的特定抗体杂交瘤细胞【细胞克隆】是一种无性繁殖技术，通过将单个细胞从群体内分离出来单独培养，使其重新繁衍成一个新的细胞群。单克隆抗体：由单一杂交瘤细胞增殖产生的特异性抗体。如何将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞呢？思考与讨论单克隆抗体分析概念中“单”和“克隆”的含义。总结单克隆抗体的概念？注：B淋巴细胞指的是活化的B淋巴细胞（指从成熟的B细胞向浆细胞分化的时期），其融合的效率最高，若直接用浆细胞，融合效率很低。自主阅读教材P48，思考下列问题1.动物细胞融合技术的概念、原理、结果分别是什么？2.动物细胞融合技术常用的诱导方法有哪些？4.动物细胞融合技术有何意义？在现实生活中的应用有哪些？3.什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理？融合实质及完成的标志？

（教材P48的相关信息）一、动物细胞融合技术1.概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.结果：融合后形成的杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息。3.原理：细胞膜具有一定的流动性4.诱导融合的常用方法：与植物原生质体融合的基本原理相同5.动物细胞融合的过程：细胞膜融合细胞核融合细胞质融合细胞融合的实质6.动物细胞融合完成的标志：两个或多个细胞核融合为一个细胞核物理法：离心法、电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)融合法生物法：灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有的诱导方法）注意：诱导融合之前，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散。（不能，动物细胞的全能性受限）思考：通过动物细胞融合技术能否形成完整个体？灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面病毒颗粒细胞膜融合细胞核融合形成杂交细胞在病毒的作用下，使细胞互相凝聚灭活病毒诱导法灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合病毒的不同“身份”：在免疫调节中病毒属于抗原；在基因工程中可作为载体；在细胞工程中可作为诱导剂。不灭活可以吗？不灭活的病毒的不可以用作细胞融合诱导剂，会感染动物细胞。7.意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能

8.应用：（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？【答案】病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较课堂归纳动物细胞融合技术01(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有

聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒()(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，

但并不破坏它们的抗原结构()×聚乙二醇(PEG)融合法并不是动物细胞融合所特有的。√合作探究二：请同学们自主阅读教材P48-49，小组合作思考讨论完成问题。

3.会有几种细胞融合方式？杂交瘤细胞具有什么特点？1.单克隆抗体制备过程中为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？4.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？2.产生特定抗体的杂交瘤细胞的获得需要几次筛选？各自筛选的方法和目的是什么？【旧知识回顾】抗体1.定义：机体产生的专门应对

的

；2.特点：

性，一种抗体只能与一种抗原结合；3.分布：①

（主要）；

②

；抗原特异蛋白质血清组织液及外分泌液(如乳汁)【传统抗体的获得】①方法：向动物体内反复注射某种

，使动物产生

，

然后从动物血清中分离所需

。②缺陷：

、

、

。抗原抗体抗体体液免疫产量低纯度低特异性差2.单克隆抗体制备的过程B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合能产生抗体，但不能大量增殖不能产生抗体，但能大量增殖PEG融合法电融合法灭活病毒诱导法注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞从脾中提取目的：获得产生特定抗体的B淋巴细胞多种培养基中共出现几种细胞？其中融合的细胞有几种？(只考虑两两融合)①产生其他抗体的B淋巴细胞

②产生针对注射抗原的抗体的B淋巴细胞2.单克隆抗体制备的过程多种杂交细胞：未融合的细胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次筛选：用特定的选择培养基（HAT培养基）在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长杂交瘤细胞：（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）第二次筛选：克隆化培养、抗体检测（可进行多次）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞克隆化培养多孔细胞培养板（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选的所有杂交瘤细胞都能产生所需的抗体？？抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内体外培养单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取（（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）（分泌的抗体能与特定抗原结合）2.单克隆抗体制备的过程优点：不需培养基，易于控制培养条件，操作简单，成本较低。缺点：规模小，产量少优点：可大规模培养，产量大。缺点：需要认为控制培养条件，成本高特异性强灵敏度高可大量制备特点如何扩大培养得到大量的单克隆抗体？杂交瘤细胞的选择原理HAT培养基筛选杂交瘤细胞所使用的特定培养基H次黄嘌呤（hypoxanthine）氨基蝶呤(aminopterin)胸腺嘧啶核苷（thymidine）背景材料AT①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。②B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。B，B-B：不能无限增殖，死亡瘤，瘤-瘤：不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞：（B-瘤）能无限增殖，生长D途径、S途径D途径D途径、S途径高度分化的细胞一般不具备分裂能力筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基嘌呤杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞筛选出杂交瘤细胞之后的第二次筛选目的是什么？方法是什么？其原理是什么？目的是筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。方法是抗体检测（抗原-抗体杂交）。其原理是抗原-抗体的特异性结合。由于初次筛选出的杂交瘤细胞有多种，且融合细胞中染色体可能会随机丢失，导致部分杂交瘤细胞在培养时会失去增殖或分泌抗体的能力，因此后续需要经过多次筛选出能产生专一抗体的杂交瘤细胞。【拓展】

杂交瘤细胞的抗体检测和克隆化培养将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。多孔细胞培养板然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第一次筛选第二次筛选原因方法结果诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用特定的选择培养基进行筛选对经选择性培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞筛选获得杂交瘤细胞获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞两次筛选的比较课堂归纳单克隆抗体第二次筛选杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养第一次筛选骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术小结：既能大量繁殖又能产生抗体优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备注射抗原单克隆抗体制备的过程中，应用到的技术手段单克隆抗体制备过程的原理细胞膜的流动性和细胞增殖二、单克隆抗体的制备过程3.单克隆抗体制备过程中的相关考点总结（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的_________________________________________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理_________________________________________________________________________________筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长3.单克隆抗体制备过程中的相关考点总结（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选___________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________

_____________（8）抗体检测原理_______________________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）既能迅速大量增殖，又能产生抗体（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞___________________________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点______________________________________________________________________________在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳【小结①】被广泛用作

，在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要作用；病毒蛋白的检测依赖抗体【资料1】利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。【资料2】用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。诊断试剂【资料3】使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。【小结②】可以

。运载药物1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？

抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；

药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞单克隆抗体的应用2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗单克隆抗体的应用3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。【资料4】单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如:利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；

曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。【小结③】自身也可用于

；治疗疾病

单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。一、单克隆抗体的优点：①能准确地识别抗原的细微差异。②与特定抗原发生特异性结合。③可以大量制备。二、单克隆抗体的应用：1.广泛用作诊断试剂2.运载药物：3.直接用于治疗疾病。特异性强灵敏度高可大量制备1.用作诊断试剂——最广泛的应用（1）原理___________________________________________________（2）具体应用及部分实例①多种疾病的诊断实例：利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。②病原体的鉴定实例：乙肝病毒表面抗原定量检测试剂盒③其他类型诊断实例：早早孕诊断试剂盒单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合优点：准确、高效、简易、快速抗原-抗体杂交法2.运载药物和治疗疾病(主要用于癌症治疗)（1）具体应用实例与药物结合，制成______________________，杀伤癌细胞；ADC通常由_____、_____和_____三部分组成；（2）原理通过将药物与__________________________的单克隆抗体结合，实现对肿瘤细胞的_______________；发挥杀伤作用的为______________________________________；单克隆抗体作用为_______________；（3）优点________________________________________________________抗体-药物偶联物（ADC）抗体接头药物能特异性识别肿瘤细胞抗原选择性杀伤放射性同位素、化学药物或细胞毒素靶向运输作用靶点清楚、毒副作用小（不会对健康细胞造成伤害）、疗效高单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病；实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。课堂小结(1)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞()(2)单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同()(3)ADC的抗体具有靶向运输作用、药物具有治疗作用()×只考虑两两融合有3种，即BB、BG、GG，故还需要进行筛选。√×不同。第一次筛选是为了筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选是为了获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。课后训练1.判断下列叙述的正误：(3)步骤②的细胞必须经过步骤③克隆化培养和__________才能筛选得到符合要求的杂交瘤细胞，杂交瘤细胞的特点是__________________________________。杂交瘤细胞可采用注射到小