高三一轮复习生物：基因工程PCR专题课件

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PCR专题汇报人：WPS重难点PCR技术的基本原理PCR技术的结果分析及计算PCR技术中引物的选择PCR的基本过程PCR技术的基本原理重难点一一、PCR技术的基本原理1.在体外(PCR扩增仪)提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。①全称：聚合酶链式反应②原理：DNA半保留复制的原理③前提：一段已知目的基因的核苷酸序列。④条件：模板DNA

一对引物（两种）

热稳定DNA聚合酶（Taq酶)4种游离的脱氧核苷酸[dNTP](包括：dATP、dTTP、

dCTP、dGTP；作用：提供原料和能量)⑤前提：已知目的基因的一段核苷酸序列，以便根据这段序列合

成引物。PCR扩增仪一、PCR技术的基本原理2.PCR技术所需要的条件及作用条件作用缓冲液PCR反应缓冲液中一般要添加

Mg2+以激活DNA聚合酶DNA母链提供复制模板（目的基因做母链）两种引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸游离的4种脱氧核苷酸提供复制的原料耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链(形成磷酸二酯键)PCR的基本过程重难点二二、PCR的基本过程当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。变

性复

性延

伸变

性90℃二、PCR的基本过程当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。变

性复性延

伸50℃二、PCR的基本过程变

性复

性延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。72℃二、PCR的基本过程PCR技术中引物的选择重难点三三、PCR技术中引物的选择思考并回答下列有关引物的问题。(1)引物的本质是什么？引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段。(2)用于PCR的引物的长度通常为多少个核苷酸？用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。三、PCR技术中引物的选择思考并回答下列有关引物的问题。(3)细胞内DNA复制时是否需要引物？为什么？需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链，只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3′端，所以在延伸子链前，需要提前合成一小段RNA或DNA作为引物。(4)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。思考并回答下列有关引物的问题。(5)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。(6)设计引物需要注意的问题是什么？三、PCR技术中引物的选择引物自身不能有互补的序列两种引物之间不能有互补的序列引物不能太短，避免特异性不强。引物短可与模板链多处进行碱基互补配对5’-ACGATTAC······TCCGGATAA-3’（α链）3’-TGCTAATG······AGGCCTATT-5’（β链）三、PCR技术中引物的选择←引物扩增的方向引物扩增的方向→3’-ATT-5’（引物2）（引物1）5’-ACG-3’引物与待扩增序列（目的基因）的对应关系如下：引物1与待扩增基因中部分序列(α链)相同。在此情况下，引物1结合

的是β链，向着和α链相同的方向扩增，即“同向相同，同向扩增”。0引物2与待扩增基因中部分序列(α链)反向互补。这种情况下，引物2与α链结合，并向着和α链相反的方

向扩增，即“反向互补，反向扩增”三、PCR技术中引物的选择解题突破点1引物应位于目的基因两侧，且能顺利扩增出目的基因2引物只能与母链的3'端结合。引物只能引导子链从5'端向3'端延伸

3为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的识别序列，且常在两种引物上设计不同的酶切位点，保证目的基因与载体的正向连接三、PCR技术中引物的选择试一试：

反向PCR技术扩增1.[2025江西宜春模拟](多选)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是（

）三、PCR技术中引物的选择A.切割M和N时选用的限制酶可以相同，也可以不同B.环化之后产生的DNA分子没有游离的磷酸基团C扩增时，应选择图中引物1和引物4，且二者间不能互补配对D.PCR仪设置温度时，一个循环一次是高温变性、中温复性、低温延伸答案：ABC解析：由酶切片段推出环状DNA的5’端和引物的5’端与3’端5’5’3’5’3’5’5’3’5’3’突破点1、2：PCR过程中需要两种引物，引物引导子链从5’端向3’端延伸，为保证扩增的是已知序列两侧的未知序列，故应该选择引物1与引物4，且二者间不能互补配对。C正确。切割M和N时选用的限制酶要保证产生相同的黏性末端，可以选相同的限制酶，也可以选不同的限制酶，A正确。环状DNA分子没有游离的磷酸基团，B正确。PCR技术的操作步骤依次是高温使DNA变性、低温复性(使DNA单链与引物结合)、中温延伸，D错误。三、PCR技术中引物的选择新角度：设计引物时应满足什么条件科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延

伸PCR技术构建融合基因，从而培育出既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建

过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶切割位点如图2所示。回答下列问题：三、PCR技术中引物的选择(1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过

次扩增循环。PCR1与PCR2的产

物能够形成杂交链的条件是

。PCR3过程不需要引物，其原因是

三、PCR技术中引物的选择(2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物

对融合基因进行PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插人Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是.三、PCR技术中引物的选择(3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2+先处理农杆菌，目的是

.利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次

筛选分别是.2.

(1)突破点2：图1中，目的基因经过一次循环可得到含有引物P2或引物P3的单链，但引物P2端和引物P3端都为相应链的5'端，不可直接延伸子链。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到如图1所示的引物P2端和引物P3端都为相

应链的3'端的杂交链。为实现PCR1的产物能与PCR2的产物融合，设计引物时应该考虑引物

P2的5'端与引物P3的5'端的一小段DNA序列互补配对。据图1可知，两条杂交链3'端的碱基序列可以作为子链合成的引物，因此PCR3过程中不需要引物。(2)据图1分析，扩增获得的融合基因，需要引物P1和P4。突破点3：构建基因表达载体时，融合基因应插入Ti质粒的启动子和终止子之间，因此需用限制酶NheI、XmaI切割质粒。要保证融合基因能够正向插入Ti质粒中，融合基因在扩增后能够被限制酶NheI、XmaI切割，且插入的融合基因的转录方向应与质粒上启动子的方向一致，因此需在引物P1的5'端加上限制酶Nhe

I的识别序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaI的识别序列。

(3)用Ca2+先处理农杆菌，其目的是使农杆菌能够吸收周围环境中的DNA分子。两次筛选情况分析如表：

第一次是筛选出含重

组质粒的农杆菌构建基因表达载体时，重组质粒中卡那霉素抗性基因被破坏，潮霉素

抗性基因完整，因此需筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在

含卡那霉素培养基上生长的农杆菌

第二次是筛选出导入

目的基因的大豆细胞用该农杆菌去感染大豆细胞，由于融合基因中含有草甘膦抗性基因，

因此在添加草甘膦的培养基中能够生长的大豆细胞为导入融合基因

的细胞参考答案：(1)2引物P2和引物P3的5'端存在部分碱基互补配对的序列

两条杂交链3'端

的碱基序列可以作为子链合成的引物(2)P1和P4在引物P1的5'端加上限制酶Nhe

I的识别序列，在引物P4的5'端加上限制酶XmaI的识别序列(3)使其能够吸收周围环境中的

DNA先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再

用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞(合理即可)PCR技术的结果分析及计算重难点四四、PCR技术的结果分析及计算1.PCR技术的示意图(1)第二次循环结束后,体系中有3种长度不等的DNA单链(a、b、c)。①a表示原DNA的单链,共2条。②b是以a为模板合成的子链。③c表示以b为模板合成的子链。(2)第三次循环后,体系中(a+b)DNA有2个,(b+c)DNA有4个,(c+c)DNA(两条链等长的DNA)有2个。PCR的结果分析2.PCR中的数量关系汇总复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n共消耗引物的对数1=21-13=22-17=23-12n-1含某种特定引物的DNA分子数1=21-13=22-17=23-12n-1同时含两种引物的DNA分子数0=21-22=22-26=23-22n-2脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0=21-20=22-42=23-62n-2n(1)每一条子链都以引物为起点进行延伸,故新合成的子链数=消耗的引物数。(2)PCR体系需要两种引物,且两种引物同时使用,故消耗某种特定引物的数量=消耗的引物数/2。试一试下图为利用反转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析,下列说法错误的是

(

)

A.在第3轮循环结束后,两条链等长的DNA占1/4B.⑤过程使用70~75℃的温度处理既可以防止DN