第3章 同位素示踪技术课件

第3章同位素示踪技术中国农业大学

齐孟文第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术同位素示踪

通过同位素标记核素或同位素标记化合物跟踪研究相关物体运动过程及其规律的一种研究方法。§3.1同位素示踪的基本依据和特点

第3章同位素示踪技术

依据放射性同位素元素的同位素具有1)化学及生物学性质同一的示踪性2)物理性质差异的可探测性稳定性同位素元素的同位素具有1)化学及生物学性质同一的示踪性2)物理性质差异的可探测性3)同位素的天然组成恒定第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术在水文、地理及生物学中，相关周期表中的同位素要览。点击黄色标注的元素，即可链接到相应网页，可获得关于其特性及应用的简要说明。LINK：USGS（U.S.GeologicalSurvey）第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术特点放射性

1.测量灵敏度高活度检测限Amin=1Bq,相应物质的质量检测限10-12～10-17g

2.能与内源物质相区分，可在生理稳恒条件进行代谢研究。

3.样品制备及测定简便。

4.结合显影或显像技术可进行定位定量或半定量测定。稳定性

1.现代质谱核素丰度测定的精度可达0.01%.

2.利用同位素稀释原理可计算样品中的物质来自示踪剂的比率。

3.样品制备分析需大型设备。

4.无放射性，无衰变，无污染。有时是唯一的。第3章同位素示踪技术

§3.2标记核素与标记化合物

3.2.1放射性同位素常用放射性核素

核素半衰期衰变方式β粒子(MeV)γ射线(MeV)3H12.3yβ-(100)0.018614C5730yβ-(100)0.15632P14.28dβ-(100)1.71135S87.4dβ-(100)0.16745Ca165dβ-(100)0.25859Fe44.6dβ-(100)0.274(45.8)0.467(52.7)1.566(0.3γ….第3章同位素示踪技术3.2.1放射性同位素标记化合物化合物分子中某一元素的一个或数个普通核素原子被其放射性同位素核素原子所替代。1)标记方式均匀标记［U］

标记原子在相应位置均匀分布，丰度相同，由生物合成产生。

不定位标记[G]

标记原子在相应位置丰度不同，由同位素交换法产生。定位标记

标记原子在分子中有确定位置，由化学合成产生。第3章同位素示踪技术2)制备有机合成

简单标记化合物

复杂标记化物如：生物合成

饲喂标记前体→生物系统→生物大分子标记化合物。第3章同位素示踪技术

生物合成示例第3章同位素示踪技术同位素交换

RH+T2RT+HT

RH+T2ORT+THO

氚标可用所谓的气爆法进行.把底物涂到石英瓶内,抽真空后,充入氚气,通过高频放电或紫外光照射使氚气活化,促进交换.反应结束,抽吸剩余氚气,用易挥发溶剂转移产物,最后除去溶剂.第3章同位素示踪技术3)特点组成及总量不恒定放射性纯度

所需放射性核素的活度占标记化合物制剂总放射性活度的百分数。放化纯度

在制剂中，标记核素在特定标记化合物中的活度占该核素总活度的百分数。放化纯度可用放射性薄层分析测定。第3章同位素示踪技术放化纯度说明示例

如碘-131的NaI制剂，除131I-，还可能有131I2，若放化[I-131]NaI的放化纯度>95%，则表示以其他化学状态存在的碘131<5%。第3章同位素示踪技术辐射自分解

标记化合物的辐射对其自身所产生的离解作用。微量和低浓度

操作量为微居里(10-7-１０-14g)，因浓度低，单独不易沉淀，并易吸附损失，在操作时常需加入同位素载体，以避免吸附或进行共沉淀。第3章同位素示踪技术4)贮藏开瓶分装,降低放射性溶液的浓度，降低比活度。低温(2-4℃)及避光保存。第3章同位素示踪技术3.2.2稳定性同位素名词核素的丰度

一种核素在其所属元素的同位素原子中所占的原子百分数。核素的自然丰度核素在自然状态下的丰度。核素的原子百分超核素的丰度较自然丰度超出的部分。第3章同位素示踪技术常用核素

常用的稳定性示踪核素列表ElementHeavyisotopesLightisotopesH2D(0.0156%)1H(99.9844%)N15N(0.366%)14N(99.634%)C13C(1.108%)12C(98.892%)S36S(0.02%)

34S(4.22%)32S(95.02%)

33S(0.75%)O18O(0.204%)16O(99.759%)

17O(0.037%)第3章同位素示踪技术标记化合物

通过富集标记元素的稀有同位素核素或贫化其普通同位素核素所形成的化合物，以及核素的自然丰度因环境而异有较大的同位素分馏变异，带有原位标记“指纹”特点的化合物。第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术§3.3试验设计的一般原则和程序3.3.1放射性同位素示踪示踪剂的选择考虑因素核素(射线种类、能量和半衰期)，标记方式。

例：有机磷农药马拉硫磷残留研究，14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ标记均可，降解中的去甲基作用(14Ｃ～CH3—)，酯键的水解作用(14Ｃ，３Ｈ～Ｃ2Ｈ5—)，硫代磷酸脂键的反应，用32P或15Ｓ标记。第3章同位素示踪技术示踪剂量的估算引入量

标记化合物的用量，按一般实验要求确定。放射性总活度或比活度，要求能被精确测量，而又不过强。

分无或有内源物示踪两种情况讨论。第3章同位素示踪技术无内源

此种情况下，示踪剂在系统中未被稀释,化合物的比活度不变，示踪剂的比活度可由对样品活度的要求直接估计得到。

式中,nmin～样品的最小计数，最好为2000-4000cpm;

～仪器的计数效率；W～试样重量；C～样品中示踪物的含量。

若实验期间,放射性有明显衰变,应进行衰变校正。

第3章同位素示踪技术举例

无内源物质的示踪试验,如农药残留试验,试样重1克,要求计数率达到2400cpm,已知仪器的探测效率为80%,若要求对样品的检测灵敏度为0.1ppm,问示踪标记化合物的比活度至少为多少.第3章同位素示踪技术有内源

此种情况下，示踪剂在系统中被稀释。对示踪剂比活度的估计，除要考虑仪器的探测效率和实验期间放射性衰减外，必需考虑稀释作用的影响。示踪剂的比活度可由如下两种方法之一估计。

估值法

式中，W，C为试样重及物质浓度或含量；Pdff为来自示踪剂的比率。第3章同位素示踪技术倒推法

以盆栽为例，设植株总重M2

，试样重M1

最低计数率n(n≧4nb本底)。考虑：不均匀分布因子P1

试样的平均计数率：

仪器的探测效率

试样的活度：总样本量M2,

供试植株的总活度：第3章同位素示踪技术验期间的衰变引入时植株的活度：

A3＝Ａ2Ｐ2

，植株的吸收利用率应引入的活度：

回代得到：第3章同位素示踪技术举例

有内源物示踪实验示踪剂引入量的估计。以32P标记肥料实验为例，设实验持续100d,测量样品量取1g,植物平均含磷0.4%，其中来自肥料的比里率为Pdff(10%-50%),按25%估算，若样品用固闪杯法测量，仪器的探测效率为80%，要求计数率为2000cpm,试估算32P标记肥料的比活度。第3章同位素示踪技术示踪剂的准备开瓶分装对商业制剂进行必要稀释和转化的操作。工作程序

1.核查包装说例磷—32标记磷酸氢钠制剂

1)标记化合物名称Na２Ｈ３２ＰＯ4

2)物理化学状态溶液，无色透明

3)溶液体积5mci/ml4)比活度0.5mci/mmol5)放射性总活度2.5mci6)放射化学纯度100%7)测定日期2000.3.128)包装情况安培瓶盛装，再置铝罐内。2.确定稀释倍数浓度稀释关系

S0V0=S1V1式中，S0、S1和V0、V1分别为稀释前后制剂的放射性浓(μci/ml)，及体积。

比活度稀释关系:a0m0=a1(m0+m1)式中，a0、a1分别为标记化合物稀释前后的比活度，m0和m1为标记化合的质量和所加稳定性同位素载体的质量。第3章同位素示踪技术示踪剂的准备3.开瓶分装操作采用屏蔽和时间防护等措施，妥善处理废物。4.使用前测定活度及放化纯度，必要时应纯化。第3章同位素示踪技术示踪剂的引入植物体

根部水培、沙培、土培。

地上部涂抹法、注射法、点滴法。

动物体

注射法、涂布渗入法、吸入法。第3章同位素示踪技术示踪剂引入系统示例1．JimRasmussen,elat,2007.SoilBiology＆Biochemistry39,804-815.研究目的：套种体系碳、氮的转移、沉积和淋溶动态。实验布置：田间微区，插入PVC柱，内径30cm。示踪剂：14C-尿素，15N-尿素。标记方法：叶缘吸收。植物叶片插入到盛有示踪液的小管，小管由布拉膜密封，持续标记5天。14C-尿素标记用2ml管,盛1ml标记液，活度7.7×106dpm(3.5

Ci);15N-尿素用5ml管,盛2ml0.75%(w/v)丰度为99%的15N-尿素标记液。在整个生育期14C标记重复3次，15N标记重复5次。第3章同位素示踪技术2.JessicaL.Butler,elat,2004.SoilBiology＆Biochemistry36,371-382.研究目的：新固定的光合作用产物在植物根际的分布与周转。实验布置：盆栽。示踪剂：13CO2.标记方法：整株饲喂。盆栽植物移入气密的透明有机玻璃光合室进行标记，光合室长×宽×高为40.5×40.5×58.5cm3,每次标记11个盆。13CO2在光合室直接发生,标记开始时监测光合室CO2的浓度约为200ppm(v/v)，滴入1.5ml1.5M乳酸到盛有含22.4mgNaH13CO3(13C丰度为99%),此时光合室CO2的浓度大约升到约600ppm,待CO2的浓度降到200ppm，再在另一个含22.4mgNaH13CO3管中发生13CO2,此时CO2升至400ppm,待其再次降到200ppm，将标记盆移走，放入另一光合室内一段时间，以便使呼出的13CO2被固定，使标记最大化。第3章同位素示踪技术3.Florianwechern,elat,2007.SoilBiology＆Biochemistry39,2527-2537.研究目的：土壤根源性C和N的沉积及其归宿。实验：田间小区。示踪剂：14C-蔗糖，15N-尿。标记方法：茎部饲喂。标记溶液1ml浓度2%(w/v),13C丰度为99%的蔗糖和浓度0.5%(w/v)，15N丰度为99%的尿素。引入方法,在距根部约3cm的茎处钻0.5mm的洞，用灯芯与盛标记溶液的带盖试管相连，用硅胶密封连接处。

第3章同位素示踪技术

示踪研究举例

14CO2植物光合生理研究

目的：

测量光合强度，同化物的运转与分配，运转机理，源与库的关系及其调节，研究作物高产的光合生理。

1）14CO2标记

(14CO2+12CO2)的发生。

反应方程

(HClO4,H3PO4)Ba14CO3+Na2CO3

(14CO2+12CO2)第3章同位素示踪技术有关计量参量

光合作用二氧化碳的饱浓度为（0.12%-0.18%），一般向光合作用室引入0.1%～0.2%浓度,最高不0.5%,4CO2的放射性浓度(a)：整株标记，5

Ci/L；标记单个器官，几百kBq/L；标记大型树木，100

Ci/L。

设光合作用室的体积为V(L),二氧化碳的浓度为C(%),则,所需载体Na2CO3：第3章同位素示踪技术Na2CO3+2HClO4CO2+2NaClO4+H2O10622.4XV

C所需Ba14CO3的活度A=V

a发生过程：在光合作用室内直接发生，或预先在实验室发生，标记时注射法引入。第3章同位素示踪技术2）标记过程

光合室用聚氯乙稀（框或不框）封围供试体，扎紧，保证气密，在袋上封扎进气软胶皮导管。用注射器定量吸取发生好的(14CO2+12CO2）注入光合室，爆光30min后，抽出残气，用NaOH吸收。第3章同位素示踪技术第3章同位素示踪技术3）测样方法固样1050C杀青,800C烘干，磨碎.取100mg，低本底计数或固闪杯法测量。液样用碱湿消化或然烧法制样后用液闪测量。第3章同位素示踪技术4）结果分析14C分配率第3章同位素示踪技术样品的采集和制备采集

代表性

四分法缩减取样。

防止交叉污染

按活度由低到高顺序制备样品。制备

把样品转化为适合测量与分析的形态,由析对象和测量方式决定。第3章同位素示踪技术

液闪样品的制备均相样品在闪烁液中形成溶液。测量方式非均相乳浊液、悬浮液。固体支持样品吸附于滤膜再侵入闪烁液。均相样品制备法1）溶剂提取法

侵渍法样品→匀浆→振荡提取→离心过滤浓缩。索氏抽提用索氏器回流提取。第3章同位素示踪技术2）消化法酸消化:

0.2～0.6ml60%HClO450～100mg样品0.2～0.4mlH2O2注意14C有可能形成14CO2

，该法淬灭较碱消化法的大。碱消化:常用无机碱或季胺碱：1ml2MNaOH+80～100mg样品

2ml1～1.5M海胺甲醇液+400-450mg样品

第3章同位素示踪技术3)燃烧法

14CO2被碱性吸收液吸收样品

T2O吸收液配方：甲苯480ml

乙氧基乙醇400ml

乙醇胺120ml对14ＣＯ2的回收率的96-98%PPO6gPOPOP0.2g第3章同位素示踪技术3)燃烧法

甲苯800ml

乙氧基乙醇200mlPPO5g对3H水的回收率为96-98%POPOP0.2g乳化样品：使样品在闪烁体系中形成胶体或乳浊液。700ml甲苯+300mlTritonx100+PPO(5g)+POPOP(0.5g)

固体支持：样品滴加或沉淀在滤膜(滤纸、玻璃纤维、醋酸纤维)，干燥后浸入闪烁液，相对测量。第3章同位素示踪技术放射性测量数据的处理1.射性计数的统计涨落

由于核衰变受随机过程支配，在测量条件及源强不变条件下，放射性测量计数不是定值，而是围绕某一定值上下涨落的随机变数，在计数N＞100时，其分布可用正态分布描述：第3章同位素示踪技术实例样品12345678910Ni(2min)1880,1887,1915,1851,1874,1853,1931,1866,1980,1893样品11121314151617181920Ni(2min)1976,1876,1901,1979,1836,1832,1930,1917,1899,1890第3章同位素示踪技术1.放射性计数的统计涨落式中,M和

分别是分布的数学期望值和标准差，对于放射性计数特别有

＝，即只有一个独立的统计特征量。计数N出现在M±μ

区间的概率：第3章同位素示踪技术2.统计误差由一次测量结果或有限次测量的平均值作为计数期望值的估计所引起的误差,一般用标准差σN表示：结果表示为：

标准误差的统计意义:由正态分布知，任何一个计数落在M±σ区间的概率:P(｜N-M｜＜σ)＝68.3%反过来有:因此，标准误差表示N±σN区间包含真平均值的概率为68.3%。第3章同位素示踪技术3.函数统计误差的运算函数Z＝f(x,y)的误差传递公式第3章同位素示踪技术3.函数统计误差的运算1)计数率的误差计算上列第一次测量的计数率及误差。解:第3章同位素示踪技术3.函数统计误差的运算2)平均计数的误差

3)平均计数率的误差计算实例所列数据的平均计数率及误差。解:第3章同位素示踪技术3.函数统计误差的运算3)平均计数率的误差4)净计数率的误差，扣除本底的计率

第3章同位素示踪技术3.3.2稳定性15Ｎ同位素示踪示踪核素的丰度选择以15Ｎ肥料利用率试验为例:式中：W～施肥量或产量，N～含氮量(%)，a～原子百分超，R～肥料利用率，f、p～肥料或植物.样品采集与制备采集：代表性和防止交叉污染。第3章同位素示踪技术制备：将样品中的氮转变成N2

供质谱或光谱分析15Ｎ丰度.1)凯氏—里屯伯格法凯氏消煮植物0.3-0.5g

(1-1.5mgN)+5-10mlH2SO4土壤1-2g

2小时清亮后，继续

5小时第3章同位素示踪技术蒸馏定氮

在碱性条件，将氨蒸出并被硼酸吸收，然后用H2SO4滴定测量全N。样品全N含量

式中,V1

，V0—样品和对照消耗酸的体积

，V2—消煮液的定容体积，V3用于蒸馏定氮的消煮液体积。第3章同位素示踪技术过程

3ml10MNaOH/ml消煮液部分消煮液定容蒸馏2%H3BO4（+指示剂)吸收滴定酸化浓缩(2-3ml)密封保存里屯伯格转化将铵转化成N2，为防止大气中N2的稀释在高真空装置进行。

2NH4+＋３NaBrO+2OH-N2