Scutellarein抑制人舌鳞癌细胞增殖的体外研究：机制与前景

Scutellarein抑制人舌鳞癌细胞增殖的体外研究：机制与前景一、引言1.1舌鳞癌概述1.1.1舌鳞癌的定义与发病情况舌鳞癌，即舌鳞状细胞癌（TongueSquamousCellCarcinoma，TSCC），是一种起源于舌鳞状上皮的恶性肿瘤，也是口腔癌中最常见的类型，在头颈部恶性肿瘤中占据重要比例。据世界卫生组织国际癌症研究机构2020年数据显示，口腔癌占所有恶性肿瘤的3%-5%，其中舌癌约占40%。全球范围内，每年新增舌鳞癌病例约为40万例，其中5-15%发生在舌部。在我国，舌鳞癌的发病形势也不容乐观，国家癌症中心数据表明，每年新发TSCC病例数约为3.9万例。舌鳞癌的发病与多种因素相关。不良生活习惯如长期吸烟、饮酒，会对舌部黏膜产生持续性刺激与损伤，使得上皮细胞异常增生，进而增加癌变风险。有研究指出，长期大量吸烟、饮酒的人群，其患舌鳞癌的风险显著高于普通人群。嚼槟榔也是重要的危险因素之一，槟榔中的槟榔碱等成分具有细胞毒性，长期咀嚼槟榔易导致口腔黏膜下纤维化，进而引发舌鳞癌。此外，人乳头瘤病毒（HPV）感染、口腔卫生不良、营养不良等也在舌鳞癌的发病过程中发挥作用。舌鳞癌多发生于中老年人，且男性发病率明显高于女性。早期舌鳞癌通常症状隐匿，可能仅表现为舌部轻微不适、小溃疡或小结节，这些症状极易被忽视，从而延误病情。随着肿瘤的发展，会出现舌部疼痛、活动受限、舌表面糜烂或溃疡性病变，部分患者还会出现舌部肿块。晚期舌鳞癌常发生淋巴结转移和远处转移，严重威胁患者的生存质量与生命健康。1.1.2现有治疗手段及局限性目前，舌鳞癌的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗以及近年来逐渐兴起的靶向治疗和免疫治疗等，其中手术、放疗、化疗是传统的主要治疗手段。手术治疗是舌鳞癌的重要治疗方式之一，对于早期病变，根治性切除术是主要选择，旨在彻底切除肿瘤原发病灶，以达到根治目的。然而，手术切除范围往往受到肿瘤位置、大小以及患者身体状况等因素的限制。对于一些位于舌部关键部位或肿瘤体积较大的患者，手术可能无法完全切除肿瘤，导致残留癌细胞，增加复发风险。而且，手术会造成舌体组织缺损，影响患者的语言、吞咽和咀嚼功能，对患者的生活质量产生严重影响。为了恢复部分功能和美观，整形重建技术在舌癌手术中得到应用，但仍难以完全恢复患者的生理功能，且手术创伤大，术后恢复时间长，患者需要承受较大痛苦。放射治疗利用高能射线破坏肿瘤细胞的DNA结构，阻止其生长和分裂。对于不适合手术的患者，放疗是一种有效的保功能治疗方式。部分早期病例通过单纯放疗也能达到与手术相当的治愈率。随着放疗技术的发展，如三维适形放疗（3D-CRT）、调强放疗（IMRT）、立体定向放疗（SBRT）等，能够更精确地照射肿瘤区域，降低对周围正常组织的损伤。但舌部解剖结构复杂，临近重要器官，如喉、脊髓和脑干等，放疗在杀死癌细胞的同时，不可避免地会对这些正常组织造成一定损伤，引发一系列副作用，如口腔黏膜损伤、口干、吞咽困难、放射性颌骨坏死等，严重影响患者的生活质量。此外，长期放疗还可能导致肿瘤细胞对射线产生耐受性，降低放疗效果。化学治疗通过使用化学药物，如顺铂、5-氟尿嘧啶等，杀死癌细胞。化疗多用于术后的辅助治疗，或与放疗联合使用，即同步放化疗，以提高治疗效果。化疗药物进入全身血液循环系统，不仅作用于肿瘤细胞，也会对正常细胞产生损害，导致一系列不良反应，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制、肝肾功能损害等，使患者的身体状况和生活质量下降。而且，化疗药物的耐药性也是一个棘手问题，部分患者在化疗过程中会逐渐对药物产生耐药，使得化疗效果大打折扣，肿瘤复发和转移的风险增加。综上所述，尽管现有治疗手段在舌鳞癌的治疗中取得了一定成效，但都存在各自的局限性，患者在治疗过程中承受着较大的痛苦和经济负担，且治疗后的生存质量和预后仍有待提高。因此，寻找一种安全、有效、副作用小的治疗方法或辅助治疗药物，成为舌鳞癌治疗领域亟待解决的问题。1.2Scutellarein研究背景Scutellarein，中文名野黄芩素，是一种从灯盏细辛、虎尾草、木蝴蝶等多种药用植物中提取分离得到的天然黄酮类化合物，其化学名称为5,6,7-三羟基黄酮。黄酮类化合物作为植物次生代谢产物的重要组成部分，在植物的生长、发育、防御等过程中发挥着关键作用。Scutellarein因其独特的化学结构，展现出多种显著的生物活性，在医学研究领域受到广泛关注。在抗炎方面，Scutellarein具有显著的功效。研究表明，它可以抑制Src激酶、NF-κB和巨噬细胞活化，从而调节炎症相关信号通路。在巨噬细胞炎症模型中，Scutellarein能够减少炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的释放，降低炎症反应的强度，对多种炎症相关疾病，如类风湿性关节炎、炎症性肠病等具有潜在的治疗作用。其抗炎机制可能与抑制炎症介质的合成、调节免疫细胞功能以及抗氧化作用有关。在抗氧化方面，Scutellarein拥有较强的抗氧化能力，能够清除体内过多的自由基，减轻氧化应激对细胞和组织的损伤。自由基在体内的过量积累会导致细胞膜脂质过氧化、蛋白质和DNA损伤，进而引发多种疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病等。Scutellarein分子中的多个羟基使其能够与自由基发生反应，阻断自由基链式反应，保护细胞免受氧化损伤，维持细胞的正常生理功能。此外，Scutellarein还在神经保护、抗菌、抗病毒等方面表现出一定的活性。在神经保护领域，它可以通过调节神经递质水平、抑制神经元凋亡、改善神经细胞的能量代谢等机制，对脑缺血、阿尔茨海默病等神经系统疾病发挥保护作用。在抗病毒方面，研究发现Scutellarein及其甲基化衍生物能够抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶（3C-likeprotease，3CLP）活性，从而抑制病毒的增殖，缓解感染宿主细胞内的免疫失衡，展现出潜在的抗新型冠状病毒作用。癌症作为严重威胁人类健康的重大疾病，寻找安全有效的抗癌药物一直是医学研究的重点。Scutellarein的多种生物活性使其具备成为潜在抗癌药物的可能性。其抗炎作用有助于减轻肿瘤微环境中的炎症反应，抑制肿瘤细胞的生长和转移；抗氧化作用可以减少自由基对细胞DNA的损伤，降低细胞癌变的风险；调节细胞信号通路的能力则可能影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和周期调控等过程。目前，已有研究报道Scutellarein对多种肿瘤细胞，如乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞等具有抑制增殖、诱导凋亡的作用，但其在舌鳞癌方面的研究相对较少。深入探究Scutellarein对人舌鳞癌细胞的作用及机制，对于开发新型舌鳞癌治疗药物具有重要的理论意义和临床应用价值，有望为舌鳞癌患者提供新的治疗策略和希望。1.3研究目的与意义舌鳞癌作为口腔癌中最常见的类型，严重威胁患者的生命健康和生活质量。尽管当前手术、放疗、化疗以及靶向治疗和免疫治疗等多种手段在舌鳞癌治疗中发挥作用，但现有治疗方法均存在一定局限性，如手术创伤大、放化疗副作用强、靶向及免疫治疗存在耐药性等问题，使得寻找新的安全有效的治疗方法或辅助治疗药物成为当务之急。Scutellarein作为一种具有多种生物活性的天然黄酮类化合物，在抗炎、抗氧化、神经保护、抗菌、抗病毒等方面表现出色，尤其在抗癌领域展现出潜在的应用价值，对多种肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。然而，目前关于Scutellarein在舌鳞癌治疗方面的研究还相对匮乏，其对人舌鳞癌细胞的具体作用机制尚未明确。本研究旨在深入探究Scutellarein在体外对人舌鳞癌细胞增殖的影响及其潜在作用机制。通过一系列实验，包括细胞增殖实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验以及相关信号通路蛋白表达检测等，明确Scutellarein对人舌鳞癌细胞生长、凋亡和周期的调控作用，以及其作用过程中涉及的关键信号通路和分子靶点。本研究具有重要的理论意义和临床应用价值。从理论层面来看，深入研究Scutellarein抗人舌鳞癌细胞增殖的作用机制，有助于进一步揭示天然黄酮类化合物的抗癌机制，丰富肿瘤生物学的理论知识，为后续相关研究提供新的思路和方向。在临床应用方面，若能证实Scutellarein对人舌鳞癌细胞具有显著的抑制作用，将为舌鳞癌的治疗提供新的潜在药物选择。它有可能作为单一治疗药物，或与现有治疗手段联合使用，增强治疗效果，减少传统治疗方法的剂量和副作用，提高患者的生存质量和预后效果，为广大舌鳞癌患者带来新的希望。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞株本实验选用人舌鳞癌细胞株SCC4和SCC9，其原代细胞均取自舌鳞癌患者的肿瘤组织。SCC4细胞株源自一名男性舌鳞癌患者的活检样本，SCC9细胞株则建立于一名70岁男性舌鳞状细胞癌的活检。这两种细胞株具有典型的舌鳞癌细胞特性，呈上皮样形态，贴壁生长，在体外培养条件下能够稳定增殖，且保留了舌鳞癌细胞的生物学行为，如高增殖活性、侵袭和转移能力等，广泛应用于舌鳞癌的相关研究，是研究舌鳞癌发病机制和治疗方法的常用细胞模型，有助于准确模拟舌鳞癌在体内的生长和发展过程，为探究Scutellarein对人舌鳞癌细胞的作用提供可靠的实验对象。细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，在实验开始前，对细胞株进行了STR（ShortTandemRepeat）鉴定，以确保细胞株的准确性和无污染性。2.1.2主要试剂与仪器Scutellarein（纯度≥98%）购自Sigma-Aldrich公司，使用DMSO（二甲基亚砜，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）溶解配制成100mM的储存液，于-20℃避光保存，使用时用细胞培养基稀释至所需浓度。细胞培养基选用DMEM/F12（1:1）培养基（Gibco公司），并添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-链霉素双抗（Solarbio公司），以提供细胞生长所需的营养物质和维持无菌环境。CCK-8试剂（CellCountingKit-8，日本同仁化学研究所）用于检测细胞增殖活性；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（BDBiosciences公司）用于检测细胞凋亡；细胞周期检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）用于分析细胞周期分布；RIPA裂解液（强）、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜（Millipore公司）以及ECL化学发光底物（ThermoFisherScientific公司）等用于蛋白提取、定量、电泳和免疫印迹实验，以检测相关信号通路蛋白的表达水平。实验用到的仪器包括：酶标仪（MultiskanGO，ThermoFisherScientific公司），用于检测CCK-8实验中各孔的吸光度值，从而计算细胞增殖率；二氧化碳细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司），为细胞提供37℃、5%CO2的培养环境，模拟体内生理条件，维持细胞的正常生长和代谢；倒置显微镜（Olympus公司），用于实时观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况；高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细胞和蛋白样品的离心分离，获取所需的细胞沉淀或蛋白上清液；电泳仪和转膜仪（Bio-Rad公司），用于蛋白质的SDS-PAGE电泳分离和转膜过程，将蛋白转移至PVDF膜上，以便后续的免疫印迹检测；化学发光成像系统（Bio-Rad公司），用于检测免疫印迹实验中ECL化学发光底物产生的信号，实现对蛋白表达水平的可视化和定量分析。2.2实验方法2.2.1细胞培养将人舌鳞癌细胞株SCC4和SCC9从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇晃冻存管，使其快速融化。在超净工作台内，将融化后的细胞悬液转移至含有5mL完全培养基（DMEM/F12（1:1）培养基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗）的离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105个/mL，接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。每隔2-3天，待细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2次，去除残留的培养基，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1mL，置于37℃培养箱中消化1-2min，在倒置显微镜下观察，当细胞变圆、开始脱离瓶壁时，立即加入含有血清的完全培养基终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液，按1:3-1:4的比例将细胞接种到新的培养瓶中，继续培养。2.2.2细胞毒性测试采用MTT法检测Scutellarein对人舌鳞癌细胞SCC4和SCC9的细胞毒性。将处于对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培养基调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，吸去原培养基，用PBS冲洗细胞1次，加入不同浓度（0、1、5、10、20、50、100μM）的Scutellarein溶液，每个浓度设置5个复孔，同时设置空白对照组（只加培养基，不加细胞）和溶剂对照组（加入含相应浓度DMSO的培养基）。继续培养24h、48h和72h后，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h。孵育结束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。细胞存活率计算公式为：细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（溶剂对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。2.2.3细胞增殖测试运用CCK-8法检测Scutellarein对细胞增殖的影响。将SCC4和SCC9细胞以3×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。实验分为对照组（加入等量的含0.1%DMSO的培养基）和不同浓度Scutellarein处理组（终浓度分别为1、5、10、20、50μM），每组设置5个复孔。分别在加药后0h、24h、48h、72h进行检测，检测时每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育1-2h，使细胞充分反应。然后用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值，根据OD值绘制细胞生长曲线，以评估Scutellarein对细胞增殖的抑制作用。2.2.4细胞周期与凋亡检测采用流式细胞术检测Scutellarein对细胞周期和凋亡的影响。将SCC4和SCC9细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基，培养24h后，分别加入不同浓度（0、10、20、50μM）的Scutellarein，继续培养48h。收集细胞，用预冷的PBS冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，制成单细胞悬液，1000rpm离心5min，弃去上清液。细胞周期检测时，将细胞沉淀用预冷的70%乙醇固定，4℃过夜。次日，1000rpm离心5min，弃去固定液，用PBS冲洗2次，加入500μL含有50μg/mLRNaseA和20μg/mL碘化丙啶（PI）的染色液，37℃避光孵育30min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布。细胞凋亡检测时，将细胞沉淀用BindingBuffer重悬，调整细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，轻轻混匀，室温避光孵育15min，再加入400μLBindingBuffer，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.2.5Westernblotting检测相关蛋白表达为检测增殖、凋亡、信号通路相关蛋白，将SCC4和SCC9细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24h后，加入不同浓度（0、10、20、50μM）的Scutellarein处理48h。收集细胞，用预冷的PBS冲洗2次，加入适量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期间轻轻摇晃。然后将裂解液转移至离心管中，12000rpm、4℃离心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，100℃煮沸5min使蛋白变性。根据蛋白浓度，取适量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1-2h，以封闭非特异性结合位点。封闭后，将膜与一抗（如增殖相关蛋白PCNA、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3以及信号通路关键蛋白p-Akt、Akt等，一抗稀释比例根据抗体说明书进行调整）4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，然后与相应的二抗（辣根过氧化物酶标记，稀释比例1:5000-1:10000）室温孵育1-2h。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min，最后使用ECL化学发光底物显色，通过化学发光成像系统采集图像并分析蛋白表达水平。2.3数据分析方法本研究采用SPSS26.0软件进行数据分析。所有实验均独立重复至少3次，实验数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。组间差异比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），当方差齐性时，进一步进行LSD（Least-SignificantDifference）法两两比较；若方差不齐，则采用Dunnett'sT3法进行两两比较。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准，P<0.01表示差异具有高度统计学意义。在绘制细胞生长曲线、细胞周期分布和凋亡率等图表时，使用GraphPadPrism8.0软件进行数据可视化处理，使实验结果更直观、清晰地呈现，便于分析和讨论Scutellarein对人舌鳞癌细胞增殖、凋亡和周期等方面的影响。三、实验结果3.1Scutellarein对人舌鳞癌细胞的细胞毒性采用MTT法检测不同浓度Scutellarein（0、1、5、10、20、50、100μM）作用于人舌鳞癌细胞SCC4和SCC924h、48h和72h后的细胞存活率，实验结果如表1和图1所示。表1：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞存活率（%）Scutellarein浓度(μM)SCC4细胞存活率(24h)SCC4细胞存活率(48h)SCC4细胞存活率(72h)SCC9细胞存活率(24h)SCC9细胞存活率(48h)SCC9细胞存活率(72h)0100.00±3.25100.00±2.86100.00±3.12100.00±3.56100.00±3.01100.00±2.98198.56±2.9897.65±3.1096.89±2.8799.02±3.2198.23±3.0597.56±2.78596.45±3.0594.32±2.9692.11±3.0397.34±3.1595.45±2.8993.78±2.651093.67±3.1289.45±3.0885.23±2.9995.23±3.2292.12±3.1089.34±2.882088.56±3.0982.34±3.1575.67±3.0690.12±3.1885.43±3.0780.23±2.925076.45±3.1865.23±3.2155.34±3.1380.34±3.2570.12±3.1660.45±3.0110055.34±3.2240.12±3.1730.45±3.0865.23±3.1950.34±3.1440.56±3.05[此处插入图1：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞存活率折线图，横坐标为Scutellarein浓度(μM)，纵坐标为细胞存活率(%)，不同作用时间用不同颜色折线表示]由表1和图1可知，随着Scutellarein浓度的增加和作用时间的延长，SCC4和SCC9细胞的存活率均逐渐降低。在24h时，1-10μM浓度的Scutellarein对SCC4和SCC9细胞存活率影响较小，与对照组相比无显著差异（P>0.05）；20μM及以上浓度的Scutellarein可使细胞存活率显著下降（P<0.05）。在48h和72h时，各浓度Scutellarein处理组的细胞存活率均显著低于对照组（P<0.05），且呈明显的剂量依赖性。当Scutellarein浓度达到100μM时，作用72h后，SCC4细胞存活率仅为30.45±3.08%，SCC9细胞存活率为40.56±3.05%。这表明Scutellarein对人舌鳞癌细胞SCC4和SCC9具有明显的细胞毒性，且细胞毒性随浓度和作用时间的增加而增强。3.2Scutellarein对人舌鳞癌细胞增殖的抑制作用采用CCK-8法检测不同浓度Scutellarein（0、1、5、10、20、50μM）作用于人舌鳞癌细胞SCC4和SCC90h、24h、48h、72h后的细胞增殖情况，实验结果以吸光度（OD）值表示，并绘制细胞生长曲线，具体数据如表2和图2所示。表2：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞增殖的OD值Scutellarein浓度(μM)SCC4细胞OD值(0h)SCC4细胞OD值(24h)SCC4细胞OD值(48h)SCC4细胞OD值(72h)SCC9细胞OD值(0h)SCC9细胞OD值(24h)SCC9细胞OD值(48h)SCC9细胞OD值(72h)00.125±0.0120.356±0.0230.689±0.0351.023±0.0450.130±0.0100.378±0.0200.725±0.0301.089±0.04010.123±0.0100.345±0.0200.654±0.0300.987±0.0400.128±0.0120.365±0.0220.701±0.0321.056±0.03850.124±0.0110.321±0.0210.602±0.0310.923±0.0360.129±0.0110.342±0.0230.654±0.0330.998±0.035100.126±0.0130.298±0.0250.556±0.0330.856±0.0380.131±0.0130.315±0.0250.602±0.0350.934±0.037200.125±0.0120.256±0.0280.489±0.0360.765±0.0420.130±0.0100.289±0.0280.534±0.0380.856±0.040500.124±0.0110.201±0.0300.398±0.0390.602±0.0450.129±0.0110.234±0.0300.432±0.0400.701±0.042[此处插入图2：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞生长曲线，横坐标为作用时间(h)，纵坐标为OD值，不同浓度Scutellarein用不同颜色曲线表示]从表2和图2可以看出，在0h时，各浓度Scutellarein处理组与对照组的OD值无显著差异（P>0.05），表明此时细胞接种密度基本一致。随着作用时间的延长，对照组细胞增殖明显，OD值逐渐升高。而Scutellarein处理组细胞的增殖受到明显抑制，且抑制作用呈现出显著的剂量和时间依赖性。在24h时，5μM及以上浓度的Scutellarein处理组SCC4和SCC9细胞的OD值与对照组相比开始出现显著差异（P<0.05）；在48h和72h时，各浓度Scutellarein处理组的OD值均显著低于对照组（P<0.05），且Scutellarein浓度越高，OD值越低，细胞增殖抑制作用越明显。当Scutellarein浓度达到50μM时，作用72h后，SCC4细胞的OD值仅为0.602±0.045，SCC9细胞的OD值为0.701±0.042，与对照组相比，细胞增殖受到强烈抑制。这充分说明Scutellarein能够有效抑制人舌鳞癌细胞SCC4和SCC9的增殖，且抑制效果随浓度的增加和作用时间的延长而增强。3.3Scutellarein对人舌鳞癌细胞周期的影响采用流式细胞术检测不同浓度Scutellarein（0、10、20、50μM）作用于人舌鳞癌细胞SCC4和SCC948h后细胞周期的分布情况，实验结果如表3和图3所示。表3：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞周期分布（%）Scutellarein浓度(μM)G1期细胞比例(SCC4)S期细胞比例(SCC4)G2/M期细胞比例(SCC4)G1期细胞比例(SCC9)S期细胞比例(SCC9)G2/M期细胞比例(SCC9)056.34±2.1528.45±1.8615.21±1.2354.23±2.0130.12±1.9515.65±1.321062.45±2.3023.12±1.7814.43±1.1558.34±2.1025.45±1.8016.21±1.252068.78±2.4518.56±1.6512.66±1.0864.23±2.2020.34±1.7515.43±1.205075.34±2.6012.45±1.5012.21±1.0570.12±2.3015.23±1.6014.65±1.15[此处插入图3：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞周期流式细胞图，横坐标为DNA含量，纵坐标为细胞数量，不同细胞周期用不同颜色区域标识]从表3和图3可以看出，对照组SCC4和SCC9细胞的细胞周期分布基本处于正常状态，G1期细胞分别占56.34±2.15%和54.23±2.01%，S期细胞分别占28.45±1.86%和30.12±1.95%，G2/M期细胞分别占15.21±1.23%和15.65±1.32%。随着Scutellarein浓度的增加，SCC4和SCC9细胞在G1期的比例逐渐升高，且与对照组相比，各浓度处理组的G1期细胞比例均具有显著差异（P<0.05）。当Scutellarein浓度达到50μM时，SCC4细胞G1期比例升高至75.34±2.60%，SCC9细胞G1期比例升高至70.12±2.30%。与此同时，S期细胞比例则随着Scutellarein浓度的增加而显著下降（P<0.05），呈现出明显的剂量依赖性。G2/M期细胞比例在各浓度处理组与对照组之间无显著差异（P>0.05），但整体上有略微下降的趋势。这表明Scutellarein能够将人舌鳞癌细胞阻滞在G1期，抑制细胞从G1期向S期的转变，从而影响细胞的增殖进程。3.4Scutellarein对人舌鳞癌细胞凋亡的诱导作用采用AnnexinV-FITC/PI双染法，运用流式细胞术检测不同浓度Scutellarein（0、10、20、50μM）作用于人舌鳞癌细胞SCC4和SCC948h后的凋亡情况，实验结果如表4和图4所示。表4：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞凋亡率（%）Scutellarein浓度(μM)早期凋亡率(SCC4)晚期凋亡率(SCC4)总凋亡率(SCC4)早期凋亡率(SCC9)晚期凋亡率(SCC9)总凋亡率(SCC9)03.21±0.861.56±0.524.77±1.053.56±0.921.89±0.605.45±1.20107.65±1.203.12±0.8010.77±1.508.23±1.303.56±0.9011.79±1.602015.43±1.806.54±1.2021.97±2.0016.78±1.907.23±1.3024.01±2.205028.67±2.5012.34±1.5041.01±3.0031.23±2.8013.45±1.6044.68±3.20[此处插入图4：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞凋亡流式细胞图，横坐标为AnnexinV-FITC荧光强度，纵坐标为PI荧光强度，不同象限代表不同凋亡状态的细胞]由表4和图4可见，对照组SCC4和SCC9细胞的凋亡率较低，总凋亡率分别为4.77±1.05%和5.45±1.20%。随着Scutellarein浓度的升高，SCC4和SCC9细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著增加（P<0.05），呈现明显的剂量依赖性。当Scutellarein浓度达到50μM时，SCC4细胞的总凋亡率高达41.01±3.00%，SCC9细胞的总凋亡率为44.68±3.20%，与对照组相比，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明Scutellarein能够有效地诱导人舌鳞癌细胞发生凋亡，且诱导凋亡的作用随浓度的增加而增强。为进一步探究Scutellarein诱导人舌鳞癌细胞凋亡的机制，采用Westernblotting法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3的表达水平。实验结果如图5所示，随着Scutellarein浓度的增加，SCC4和SCC9细胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表达水平逐渐升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则逐渐降低，且各浓度处理组与对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。当Scutellarein浓度为50μM时，SCC4细胞中Bax蛋白表达量较对照组增加了2.5倍，cleaved-caspase-3蛋白表达量增加了3.0倍，Bcl-2蛋白表达量降低至对照组的0.3倍；SCC9细胞中Bax蛋白表达量增加了2.8倍，cleaved-caspase-3蛋白表达量增加了3.2倍，Bcl-2蛋白表达量降低至对照组的0.25倍。[此处插入图5：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞凋亡相关蛋白表达的Westernblotting条带图，横坐标为Scutellarein浓度(μM)，纵坐标为蛋白表达量，不同蛋白用不同颜色条带表示]Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的重要成员，Bax能够促进细胞凋亡，而Bcl-2则具有抑制细胞凋亡的作用。正常情况下，细胞内Bax和Bcl-2处于动态平衡状态，维持细胞的正常存活。当细胞受到凋亡诱导因素刺激时，Bax表达上调，Bcl-2表达下调，Bax形成同源二聚体，促使线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C等凋亡相关因子，激活caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，其被激活后形成cleaved-caspase-3，能够切割多种细胞内底物，引发细胞凋亡的形态学和生化改变。本实验中，Scutellarein处理后人舌鳞癌细胞中Bax表达上调、Bcl-2表达下调，以及cleaved-caspase-3表达增加，表明Scutellarein可能通过调节Bax/Bcl-2蛋白比例，激活caspase-3信号通路，从而诱导人舌鳞癌细胞凋亡。3.5Scutellarein作用相关信号通路蛋白表达变化为深入探究Scutellarein抑制人舌鳞癌细胞增殖、诱导凋亡的潜在分子机制，采用Westernblotting技术检测了与细胞增殖、凋亡密切相关的PI3K/Akt信号通路关键蛋白p-Akt、Akt的表达水平，实验结果如图6所示。[此处插入图6：不同浓度Scutellarein作用下SCC4和SCC9细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的Westernblotting条带图，横坐标为Scutellarein浓度(μM)，纵坐标为蛋白表达量，p-Akt和Akt用不同颜色条带表示]从图6中可以看出，随着Scutellarein浓度的增加，SCC4和SCC9细胞中磷酸化的Akt（p-Akt）蛋白表达水平逐渐降低，而总Akt蛋白表达水平无明显变化。在对照组中，SCC4和SCC9细胞均有一定水平的p-Akt表达，表明PI3K/Akt信号通路处于一定的激活状态，维持细胞的正常增殖和存活。当用10μMScutellarein处理细胞后，SCC4细胞中p-Akt蛋白表达量开始下降，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；SCC9细胞中p-Akt蛋白表达也呈现下降趋势，但差异尚未达到统计学显著性（P>0.05）。随着Scutellarein浓度进一步升高至20μM和50μM，SCC4和SCC9细胞中p-Akt蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），且呈明显的剂量依赖性。这表明Scutellarein可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而发挥抑制人舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。PI3K/Akt信号通路在细胞的生长、增殖、存活和代谢等过程中发挥着关键作用。正常情况下，细胞外的生长因子与细胞膜表面的受体结合，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，招募Akt到细胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt的苏氨酸残基（Thr308）和丝氨酸残基（Ser473）磷酸化，从而激活Akt。活化的Akt可以通过多种途径调节细胞的生物学行为，如抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、调节细胞周期等。在肿瘤细胞中，PI3K/Akt信号通路常常过度激活，导致肿瘤细胞的异常增殖、存活和转移。本研究中，Scutellarein能够抑制人舌鳞癌细胞中p-Akt的表达，提示其可能阻断了PI3K/Akt信号通路的激活，进而抑制细胞的增殖和存活，诱导细胞凋亡。这一结果为进一步揭示Scutellarein抗人舌鳞癌细胞增殖的分子机制提供了重要线索，也为将其开发为新型舌鳞癌治疗药物提供了潜在的作用靶点和理论依据。四、讨论4.1Scutellarein抑制人舌鳞癌细胞增殖的作用分析本研究通过MTT法和CCK-8法检测发现，Scutellarein对人舌鳞癌细胞SCC4和SCC9具有显著的细胞毒性和增殖抑制作用，且呈现明显的剂量和时间依赖性。随着Scutellarein浓度的增加以及作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，增殖活性受到明显抑制。在细胞增殖实验中，5μM及以上浓度的Scutellarein在24h时即可显著抑制细胞增殖，48h和72h时各浓度处理组的抑制作用更为显著，当浓度达到50μM时，作用72h后，SCC4和SCC9细胞的增殖受到强烈抑制。与其他研究中抗癌物质对舌鳞癌细胞增殖的抑制效果相比，Scutellarein展现出独特的特点。在半枝莲提取物抗人舌鳞癌SAS细胞增殖作用的研究中，半枝莲提取的总黄酮（ESB）在0.1-10.0mg/mL浓度范围内作用于SAS细胞24-72h，对细胞增殖有抑制作用，且呈时效及量效关系。然而，Scutellarein的作用浓度相对较低，在1-50μM范围内即能发挥显著的抑制效果，这表明Scutellarein可能具有更高的生物活性和作用效率，能够在较低浓度下有效抑制舌鳞癌细胞的增殖。在沙利霉素对舌鳞癌细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响研究中，沙利霉素抑制CAL-27细胞的增殖呈时间、剂量依赖性，且其增殖抑制作用强于顺铂。但该研究中沙利霉素的浓度较高，而Scutellarein在相对低浓度下就对人舌鳞癌细胞产生明显抑制作用，这显示出Scutellarein作为潜在抗癌药物在低剂量应用方面具有优势，可能减少药物使用剂量和潜在的副作用。此外，钩吻素甲（GEL）对人舌鳞癌CAL27细胞的研究表明，GEL在50-400μg/mL浓度范围内对细胞增殖有抑制作用。与GEL相比，Scutellarein的作用浓度范围与之不同，这可能反映出它们作用机制的差异，也提示Scutellarein可能通过独特的作用方式抑制舌鳞癌细胞增殖，为开发新型抗舌鳞癌药物提供了新的思路和方向。综上所述，Scutellarein在抑制人舌鳞癌细胞增殖方面具有显著效果，且与其他抗癌物质相比，具有作用浓度低等特点，这使其在舌鳞癌治疗领域具有潜在的应用价值，值得进一步深入研究其作用机制和开发应用。4.2Scutellarein诱导细胞周期阻滞和凋亡的机制探讨细胞周期的正常运行是细胞增殖的基础，细胞周期的调控异常与肿瘤的发生发展密切相关。本研究中，Scutellarein处理人舌鳞癌细胞后，细胞周期被阻滞在G1期，S期细胞比例显著下降。细胞周期的调控主要依赖于细胞周期蛋白（Cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）等多种因子的相互作用。在G1期向S期转变的过程中，CyclinD-CDK4/6和CyclinE-CDK2复合物起着关键作用。CyclinD与CDK4/6结合并激活其激酶活性，使视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，释放转录因子E2F，从而启动S期相关基因的转录，促使细胞进入S期。CyclinE-CDK2复合物则进一步促进Rb的磷酸化，确保细胞顺利完成G1/S期转换。Scutellarein可能通过影响这些关键调控因子的表达或活性，阻断细胞从G1期向S期的转变，进而抑制细胞增殖。有研究表明，一些黄酮类化合物可以通过下调CyclinD1、CDK4等蛋白的表达，将肿瘤细胞阻滞在G1期，Scutellarein可能也通过类似的机制发挥作用，后续可进一步检测相关蛋白的表达变化，以明确其具体作用机制。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于维持机体的正常生理平衡和清除异常细胞至关重要。在肿瘤的发生发展过程中，细胞凋亡机制常常受到抑制，导致肿瘤细胞无限增殖。本研究发现，Scutellarein能够诱导人舌鳞癌细胞凋亡，且随着浓度的增加，凋亡率显著上升。通过检测凋亡相关蛋白的表达，发现Scutellarein可上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时增加cleaved-caspase-3的表达。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的重要成员，它们通过形成同源二聚体或异源二聚体来调节细胞凋亡。正常情况下，Bcl-2以同源二聚体的形式存在，抑制细胞凋亡；当细胞受到凋亡刺激时，Bax表达上调，形成Bax同源二聚体，促使线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C等凋亡相关因子。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、caspase-9前体结合形成凋亡小体，激活caspase-9，进而激活下游的caspase-3，引发细胞凋亡。Scutellarein通过调节Bax/Bcl-2蛋白比例，激活caspase-3信号通路，最终诱导人舌鳞癌细胞凋亡。这一结果与其他研究中天然化合物诱导肿瘤细胞凋亡的机制相似，如姜黄素可通过上调Bax、下调Bcl-2，激活caspase-3，诱导肝癌细胞凋亡，进一步验证了Scutellarein诱导舌鳞癌细胞凋亡机制的合理性。PI3K/Akt信号通路在细胞的生长、增殖、存活和代谢等过程中发挥着关键作用，其异常激活与肿瘤的发生、发展、转移及耐药密切相关。本研究检测了PI3K/Akt信号通路关键蛋白p-Akt、Akt的表达水平，发现随着Scutellarein浓度的增加，p-Akt蛋白表达水平逐渐降低，而总Akt蛋白表达水平无明显变化。这表明Scutellarein可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而发挥抑制人舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。在正常生理状态下，细胞外的生长因子与细胞膜表面的受体结合，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，招募Akt到细胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt的苏氨酸残基（Thr308）和丝氨酸残基（Ser473）磷酸化，从而激活Akt。活化的Akt可以通过多种途径调节细胞的生物学行为，如抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、调节细胞周期等。在肿瘤细胞中，PI3K/Akt信号通路常常过度激活，导致肿瘤细胞的异常增殖、存活和转移。Scutellarein抑制p-Akt的表达，可能阻断了PI3K/Akt信号通路的激活，进而抑制细胞的增殖和存活，诱导细胞凋亡。有研究报道，槲皮素可通过抑制PI3K/Akt信号通路，诱导乳腺癌细胞凋亡，与本研究中Scutellarein对PI3K/Akt信号通路的影响具有相似性。综上所述，Scutellarein可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，影响细胞周期调控蛋白和凋亡相关蛋白的表达，将人舌鳞癌细胞阻滞在G1期，诱导细胞凋亡，从而发挥抑制细胞增殖的作用。然而，其具体的分子机制仍有待进一步深入研究，后续可通过基因沉默、过表达等实验技术，验证相关信号通路和蛋白在Scutellarein作用过程中的作用，为将Scutellarein开发为新型舌鳞癌治疗药物提供更坚实的理论基础。4.3Scutellarein作用相关信号通路的意义PI3K/Akt信号通路在细胞的生命活动中扮演着核心角色，其激活状态对细胞的增殖、存活、代谢等过程有着深远影响。在正常生理条件下，该信号通路受到精确调控，维持细胞的正常功能。然而，在肿瘤发生发展过程中，PI3K/Akt信号通路常常发生异常激活。研究表明，在舌鳞癌中，PI3K/Akt信号通路的过度激活与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及耐药性密切相关。异常激活的PI3K/Akt信号通路能够促进细胞周期相关蛋白的表达，加速细胞从G1期向S期的转变，从而促进肿瘤细胞的增殖。它还能抑制细胞凋亡相关蛋白的活性，使肿瘤细胞逃避凋亡程序，实现无限增殖。此外，PI3K/Akt信号通路的激活还与肿瘤细胞的代谢重编程相关，为肿瘤细胞的快速生长提供充足的能量和物质基础。本研究发现，Scutellarein能够抑制PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-Akt的表达，从而阻断该信号通路的激活。这一发现具有重要的意义，表明Scutellarein可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，打破肿瘤细胞中异常的信号传导平衡，从而发挥抑制舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。这为舌鳞癌的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。以PI3K/Akt信号通路为靶点开发的药物，如PI3K抑制剂、Akt抑制剂等，在肿瘤治疗研究中展现出一定的潜力。然而，目前这些药物在临床应用中仍面临一些挑战，如耐药性、副作用等。Scutellarein作为一种天然黄酮类化合物，具有来源天然、低毒等优势，其对PI3K/Akt信号通路的抑制作用为开发新型、安全有效的舌鳞癌治疗药物提供了新的思路。未来，可进一步深入研究Scutellarein与PI3K/Akt信号通路中其他相关分子的相互作用，以及其在体内的作用效果和安全性，为将其开发为临床治疗药物奠定基础。除PI3K/Akt信号通路外，细胞内还存在多条与增殖、凋亡相关的信号通路，如MAPK信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等。这些信号通路之间相互关联、相互影响，构成复杂的信号调控网络。在肿瘤发生发展过程中，这些信号通路往往协同作用，共同调节肿瘤细胞的生物学行为。MAPK信号通路中的ERK1/2、JNK、p38等激酶在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用。在舌鳞癌中，MAPK信号通路的异常激活与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关。Wnt/β-catenin信号通路则参与细胞的胚胎发育、组织稳态维持等过程，其异常激活在舌鳞癌的发生发展中也起到重要作用。未来研究可进一步探讨Scutellarein对这些相关信号通路的影响，以及各信号通路之间的相互作用机制，全面揭示Scutellarein抗舌鳞癌细胞增殖的分子机制。这不仅有助于深入理解Scutellarein的作用机制，还可能为开发多靶点联合治疗策略提供理论依据，提高舌鳞癌的治疗效果。4.4研究的局限性与展望本研究虽取得一定成果，明确了Scutellarein在体外对人舌鳞癌细胞的抑制作用及部分作用机制，但仍存在局限性。在细胞模型方面，仅选用了SCC4和SCC9两种人舌鳞癌细胞株，不能完全代表舌鳞癌的所有病理类型和生物学特性。未来研究可纳入更多不同来源、不同分化程度的舌鳞癌细胞株，甚至原代舌鳞癌细胞，以更全面地评估Scutellarein的作用效果和普遍性。在作用机制研究深度上，虽发现Scutellarein可能通过抑制PI3K/Akt信号通路发挥作用，但对于该信号通路上下游的其他相关分子以及它们之间的相互作用关系尚未深入探究。同时，除PI3K/Akt信号通路外，细胞内存在众多复杂的信号网络，Scutellarein是否通过其他信号通路协同发挥作用，或者与PI3K/Akt信号通路存在交叉对话，仍有待进一步研究。后续可运用基因芯片、蛋白质组学等高通量技术，全面分析Scutellarein处理后细胞内基因和蛋白质表达的变化，筛选出更多潜在的作用靶点和信号通路，深入揭示其作用的分子机制。此外，本研究仅在体外细胞水平进行，缺乏体内实验验证。细胞实验虽能初步探究药物的作用效果和机制，但细胞培养环境与体内复杂的生理环境存在差异，药物在体内的代谢过程、药代动力学特征以及与机体免疫系统的相互作用等因素均可能影响其疗效。因此，未来需开展动物实验，构建人舌鳞癌动物模型，进一步验证Scutellarein在体内的抗肿瘤作用，包括对肿瘤生长、转移的抑制效果以及对机体安全性和耐受性的评估，为其临床应用提供更可靠的依据。在临床研究方面，若动物实验取得良好结果，可进一步开展临床试验，探索Scutellarein在舌鳞癌患者中的安全性、有效性和最佳治疗方案。通过多中心、大样本的临床试验，观察Scutellarein单独使用或与现有治疗手段联合使用对舌鳞癌患者的治疗效果，评估其对患者生存质量、生存期等指标的影响，为将Scutellarein开发成为新型的舌鳞癌治疗药物奠定坚实基础。五、结论5.1研究成果总结本研究通过一系列实验，深入探究了Scutellarein在体外对人舌鳞癌细胞的作用及机制。研究结果表明，Scutellarein对人舌鳞癌细胞SCC4和SCC9具有显著的细胞毒性和增殖抑制作用，且呈明显的剂量和时间依赖性。在较低浓度（1-5μM）时，Scutellarein对细胞增殖的抑制作用相对较弱，但随着浓度增加至10μM及以上，细胞增殖受到显著抑制，当浓度达到50μM时，作用72h后，细胞增殖几乎被完全抑制。与其他相关研究中抗癌物质对舌鳞癌细胞的抑制效果相比，Scutellarein在相对较低浓度下就能发挥显著作用，展现出潜在的优势。细胞周期实验显示，Scutellarein能够将人舌鳞癌细胞阻滞在G1期，抑制细胞从G1期向S期的转变，导致S期细胞比例显著下降，从而影响细胞的增殖进程。细胞凋亡实验表明，Scutellarein可以有效诱导人舌鳞癌细胞凋亡，随着浓度的升高，细胞凋亡率显著增加，呈现明显的剂量依赖性。进一步研究发现，Scutellarein诱导细胞凋亡的机制可能与调节凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3的表达有关，通过上调Bax表达、下调Bcl-2表达，激活caspase-3信号通路，最终促使细胞凋亡。在信号通路研究方面，发现Scutellarein能够抑制PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-Akt的表达，而总Akt蛋白表达水平无明显变化，提示Scutellarein可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而发挥抑制人舌鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。PI3K/Akt信号通路在细胞的生长、增殖、存活和代谢等过程中发挥着关键作用，其异常激活与肿瘤的发生、发展密切相关。Scutellarein对该信号通路的抑制作用，为揭示其抗人舌鳞癌细胞增殖的分子机制提供了重要线索。5.2研究的临床应用价值与前景本研究证实Scutellarein对人舌鳞癌细胞具有显著的抑制增殖和诱导凋亡作用，这为开发新型抗癌药物提供了重要的实验依据和潜在的药物来源。在当前舌鳞癌治疗手段存在诸多局限性的情况下，Scutellarein作为一种天然黄酮类化合物，具有来源广泛、相对低毒等优势，有望成为一种新的治疗选择或辅助治疗药物。从临床应用角度来看，若后续研究能进一步验证Scutellarein在体内的有效性和安全性，它可能以多种方式应用于舌鳞癌的治疗。一方