第5章微生物的遗传变异与菌种选育49课件

第5章微生物的遗传变异与菌种选育爱国主义精神，指的是在几千年的发展中，中华民族形成了以爱国主义为核心的伟大的创造精神，奋斗精神，团结精神，梦想精神。爱国主义是一种崇高的思想品德。为祖国奉献一切的献身精神是中华民族的爱国主义美德之一。在古代历史上曾涌现出许多著名的爱国者和民族英雄，如不畏强暴的晏婴，英勇抗击匈奴的卫青、霍去病，精忠报国的岳飞，“男儿到死心如铁”的辛弃疾，保卫北京的于谦，抗击倭寇的戚继光，横戈戍边抗清的袁崇焕，少年英雄夏完淳，“也留正气在乾坤”的张煌言，收复台湾的郑成功、毕生致力革命创导新学的何子渊、精忠报国的抗日儒将厉麟似等。他们的爱国献身精神至今仍具有巨大的精神感召力，是进行爱国主义教育的好素材。特别是在近现代的历史上，当中国遭到帝国主义列强的疯狂侵略，出现了亡国灭种的危机时，中华儿女的爱国主义精神更是越加激发而不可动摇，越发显示出它的战斗锋芒和精神力量。从孙中山、黄兴、何子渊、邹容、秋瑾等资产阶级革命家到李大钊、毛泽东、周恩来、刘少奇、朱德、彭德怀、董必武等无产阶级革命家，都继承了中华民族“以天下为己任”的爱国主义优良传统，将振兴中华的责任置于肩上。农产品质量安全的重要性加强农产品质量安全工作是统筹城乡社会发展，全面建设农村小康社会的必然要求。农产品质量安全事关重大，既关系农业生产、农民收入，也关系城乡人民的生活与健康。农产品质量安全的重要性确保农产品质量安全和消费是全面建设小康社会的要求，是统筹城乡经济社会发展的重要结合点，没有消费就没有生产，健全农产品质量安全体系，实施无公害食品行动计划，使人民吃上放心食品。

学习任务1．

微生物的遗传变异基础知识2. 选育微生物的菌种3. 微生物菌种的退化、复壮和保藏

教学目标专业能力目标1．能够说出什么是遗传达,什么是变异；2．能够正确理遗传变异的物质基础；3．能够说出从自然界筛选菌种的方法及其它选育菌种的方法；4．能够说出菌种退化的原因；5．能够说出菌种复壮和保藏的方法；6．能进行纯种分离。7．能进行菌种保藏实验8．能整理实验室。

教学目标社会能力

1.提高容忍、沟通和协调能力；2.提高团队协作能力；3.提高组织协调能力；4.提高参与行为、任务的完成、遵循指导能力。

第5章微生物的遗传变异与菌种选育

职业态度1．培养规范意识和质量意识；2．培养吃苦耐劳、爱岗敬业精神；3．树立安全意识和环保意识；4．培养高度的责任心教学目标第5章微生物的遗传变异与菌种选育

提出微生物菌种选育的项目任务设想，分发学习任务第5章微生物的遗传变异与菌种选育回本章目录微生物的遗传变异

基础知识遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。微生物遗传性在合适的环境条件下微生物的生物学性状（包括大小、形态、结构、繁殖等）保持基本稳定，并可靠遗传物质的复制传给子代，使子代也具有相同的性状。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；------是一种内在可能性或潜力。

遗传型+环境条件表型代谢发育微生物变异性微生物的子代较之亲代以及子代不同个体之间在性状上存在某些差异。表型（phenotype）：

指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;------是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）；b.形状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25℃，又恢复产色素的能力。25℃下培养37℃下培养25℃下培养遗传的物质基础1、遗传物质的验证实验①DNA是遗传物质只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性→DNA是转化所必需的转化因子②T2噬菌体感染实验③病毒拆分重建实验DNA分子的结构DNA双螺旋结构DNA的碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)4种，其中一条链的碱基与另一条链的碱基严格配对

A

T

C

G碱基之间由氢键连接。DNA双链受热到一定温度，

碱基之间的氢键会断裂，分开为两条单链，称为变性。使DNA分子变性的温度称为解链温度，以Tm表示，不同DNA分子的解链温度有差别。在一定条件下，DNA的变性是可逆的，当温度下降后，分开的两条单链又可重新以氢键相连，恢复成双链DNA。DNA在细胞分裂前能够精确的自我复制，通过复制，将贮存在DNA分子中的遗传信息一代一代地传递下去。DNA复制的过程是DNA双链从一端开始，氢键逐渐裂开分成两条单链，然后以每条单链为模板，通过碱基配对逐渐复制出另一条新链，一个DNA分子最终复制成两个结构完全相同的DNA分子。二、DNA的复制微生物的遗传信息也是根据中心法则来传递的，包括复制、转录、翻译3个阶段，即DNA复制DNA，DNA转录为mRNA(信使RNA)，然后由mRNA翻译成特定的蛋白质(图5-2)。后来发现某些病毒的RNA可自我复制，并可作模板通过逆转录而合成DNA，这是对“中心法则”的补充和发展。遗传信息的传递有关概念：（1）基因（gene)：为一条多肽或RNA分子合成编码所需的完整的一段核酸序列。（2）基因组（genome)：一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称微生物遗传物质的存在（3）遗传型(基因型）：生物的全部遗传因子及基因组成。（4）表型（表现型）：具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。微生物遗传物质的存在微生物基因组结构的特点（1）病毒和噬菌体的基因组类型多样,有DNA、有RNA，有环状、线状等。（2）原核生物（细菌等）的基因组a.染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。b.基因组上遗传信息具有连续性c.功能相关的结构基因组成操纵子结构操纵子（operon）：功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。d.基因组的重复序列少而短（3）真核微生物（例啤酒酵母）的基因组a.典型的真核染色体结构（染色体由核小体组成）b.没有明显的操纵子结构啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中c.有间隔区（即非编码区）和内含子序列d.重复序列多③染色体外的遗传因子－质粒（plasmid）定义：质粒：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。转座因子/跳跃基因（transposableelement）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。微生物的基因突变

（一）基因突变的类型

基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型：

微生物的基因突变

1．形态突变型

是细胞形态结构或菌落发生变化的突变类型。如细菌的荚膜、鞭毛或芽孢的有无，菌落的大小、颜色及外形的光滑(s型)、粗糙(R型)等变异，真菌或放线菌产孢子的多少、外形及颜色变异等。微生物的基因突变

2．营养缺陷突变型是引起代谢过程中某种酶合成能力丧失的突变类型。这是一类重要的生化突变型，在科研和生产实践中有着重要的应用价值。此类突变型必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能正常生长繁殖。四、

微生物的基因突变

3．抗性突变型是一类能抵抗理化因素的突变类型。根据其抵抗对象的不同可分为抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等突变型。此类突变型十分常见，极易获得，在遗传学基本理论的研究中应用十分广泛，常作为选择性标记菌种。四、

微生物的基因突变

4．条件致死突变型是在某一条件下呈现致死效应，而在另一条仵下却不表现致死效应的突变型，如温度敏感突变型。四、

微生物的基因突变

5．抗原突变型是细胞成分，特别是细胞表面成分(如细胞壁、荚膜、鞭毛)的变异而引起抗原发生变化的突变型。6．其他突变型如糖发酵能力、毒力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突变型等。②基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变③前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其他多种因素④基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移，重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性2、基因突变的特点①特点（1）自发性与不对应性（2）稀有性突变率（3）可诱变性诱变剂（4）独立性（5）稳定可遗传性（6）可逆性——回复突变②突变的分子机制（1）亚硝酸（2）5-溴尿嘧啶（3）紫外线（光复活作用）（4）丫啶类染料（移码突变）③突变的影响（1）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；（2）对有害微生物进行控制；（3）危害人类自身的健康基因重组是指把一个个体细胞的遗传基因转移到另一个遗传性不同的个体细胞中，并使之发生遗传性变异的过程。通过基因重组可产生新的遗传型个体。五、微生物的基因重组（一）细菌的基因重组细菌不具备性系统，不能通过两性交配使两个细胞的全部遗传信息等量地传给子代，但细胞之间可以交换部分DNA而进行基因重组。提供DNA的细胞称为供体，获得DNA的细胞称为受体。细菌基因重组的形式有转化、转导、接合3种方式。五、微生物的基因重组1．接合接合是指通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触，而传递大段DNA的过程。2．转化转化是指受体细胞直接从外界吸收来自供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象。五、微生物的基因重组3．转导转导是通过温和噬菌体的媒介，把供体细胞中的DNA片段转移到受体细胞中，从而使后者获得了前者的部分遗传性状的现象。根据噬菌体和转导DNA产生途径的不同，可分为普遍性转导和局限性转导。普遍性转导是指噬菌体可转移供体细胞任何一部分DNA片断，而局限性转导是指噬菌体只能转移供体细胞特定的DNA片段。五、微生物的基因重组真菌的基因重组方式有有性生殖和准性生殖两种。1．有性生殖大多数真菌能进行有性生殖，产生各种有性孢子。真菌两个性细胞互相联结，通过质配、核配后形成双倍体的合子，合子进行减数分裂时，部分染色体可能发生交换而进行基因重组，由此而产生重组染色体并把遗传性状按一定的规律性传给后代。有性杂交在生产实践中较广泛用于优良品种的培育。（二）真菌的基因重组

2．准性生殖准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式。它可使同一种生物的两个不同来源的体细胞融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。准性生殖多发生于半知菌中。

（二）真菌的基因重组

RNA作为遗传物质普通的TMV与毒株霍氏车前花叶病毒（HR）的核酸和蛋白质的拆开和相互对换重建的过程，同样令人信服地证实了核酸是TMV的遗传物质基础。

生化提取分别获得含RNA的烟草花叶病毒蛋白质外壳（病毒1）和核酸（病毒2）抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1，而非病毒2杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质

烟草花叶病毒经弱碱、尿素、去垢剂等处理，可以将其蛋白外壳与RNA分开，重新将蛋白外壳与RNA混合，病毒粒子又会重建。

将普通的TMV外壳与毒株霍氏车前花叶病毒HR的RNA混合构成杂种病毒。

TMV抗体处理会使其钝化，不能引起病斑。

而用HR抗体处理，则不会影响杂种病毒的感染性，这说明杂种病毒的外壳确实是TMV病毒的外壳。

杂种病毒感染烟草后，在烟叶上出现HR的病斑，而且从中分离到具HR外壳的HR病毒，这表明是TMV的RNA、而不是蛋白质携带着病毒的所有遗传信息。烟草花叶病毒经弱碱、尿素、去垢剂等处理，可以将其蛋白外壳与RNA分开，重新将蛋白外壳与RNA混合，病毒粒子又会重建。

朊病毒的发现与思考亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrPc改变折叠状态为PrPsc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。朊病毒的发现与思考亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrPc改变折叠状态为PrPsc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。二、遗传物质在细胞中的存在方式

（一）细胞水平从细胞水平来看，细胞核；除此之外，在细胞质中存在着一些能自我复制的遗传物质，一般称这部分DNA为质粒。（二）亚细胞核水平真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内DNA与组蛋白结合在一起构成染色体。

（三）分子水平DNA（RNA）－－→在DNA大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段，即所谓基因－－→一个基因含若干核苷酸碱基组成的三联密。四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联密码43＝64个，用于决定组成蛋白质的20种氨基酸顺序。起始密码（AUG）和终止密码（UAA、UGA和UAG）。微生物的基因突变三、基因突变的机理

（一）诱发突变及其机理

1碱基对的置换⑴直接引起置换的诱变剂（亚硝酸类、烷化剂类）

⑵间接引起置换的诱变剂（碱基类似物）

2移码突变

3染色体畸变

一、基因突变的类型

基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型：（1）形态突变型。（2）条件致死突变型。（3）营养缺陷突变型。（4）抗性突变型。（5）抗原突变型。

（6）其他突变型。二、基因突变的特点

整个生物界，由于它们遗传变异的物质基础是相同的，因此显示在遗传变异的本质上都具有相同的规律，这在基因突变的水平上尤其突出。

（1）不对应性。

（2）自发性。

（3）稀有性。（4）独立性。（5）诱变性。（6）稳定性。（7）可逆性。一、基因突变的类型

基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型：（1）形态突变型。（2）条件致死突变型。（3）营养缺陷突变型。（4）抗性突变型。（5）抗原突变型。

（6）其他突变型。二、基因突变的特点

整个生物界，由于它们遗传变异的物质基础是相同的，因此显示在遗传变异的本质上都具有相同的规律，这在基因突变的水平上尤其突出。

（1）不对应性。

（2）自发性。

（3）稀有性。（4）独立性。（5）诱变性。（6）稳定性。（7）可逆性。三、基因突变的机理（一）诱发突变及其机理

1碱基对的置换⑴直接引起置换的诱变剂（亚硝酸类、烷化剂类）

⑵间接引起置换的诱变剂（碱基类似物）

2移码突变

3染色体畸变

一、基因突变的类型

基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型：（1）形态突变型。（2）条件致死突变型。（3）营养缺陷突变型。（4）抗性突变型。（5）抗原突变型。

（6）其他突变型。二、基因突变的特点

整个生物界，由于它们遗传变异的物质基础是相同的，因此显示在遗传变异的本质上都具有相同的规律，这在基因突变的水平上尤其突出。

（1）不对应性。

（2）自发性。

（3）稀有性。（4）独立性。（5）诱变性。（6）稳定性。（7）可逆性。三、基因突变的机理（一）诱发突变及其机理

1碱基对的置换⑴直接引起置换的诱变剂（亚硝酸类、烷化剂类）

⑵间接引起置换的诱变剂（碱基类似物）

2移码突变

3染色体畸变（二）自发突变的机制

1

背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应

2

微生物自身代谢产物的诱变效应

3

互变异构效应

4

环状突出效应碱基对的置换碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换

A：TT：A

AT

C：GG：C

CG

双链DNA\

单链DNA

（实线代表转换，虚线代表颠换）直接引起置换的诱变剂

H:C

↗

H:C-→G:C

↗

H:C→G:C↗A:T→H:T-----→A:T亚硝酸类引起的碱基对置换

O:A

T:A（颠换）

O:C

G:C（复原）

G:CRG:CO:C

O:T

A:T（转换）

O:G

C:G（颠换）染色体畸变染色体畸变是指由诱变剂引起DNA分子的大损伤，它包括染色体结构上的缺失、重复、易位及倒位等。紫外线、X射线、γ射线等射线及亚硝酸、烷化剂等均能引起染色体畸变，尤其是紫外线能引起DNA分子多处较大的损伤。紫外线主要通过在同链DNA相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的胸腺嘧啶二聚体，微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的DNA，主要方式有两种：

（1）光复活作用。

由于微生物中一般都存在着光复合作用，因此，用紫外线照射菌液时都须在红光下进行操作处理微生物，而后在暗室或用黑布包起来培养。

（2）暗修复作用。也称切除修复作用。

X射线和

射线为电离辐射，含有很高的能量，能产生电离作用，因而能直接或间接地改变DNA结构。直接的效应是碱基的化学键，脱氧核糖的化学键和糖—酸相连接的化学键断裂；

微生物的基因重组

基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。

重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。一、原核微生物的基因重组（一）转化（transtormation）转化过程大致是这样的：①

从供体菌提取出转化因子双链DNA片段；②

双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合；③

在结合位点上，双链DNA中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。④进入受体细胞的DNA单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的DNA单链所取代，于是形成了杂种DNA区段；⑤受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。

受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的DNA片段称为转化因子。

只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。

一、原核微生物的基因重组（二）转导（transduction）

通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中DNA片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。

1．普遍性转导由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为105～108。

2．局限性转导由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA可能与噬菌体DNA发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为10-6。一、原核微生物的基因重组（四）溶源性转变

通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程，称为接合（有时也称杂交）。

在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在F因子所决定。

F因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为5×107

道尔顿；雌性细菌不含F因子，称为F-

菌株，雄性细菌含有游离存在的F因子，称为F+

菌株，当雄性细菌细胞中所含的F因子被整合在细胞核的DNA上，不呈游离状态存在称为Hfr菌株（高频重组菌株）；有时被整合在细胞核DNA上的F因子，从DNA上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，F因子有时能带一小段细胞核DNA。我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核DNA的F因子的细菌称为F′菌株。

接合的基本过程滚环复制模型接合的结果：

F++F-2F+

F′+F-2F′Hfr+F-多种情况

Hfr+F-Hfr＋F-（多数情况下）

Hfr+F-Hfr＋Hfr（少数情况下）

一、原核微生物的基因重组（三）接合（conjugation）宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体DNA整合到核DNA后，导致宿主菌某些新的遗传性状表达，即所谓溶源性转变。这是一种与转导相似但又有本质不同的现象。溶源转变与转导在本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带有任何供体菌的基因，其次这种噬菌体是正常的完整的，而不是异常情况下产生的缺陷型噬菌体。溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒状杆菌（Lorynebatceriumdiphthariac）菌株被噬菌体侵染而发生溶源化时，会变成产毒素的致病菌株。其他如沙门氏菌、红霉菌、链霉菌等也具有溶源转变的能力。二、真核微生物的基因重组（一）有性杂交

在微生物的有性繁殖过程中，不同的性细胞间的接合，并随之发生染色体的重组，从而产生新遗传型后代的现象，称有性杂交。凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育。例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的两个不同菌株，面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生CO2

多，生长快；而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱，所以酿酒厂生产酒精后的酵母，不能供面包厂作引子用。通过两者的杂交，就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。二、真核微生物的基因重组（二）准性生殖准性生殖是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式。是由两个非异配型核的细胞接合后，形成异核体细胞，两核能发生低频率的接合与交换，产生具有新性状的个体。其主要过程包括以下基本过程：

1．菌丝联结发生在一些形态上没有区别的，但在遗传性状上可以有差别的两个同种亲本的体细胞（单倍体）间。

2．形成异核体两个单倍体细胞经联结后，使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中，形成双相的异核体。异核体能够独立生活。

3．核融合在异核体中的双核融合，产生双倍体杂合子核。核融合后产生杂合子核的频率也是极低的，如构巢曲霉和米曲霉为10-5～10-7

。

4．体细胞重组和单倍体化双倍体的杂合子极不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核中的染色体会发生染色体交换和单倍体化，从而形成了极个别的具有新遗传性状的单倍体杂合子。插入突变导致基因的功能丧失，发生突变产生染色体畸变由于复制性转座是转座子一个拷贝的转座，因而处在同一染色体的不同位置的两个拷贝之间发生同源重组，导致DNA缺失或倒位。基因移动和重排生物进化上的重要意义一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变基因突变：基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。基因突变DNA损伤修复机制突变前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。自发突变诱变突变环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9。某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变方式可诱发性：诱变剂可提高突变率,一般可以将突变率提高10

105倍。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forwardmutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（backmutation或 reversemutation）。突变机制突变现象

指突变的菌体发生形态可见的变化。如细胞大小、形状、鞭毛、纤毛、孢子、芽孢、荚膜，以及群体形态结构（菌落和噬菌斑等）的改变。形态突变型生化突变型菌体原有特定的生化功能发生改变或丧失但在形态上不一定有可见的变化，生化方法可以检测到生化突变对于发酵工业生产具有重大意义。营养缺陷型的突变菌株、结构类似物的抗性菌株等。

致死突变型突变造成菌体死亡或生活能力下降条件致死突变型

突变后的菌体在某些条件下，可以生存，但在另一些条件下则发生死亡。温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型。诱发因素主要可以分为:细胞外因素细胞内因素DNA分子内部因素诱发因素细胞外的诱发因素

自然环境或人工条件下的物理和化学因素

物理：自然或人造的紫外线、γ射线、X射线、快中子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因素。化学：自然人造的化学诱变因素有低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的H2O2、碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。细胞内的诱发因素

生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。DNA分子内部因素DNA分子中的碱基存在着互变异构效应碱基的互变异构效应

四种碱基的第6位是酮基（T，G）或氨基（A，C）碱基T和G能够以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现碱基C和A能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，故A:T和C

G碱基配对

互变异构效应引起的不正常的碱基配对碱基T以稀有的烯醇式形式，新合成链中T对应的不再是A，而是G碱基C以稀有的亚氨基形式出现，在DNA复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是G，而是A，突变的类型染色体数目的变化

染色体数目变化都可能引起生物表型的变化。原核微生物只有一条DNA，若从外源获得一段DNA，且与细胞的部分DNA同源，则称为部分双倍体。与染色体结构变化同属于染色体畸变

染色体结构的变化

这是一种大段DNA变化（损伤）现象，它包括染色体缺失(deletion)、插入（insertion）、重复(duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)，缺失重复倒位易位染色体局部座位内的变化

即基因突变(genemutation)，因为突变只发生在一个基因座位内，所以，又称点突变(pointmutation)。基因突变可分为碱基置换（substitution）、移码突变(frame-shiftmutation)、缺失(deletion)和插入(insertion)四种形式。

基因突变与染色体畸变的区别在于基因突变仅仅是DNA链中一对或少数几对碱基发生了变化。碱基置换

嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘧啶（或嘌呤）碱基则称为转换（transition）

原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘌呤（或嘧啶）碱基则称为颠换(transversion)

错义突变：使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上，变成另一种氨基酸；无义突变：正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成UAG（琥珀突变）、UAA（赫石突变）或UGA（乳石突变）等终止密码子，造成多肽链合成的中止；同义突变：碱基发生了置换，但由于遗传密码子的简并性，而并没有影响原来的氨基酸顺序。如密码子GCU置换成GCC后，它们都是丙氨酸的密码子；沉默突变：碱基置换造成多肽链中一个氨基酸的改变，但该氨基酸对蛋白质的结构和功能没有多大的影响，并没引起细胞表型变化。突变结果移码突变

一对或少数几对邻接的核苷酸的增加或减少，将造成这一位置以后一系列密码子发生移位错误的现象

如果增加或减少的核苷酸数目为3或3的倍数，那么，它只改变某一部位的一个或几个氨基酸，其它氨基酸未变，有可能保持原有的蛋白质性质，这取决于这些氨基酸在蛋白质中的重要性。如果增加或减少的核苷酸数目不是3或3的倍数，那么，这会改变整个蛋白质的氨基酸顺序，其影响可能很大。缺失或插入

与移码突变只是程度不同，基因突变中的缺失或插入涉及到的核苷酸数量比移码突变多，很难用移码突变来回复。但与染色体畸变中的缺失或插入相比，它们所变化的范围要小得多。常见的微生物突变类型营养缺陷型（auxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。表型基因型营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段表型判断的标准：在基本培养基上能否生长在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记突变株不能通过选择平板直接获得营养缺陷型（auxotroph）特点：表现型：基因型：营养缺陷型的表示方法：表现型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）基因型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。抗药性突变型（resistantmutant）基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。特点：正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性条件致死突变型（conditionallethalmutant）

在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低（如25-30℃）下得到这种突变。特点：负选择标记这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因特点：形态突变型（morphologicalmutant）造成形态改变的突变型特点：非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。举例：产蛋白酶缺陷突变株的筛选菌落颜色变化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。形成芽孢缺陷菌株细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。其它突变类型毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。诱变剂与致癌物质——Ames试验a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；c）危害人类自身的健康b）对有害微生物进行控制；很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比

超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用Ames试验微生物菌种选育实训项目一微生物纯种分离技术一、实训要求1.能完成培养基的配制和筛选的前期工作。2.能够熟练进行取样、菌液配制和采用划线分离和稀释法分离法分离菌种。3.能够熟练筛选菌种和分析结果。二、实训原理将经过反复稀释的菌液，移接于固体培养基上培养后，可在平板上获得彼此分离的单菌落，从中选取出所需要的菌落，进行接种培养后就可获得纯种。三、实训材料

1.试剂

培养基。2．待试样本

新采集的田园土。3．器材

小锅、天平、电炉、漏斗、试管、培养皿、灭菌锅、报纸1ml移液管、超净台、三角瓶、三角土铲、无菌小刀、无菌取样袋、玻璃珠、培养箱、涂布器、接种环、酒精灯、纱布、棉花、橡皮筋。四、实训内容与步骤（一）培养基制作和筛选前期工作称量药品溶化药品定容调pH过滤分装加塞包扎灭菌制备培养基流程1、细菌培养基：营养琼脂17.5g，水500ml,放入三角瓶。2.包扎培养皿12套、移液管10支，同时准备取样袋、小刀、玻璃珠，灭菌备用。3.0.85%的生理盐水：取生理盐水90ml分装于100ml的三角瓶中，共1瓶；同时制备10支9ml试管生理盐水备用。培养基灭菌流程划线分离法稀释分离法⑴混菌法：1ml菌液＋15ml培养基：混匀培养⑵涂抹法：0.1ml菌液，无菌刮铲涂匀后培养四、实验内容2.平板混合分离法：

将土壤悬液分离样品摇匀，用无菌移液管取1ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15ml，摇匀，凝固，制成平板。

混合倒平板操作法示意图四、实验内容1.土壤稀释液的制备四、实验内容

平板划线分离操作法示意图

平板划线菌落分离效果图4.平板涂布分离法(3皿)：将0.1ml土壤稀释液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。

涂布平板操作法示意图四、实验内容5.生物的培养技术：培养箱恒温培养法

细菌于37℃恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。霉菌和酵母菌于32℃恒温培养箱培养2-3d，平板倒置培养。1、观察记录实验结果：微生物的菌落特征

注:菌落特征描写方法参考如下：大小：大，中,小,针尖状形态：圆形，不规则等干湿情况：干燥，湿润，粘稠高度：扁平，隆起，凹下透明度：透明度，半透明，不透明颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等边缘：整齐，不整齐取培养24h的平板，挑选待选菌种，进行斜面接种保存，同时进行镜检观察，分析结果，并进行下一步方案设计。菌种筛选及结果分析一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤采样

增殖培养

纯种分离纯培养生产性能测定方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1．稀释分离法2．平板划线分离法

⑴

涂菌：

⑵

划线分离：①分步划线法；②一次划线法：

3．组织分离法

测定代谢产物或其它目的性状平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造成机械损伤平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。

分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）（一）诱变育种的一般步骤和方法

出发菌株

同步培养

使菌细胞处于相同或接近的生理状态

单细胞（或单孢子）菌悬液的制备

单细胞或单孢子的意义

酵母或霉菌孢子106/ml、细菌108/ml

诱变剂的选择及其剂量的确定

以致死率为90％～99％为宜

诱变处理

①物理诱变剂

②化学诱变剂

确定出发菌株

↓菌种的纯化选优

↓←出发菌株的性能鉴定同步培养

↓制备单细胞（或单孢子）悬液

↓←活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验

↓诱变处理

↓平板分离

↓计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养

↓突变体的初步筛选

↓←用简单快捷的方法重复筛选

↓←摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）二、微生物的诱变育种（二）变异菌株的初步筛选

纸片培养显色法

透明圈法琼脂块培养法

1筛选用培养基⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用

（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用

2．营养缺陷型菌株筛选的一般方法（1）诱变剂处理（2）淘汰野生型菌株①抗生素法②菌丝过滤法（3）检出营养缺陷型（4）鉴定营养缺陷型检出营养缺陷型①夹层培养法

②限量补充培养法

③影印接种法

④

逐个检出法

鉴定营养缺陷型

①含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。②营养缺陷型营养类别的鉴定。③缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。

20种氨基酸的排列编组

第一组第二组第三组第四组第五组第六组第七组第八组第九组丙氨酸谷氨酸亮氨酸丝氨酸精氨酸谷氨酰氨赖氨酸苏氨酸天冬酰氨甘氨酸蛋氨酸色氨酸天冬氨酸组氨酸苯丙氨酸酪氨酸半胱氨酸异亮氨酸脯氨酸

缬氨酸原生质体融合育种

细胞（A+B—）

细胞（A—B+）

脱壁处理

脱壁处理

原生质体（A+B—）

原生质体（A—B+）

混合

加融合剂

原生质体融合

涂平板（原生质体再生）

形成菌落

检出重组子菌落（A+B+）基因工程

噬菌体感染实验(杂交)植物病毒重组实验回本章目录5-3微生物菌种的退化、复壮和保藏实训项目二

菌种保藏一、实训要求1．能叙述菌种保藏的原理、菌种保藏的方法。2．能熟练进行保藏菌种的操作技术。

二、实训原理根据微生物生理生化特性人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而达到延长保藏时间的目的。同时要保持菌种原有优良性状不变。三、实训材料

准备保藏的细菌、放线菌、真菌等菌种；干燥器、真空泵、10×70mm试管、吸管、60目和100目筛子、磁铁、喷灯等；氯化钙、10%盐酸、石蜡油、固体石蜡等。四、实训内容与步聚1、斜面冰箱保藏

将生长丰满的斜面菌种，存放于4℃左右的冰箱中。温度不宜太低，否则斜面培养基结冰脱水，加速菌种死亡或退化。冰箱中保藏的菌种，细菌隔二个月，放线菌隔三个月，芽孢、酵母和霉菌隔3～6个月，需重新转管培养一次。2、石蜡油保藏

取石蜡油装于三角瓶中加棉塞并包纸，另将10ml吸管若干支也包装好，1kg/cm2压力下灭菌1小时。然后将灭菌石蜡油105～110℃烘箱内干燥1小时，使其中的水分蒸发掉。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3天，证明无杂菌生长方可使用。而后用无菌吸管吸取注入待保藏的斜面菌种内，油面应高出斜面顶端1～1.5cm，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。使用时，直接从石蜡油中挑取菌体，移接到斜面培养基上进行活化培养。此法可保藏各类微生物，保藏时间在一年以上。在低温下，保藏时间还可延长。3、沙土管保藏

此法适用于保藏细菌的芽孢，放线菌和霉菌的孢子，保藏时间1～3年。不宜保藏营养体。具体做法：(1)取细砂，过60目筛。另取生土过100目筛。分别用10%盐酸浸泡2～4小时，再用水冲洗至流水的pH达到中性，然后烘干或晒干。（2）将沙与土以4:1或2：1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装试管，每管约2g，塞棉塞，包纸灭菌（1.5kg/cm21小时），再干热灭菌1～2次。抽样检验，确无杂菌后使用。（3）将已形成芽孢的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3～5ml，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取滴入砂土管中，以浸透砂土为止。（4）将砂土管放入盛有干燥剂氯化钙或五氧化二磷的干燥器或大试管中（能用0.5马力的真空泵抽气数小时更好），以使砂土管迅速干燥。（5）制备好的砂土管用石蜡封口，或用喷灯烧熔试管棉塞下边的玻璃密封。上述三种保藏方法，以斜面冰箱保藏法简单，但保藏的时间短，且由于移接次数多而易变异和退化。石蜡油保藏法，既可防止培养基水分蒸发，又能隔绝空气而使代谢性能降低，但存放时要求直立。砂土管保藏法不需加入培养基，保存菌种，不易退化，是当前应用最广的方法。菌种的衰退与复壮的概念(1).衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。；菌种的衰退、复壮及保藏衰退的原因：①基因突变，②分离现象。常见的衰退