融合基因检测的最终解决方案-Nanopore Direct RNA Sequencing解锁融合基因检测新范式

融合基因检测的最终解决方案——NanoporeDirectRNASequencing解锁融合基因检测新范式一、引言在精准医疗的加速推动下，融合基因正成为连接基础研究与临床应用的桥梁。作为多种恶性肿瘤的关键驱动因素，融合基因不仅揭示着细胞命运被改写的分子起点，也深刻影响着疾病的诊断分型、预后评估乃至靶向治疗的选择。越来越多的研究和指南表明，融合基因已从科学概念走向了临床决策的中心。然而，识别它们，远不如命名它们那么简单。我们是否曾被令人困惑的检测结果阻滞判断？是否曾因一个结构不清、异构体不明的融合转录本而在功能研究中裹足不前？在现有检测技术的边界内，我们往往只能“猜测”融合，而无法“看清”融合。这正是当前融合基因检测领域的最大困境——不是没有数据，而是缺乏结构的真相。NanoporeDirectRNAsequencing（DRS），以其原始读段跨越融合位点、捕获完整转录本结构的能力，为融合基因的精准解析提供了前所未有的解决方案。它不仅让融合“被看见”，更让结构“可验证”，是融合基因研究迈入“全景化”和“真实可读”时代的重要起点。二、融合难见真容：传统检测手段的局限与盲区融合基因，作为两段原本不相邻的基因序列融合而成的产物，在癌症的发生发展、诊断、治疗指导和预后判断中扮演着至关重要的角色。它们的出现往往伴随着细胞功能的异常，可能驱动肿瘤生长，或赋予癌细胞对特定治疗药物的敏感性或耐药性。因此，精准地检测和解析融合基因，对于推动癌症研究和实现个体化精准医疗具有举足轻重的作用。然而，尽管融合基因的重要性不言而喻，但其检测之路却荆棘密布，现有的主流检测技术在面对复杂多变的融合基因时，普遍暴露出诸多痛点与“盲区”：短读长测序的拼接难题：信息碎片化带来的高风险目前，以二代测序（NGS）为代表的短读长测序技术是融合基因检测的常用手段。但顾名思义，这些技术生成的序列片段通常较短。当融合位点恰好位于短读长的末端或需要跨越较长的内含子区域时，就如同将一幅巨大的拼图拆解成无数微小的碎片，难以准确地将融合位点两侧的序列拼接起来。这种信息碎片化极易导致：高假阳性风险：由于拼接算法的复杂性和序列重复区域的存在，可能出现“拼接错误”，将原本不融合的序列误判为融合基因，从而误导后续的临床决策或研究方向。高假阴性风险：对于表达量较低的融合基因、含有复杂结构（如大片段插入或缺失）的融合转录本，或融合位点位于测序盲区的，短读长测序可能因覆盖不足或无法有效拼接而“漏检”，使患者错失潜在的靶向治疗机会。无法捕获完整转录本信息：“管中窥豹”的局限性传统检测方法往往只能聚焦于融合基因的断裂点或融合点，而无法提供融合转录本的完整外显子构成、剪接异构体信息，甚至无法区分同一基因融合点的不同剪接形式。这种“管中窥豹”式的检测，使得我们难以全面理解融合基因的：真实结构：仅仅知道融合点不足以描绘融合基因的全貌，其上下游外显子的排列、是否存在可变剪接等细节都对融合蛋白的功能产生关键影响。生物学功能：缺乏完整的转录本信息，就难以准确推断融合基因的实际功能，阻碍了对致病机制的深入探索。潜在治疗靶点：融合转录本的完整结构信息对于设计特异性靶向药物、评估药物敏感性至关重要。其他方法的瓶颈：特异性与通量的双重挑战除了短读长测序的固有缺陷，其他一些常用检测方法也存在各自的局限性：RT-PCR和FISH：这些方法需要预设探针，意味着它们只能检测已知的融合类型，对于发现未知或罕见融合基因则无能为力。此外，它们的通量相对较低，难以实现高效率、全景式的融合基因筛查。文库制备偏差：大部分基于RNA的测序方法都涉及到逆转录和PCR扩增步骤。这些步骤可能引入序列偏好性或扩增偏差，导致对原始RNA分子丰度的不准确评估，进一步影响融合基因的检出和定量。面对这些挑战，现有的融合基因检测技术急需一次革新，能够真正实现对融合转录本的精准、全面、无偏倚解析。三、“长读长，真融合”：DRS打开全景式结构识别通道融合基因检测之所以难，并不仅仅是因为它们稀有或结构复杂，而是因为我们缺少一种可以在单分子水平读取完整融合转录本结构的技术。简称DRS以其天然长读长、无需逆转录和扩增的测序方式，为破解这一难题提供了全新思路。与传统方法需要重建拼接转录本不同，DRS直接读取RNA分子的原始序列，通过单条读段横跨融合位点，不依赖拼接算法和预设假设，从而在结构还原的完整性和准确性上，具有无法比拟的优势。原始长读段直接跨越融合位点：还原真实结构的关键DRS技术的核心优势在于其“全分子读取”能力。一条reads即为一条天然poly(A)+RNA（即带有多腺苷酸尾的成熟mRNA）的原始序列，读长可达数千碱基，可以完整跨越融合位点及其上下游多个外显子区域。这种“所见即所得”的数据模式，使融合基因的识别不再依赖间接推断，而是直接观察。与短读长技术相比，DRS在以下几个方面实现了本质性突破：消除拼接误差：传统短读长依赖拼接算法将断裂的reads重构成融合结构，常因重复序列、低质量拼接点或算法假设不足而产生假阳性。而DRS以物理连续的方式读取整个融合转录本，天然避免拼接错误。保留上下游结构信息：不仅能够定位融合点，还能捕获其前后完整的外显子组成和剪接变异，如是否存在外显子跳跃、内含子保留、非典型连接等，提供结构层面的全景视图。支持复杂融合识别：对于涉及大段插入、缺失、反向连接甚至非编码区域的复杂融合结构，DRS同样具备强大的解析能力，显著提升对非典型、复杂或新型融合的发现概率。异构体解析能力：从“是否融合”到“融合了什么”融合基因往往不仅有一个版本。由于剪接调控的多样性，一个融合事件可能产生多个异构体（isoforms），不同异构体间的功能差异可能非常显著，甚至决定其是否具有致癌活性或是否构成药物靶点。传统方法由于读长受限，难以区分这些异构体，常常只报告融合事件本身，无法进一步解析其结构构成。而DRS可在单分子水平上直接读取每一个融合转录本的完整剪接形式：是否包含两个基因的启动外显子？是否发生了外显子跳跃或插入？是否包含3′UTR差异或poly(A)尾变化？这一能力使DRS不仅能回答“是否发生融合”，还能进一步解答“融合了什么、怎么融合、融合后表达的是什么”，为融合功能研究与靶向开发提供关键基础。面向低丰度与复杂背景样本：保持高捕获率与低偏倚在真实样本中，许多具有潜在临床意义的融合基因表达量极低，或只在特定细胞群体中表达。短读长测序往往因覆盖深度不足而漏检，或因算法过滤机制而被自动舍弃。DRS天然具备以下优势：单分子信号：即使只存在极少数融合转录本，只要被测到，就能以一条reads完整保留；无需扩增：避免了低表达转录本在PCR步骤中被稀释或扩增偏倚的风险；原始丰度保留：由于没有逆转录和PCR扩增过程，DRS所观测的表达量更接近真实生物学状态，有利于进行准确的融合定量分析。此外，DRS还保留了每条RNA分子的天然修饰状态与poly(A)尾信息，为下游的功能研究和稳定性判断提供了更多维度的数据支持。从测序到机制推断：开启融合研究新路径融合基因的功能不仅取决于其结构是否存在，更取决于其剪接形式、翻译能力、修饰状态及表达丰度等多种因素。而这些变量，正是传统方法无法全面揭示的。DRS的出现，为我们提供了一种一站式融合检测与机制推断平台：检出融合事件；分辨异构体结构；评估其表达活跃度；揭示修饰与稳定性变化。这种从“看见结构”到“理解功能”的跨越，正是融合基因研究迈向精准与转化的关键一步。四、实锤在手：来自前沿研究与真实数据的验证4.1构建完整融合转录本：DirectRNA测序超越短读长的核心优势短读长RNA测序在融合基因检测中具有覆盖广、高通量的优势，然而其最大限制在于无法重构融合转录本的完整结构，仅能提供融合断点的信息，难以解析融合事件的剪接异构体。相比之下，NanoporeDirectRNA测序凭借其长读长、无扩增、单分子测序的特性，能够跨越整个融合区间，直接描绘融合基因的全貌。在2025年发表于NatureMethods的项目研究中[1]，研究团队对包括乳腺癌MCF7在内的7个人类细胞系，使用NanoporeDirectRNA测序开展系统性评估。在融合基因识别方面，研究者共识别出106个融合基因，其中79个为已知事件或在短读长数据中也有发现。为了验证检测的准确性，他们选取了MCF7细胞中的12个融合基因，利用PCR方法进行验证，全部获得成功验证，证明DRS在融合事件识别方面具有高度的可信度。更具意义的是，该研究强调DRS不仅可以发现融合事件，还能够重构完整的融合转录本。在每个融合基因中，DRS平均检测到了两个由full-splice-matchreads支持的异构体，这些读段完整覆盖了融合转录本的所有外显子边界。这一能力使研究者得以揭示出融合基因上下游结构的多样性，为理解其功能调控和蛋白翻译潜力提供了坚实基础。而这些结构复杂性，在短读长RNA测序中则往往因拼接不完整或reads不连续而被遗漏。此外，DRS数据中也检测到了融合事件两侧的野生型（未融合）5′和3′基因的完整转录本，意味着在一次测序中，研究者便能同时获取融合与非融合状态的全长表达信息。这种“一步到位”的数据获取方式，不仅提高了研究效率，也为转录本水平的融合表达定量和功能推断提供了前所未有的便利。综上所述，这项研究充分展示了NanoporeDirectRNA测序在融合结构重构能力方面相较短读长测序的显著优势。这种能力使得融合基因的检测从“是否存在”提升到了“结构全貌+表达异构体+功能推断”的新层次，为精准医疗中的融合基因分析打开了全新窗口。图1长读RNA序列数据检测到的融合基因热图4.2融合事件的动态表达：DirectRNA测序同时提供结构与定量信息DirectRNA测序不仅具备构建融合基因完整结构的能力，更可在原始长读段的基础上提供每条融合转录本的真实表达量，为融合事件的动态调控研究打开了新的窗口。在一项发表于NucleicAcidsResearch的研究中，Schiksnis等人应用NanoporeDirectRNA测序技术，系统分析了秀丽隐杆线虫在衰老过程中的转录组变化，成功识别出多个具有明确表达量的融合转录本，并通过RT-PCR和Sanger测序进行验证[2]。研究者利用了LongGF工具，在衰老过程的多个时间点筛查融合事件，识别出一批表达量随时间变化而波动的融合转录本，包括来自不同染色体（II与IV）的C18H9.6与clec-173的跨染色体融合。通过时间序列分析，研究者发现这些融合事件具有明确的表达趋势，提示其可能参与衰老过程中的基因调控机制。这一研究展示了DirectRNA-seq在融合基因检测中的一个独特能力：不仅能发现融合，还能“看到”融合的表达动态。相比依赖拼接组装的短读长技术，DRS在不牺牲结构完整性的前提下，直接提供融合异构体的表达量信息，为探索融合事件的调控逻辑和生物学功能提供了更具信度的支持。图2DRS检测融合基因表达量随时间变化4.3超越边界，拓展认知：DRS赋能新型融合基因发现传统短读长测序在融合基因检测中，往往受限于对已知基因边界的依赖，难以有效发现与重复序列或转座元件相关的复杂融合事件，而这些正是基因组变异和疾病机制中不可忽视的一部分。DirectRNA测序凭借其无偏倚的长读长特性，展现了在发现新型和非典型融合转录本方面的卓越能力，极大地拓展了融合基因研究的边界。在2021年发表于《HumanMolecularGenetics》的研究中[3]，研究团队通过NanoporeDRS，深入分析了DUX4基因活化的人肌细胞转录组。值得注意的是，该研究专门关注了与LTR反转录转座子（LTRretrotransposons）相关的融合转录本，这类融合因其重复序列的特性，是短读长测序的传统“盲区”和分析难点。DRS的数据清晰地揭示了DUX4基因与附近LTR元件（如HERV-K、LITR18A）形成的新型融合转录本。这些融合不仅包括DUX4与LTR元件的直接融合，还捕获了这些融合转录本的多样化剪接异构体。例如，研究者发现DUX4与多个不同的LTR元件（如LTR69A、LTR79等）都可以形成融合，并且这些融合转录本内部存在复杂的选择性剪接事件，导致DUX4的不同外显子被纳入到融合产物中，产生多种可能的功能性变体。这项研究充分证明，DirectRNA测序能够：突破重复序列障碍：传统短读长测序在重复序列区域的精确比对和拼接面临巨大挑战，而DRS的超长读长能够完整跨越这些重复序列区域，清晰地识别出与反转录转座子等重复元件相关的融合事件，避免了因重复序列导致的错误比对和漏检。发现非典型融合模式：DRS不依赖于预设的基因边界，使其能够发现任何两个转录片段之间的融合，包括基因与基因间区域、重复序列或非编码RNA之间的融合，从而揭示了基因组内更为广泛和复杂的转录重排事件。解析新型剪接异构体：DRS不仅能发现全新的融合位点，还能进一步解析这些新型融合转录本内部的复杂剪接模式，为理解其潜在功能和生物学意义提供了宝贵线索。这项前沿研究强有力地证明，NanoporeDirectRNA测序不仅仅是已知融合基因检测的优化工具，更是发现未知、解析复杂新型融合转录本的强大利器。它为我们打开了探索基因组“暗物质”中融合事件的全新窗口，对于理解疾病机制、发现新型生物标志物和治疗靶点具有深远意义。图3DRS发现新融合基因示例4.4复杂结构融合基因的识别能力：DRS揭示跨越多个基因的融合转录本在基因组的复杂世界里，融合事件并非总是简单的两基因拼接。一些更为复杂的融合转录本可能横跨多个不连续的基因座，形成传统短读长测序难以触及的“多基因串联融合”或“跳跃式融合”。这种复杂性常常导致现有技术陷入盲区，遗漏大量具有潜在生物学或临床意义的变异。然而，NanoporeDirectRNA测序凭借其无与伦比的长读长优势，展现了精准识别并完整解析这类跨越多个基因、结构极其复杂的融合转录本的强大能力。在2020年发表于《NucleicAcidsResearch》的一项开创性研究中[4]，研究团队利用DRS深入探索了转录组的复杂性。该研究明确指出，Nanopore读长成功识别并鉴别出了多种此前未被传统方法完整捕获的复杂融合转录本。这些发现强有力地证明了DRS在解析非典型、跨基因融合事件方面的突破性能力。具体而言，该研究揭示了如下令人瞩目的复杂融合模式：多源融合转录本：发现了源自两个离散基因座的多个融合转录本。这意味着DRS能够清晰地捕捉到不止是简单的A-B融合，而是诸如A-C、B-D等多种排列组合，揭示了融合事件的高度复杂性。单条读长贯穿多基因：研究者甚至观察到，一条单一的Nanopore读长，能够完整覆盖四个基因位点组成的转录本。此外，还有读长同时覆盖了两个远端多外显子基因以及七个单外显子基因的惊人案例。这些实例直观地展示了DRS如何凭借其超长读长，突破了传统技术对线性结构和单一基因区域的依赖，能够一次性、完整地捕获并重建这些由染色体复杂重排导致的、跨度巨大且结构异常的新型融合转录本。其他复杂模式：研究还进一步发现了覆盖两个重叠基因且剪接模式一致的融合转录本，以及覆盖两个相邻基因的反义转录本，还有不同剪接模式覆盖两个近端基因部分区域的转录本。所有这些复杂转录本的存在均通过RT-PCR方法得到了验证，再次强调了DRS数据的高可信度。这项前沿研究不仅弥补了传统测序在复杂融合事件识别上的空白，更深刻地改变了我们对转录组复杂性的认知。它清晰地表明，NanoporeDRS是精准解析和发现跨基因、结构高度复杂的融合转录本的终极利器，为深入理解疾病机制、挖掘新型生物标志物及指导精准医疗实践提供了前所未有的视角和关键数据。图4DRS识别的复杂结构融合基因4.5融合转录本不只是“结构存在”，还能翻译成蛋白发挥功能在对腺病毒Ad5感染A549细胞转录组进行DirectRNA测序研究时[5]，研究者不仅发现了多达35个新的融合转录本，还首次通过质谱验证了部分融合mRNA能够被翻译为功能性融合蛋白。研究团队在原始DRS数据中筛选出包含多个剪接异构体的新RNA分子，其中部分融合转录本跨越了经典基因结构边界，形成截断融合ORF或新型融合ORF。例如其中一个融合蛋白由E4orf6的N端与下游DNA-bindingprotein部分融合形成一个稳定表达的新蛋白，命名为E4orf6/DBP。在蛋白质层面，WesternBlot和Massspectrometry数据均确认该融合蛋白表达。更值得关注的是功能实验表明，敲除该融合蛋白后，病毒复制中心的形态发生显著异常，病毒传播能力也显著下降。这意味着并非所有DRS检出的融合transcripts都是转录噪声，而极有可能具备真实的功能生物学意义。这一发现具有三层重要意义：DRS不再是“只看结构”的工具，它还能引导我们挖掘出真正“被翻译”的融合蛋白；融合转录本的功能研究将得到极大推动，DRS可结合质谱进行多组学验证；从“转录融合”到“蛋白功能”路径已被实证，为将来精准医疗或病毒研究中融合靶点开发提供坚实依据。这一案例展示了DirectRNA-seq在融合研究中的一个非常高阶应用路径：不仅重构融合结构，揭示异构体，还能定位蛋白产物，证明其具有真实功能。相比短读长只关注转录层面，这种“转录——翻译——功能”的闭环分析，是融合基因研究的终极追求。图5DRS鉴定的融合基因表达出功能蛋白4.6融合结构即异构体验证：DirectRNA-seq捕捉转录本加工前的真实形态传统意义上的“融合转录本”常被看作两个原本独立基因因重排、转录错误或病毒感染等因素而生成的异常连接。然而，DRS所呈现出的融合现象远比预想更丰富，其中相当一部分融合结构实则反映了细胞内天然转录异构体的加工中间态。在2020年发表在GenomeResearch,2020的研究中，作者使用NanoporeDRS对秀丽隐杆线虫（C.elegans）多个发育阶段的转录组进行了系统性测序。研究团队在全长reads中观察到一类“融合基因”型异构体，即单条转录本覆盖两个本应独立存在的成熟转录本。通过系统分析，他们发现这类reads中将近一半属于已知的操纵子（operon）成员，即多个基因天然共转录而非真正“融合”。这些reads通常捕获的是转录本尚未被剪接分割之前的状态，因此可视为对已知operon结构的直接验证[6]。更进一步，研究者指出，另一半结构虽不归入已知operon，但很可能代表尚未注释的新型操纵子，或是尚未完全加工完成的天然中间产物。这提示我们，在标准注释之外，细胞仍存在大量复杂、多样的异构体形式，而DRS提供了首次可读、可证实的直接数据支持。与传统短读长依赖拼接和比对推测不同，DRS以单分子长读段方式，一次性捕获整个剪接上下文，使这些异构体结构得以原位确认。综上，该研究展示了DRS在融合异构体识别中的另一项核心价值：不仅能揭示未知结构，更能验证已有异构体模型的准确性与表达状态，是实现“从预测走向证实”的关键技术平台。五、结语：从“可疑拼图”到“真实全貌”，融合基因检测进入全新时代在融合基因成为精准医学关键支点的当下，我们比任何时候都更需要一种能够还原其真实结构、捕捉其表达异构体、解析其动态调控甚至功能产物的检测技术。NanoporeDRS，不再只是测序平台的进化版本，而是融合基因研究范式的重构者。它让“看到融合”从短读段的推测变为长读长的实锤；它让“解析结构”不再依赖算法重建，而是基于单分子的天然跨度；它让“理解表达”不仅停留在是否存在，而是延伸到什么时候、在哪些细胞、以何种异构体形式存在；它更让“确认功能”成为可能，使融合转录本从一个待注释的序列，走向具有生物学效应的候选靶点。我们正在从“能测到融合”迈入“能读懂融合”的新阶段。DRS是当前唯一能够在一次实验中同时实现结构确认、表达定量与功能关联的测序技术。它将融合基因检测从散落的数据碎片拼图，推进至原貌重现的整图洞见。未来，我们对融合基因的理解不应仅停留在“是否存在”，更应迈向“结构何在、功能为何、干预可否”。DRS，正在让这一未来提前到来。参考文献[1]Y.Chen,J.Goeke,etal.AsystematicbenchmarkofNanoporelong-readRNAsequencingfortranscript-levelanalysisinhumancelllines.NatureMethods.2025./10.1038/s41592-025-02623-4[2]SchiksnisEC,NicastroIA,PasquinelliAE.Full-lengthdirectRNAsequencingrevealsextensiveremodelingofRNAexpression,processingandmodificationin