仪器分析项目五高效液相色谱分析94课件

仪器分析项目五

高效液相色谱分析认识高效液相色谱法1认识高效液相色谱仪2掌握高效液相色谱仪的应用3概念与特点分离类型认识高效液相色谱法11.2.1液-固吸附色谱法液-固吸附色谱法是以固体吸附剂作固定相，被分离物质在固定相吸附力大小的不同而实现分离的方法。固定相极性：硅胶、氧化铝等，其中全多孔型硅胶微粒固定相使用最广泛。非极性：活性炭等。流动相极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用极性较低的流动相。特别适宜于分离异构体。具体为偶氮染料、维生素、极性小的植物色素等。分离原理1.2.2液-液分配色谱法分离原理液-液分配色谱法是根据物质在两种不互溶（或部分互溶）的液体中溶解度的不同而实现分离的方法。将特定的液态（固定液）涂渍在惰性载体（担体）表面制备固定相，与流动相组成液液两相。组分分离时依据不同的组分在互不相溶的两相中分配系数不同，因而溶质在两相间进行分配。固定液易被流动相渐渐溶解而流失，流动相流速不能高，不能采用梯度洗脱，柱的重复性、稳定性不好，使用受限。1.2.3键合相色谱法定义化学键合相色谱法（BPC）是采用将固定液利用化学反应键合到载体表面上，使其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相的液相色谱法。据统计，在高效液相色谱法中，约有80%的分离问题可以用键合相色谱法解决。十八烷基硅烷(ODS)键合相1.2.3键合相色谱法化学键合相类型载体：广泛使用全孔型或薄壳型微粒硅胶。键合反应：硅烷化反应、硅酸酯化反应类型：非极性键合相（键合ODS或C18等非极性基团）

极性键合相（键合-NH2、-CN、醇基等极性基团）

离子型键合相（键合季铵盐、磺酸基等可交换阴或阳离子基团)据统计，在高效液相色谱分析任务中，约有80%由C18反相键合相解决。1.2.3键合相色谱法正相键合相色谱法特征——固定相极性＞流动相极性固定相——-NH2、-CN等极性键合相流动相——非极性或弱极性溶剂（如正己烷）+适量极性溶剂（如乙腈、

三氯甲烷、醇等混合溶剂分离机制——类似液-液分配色谱的分离原理应用范围——分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物

1.2.3键合相色谱法反相键合相色谱法特征——固定相极性＜流动相极性固定相——ODS（C18）或辛烷基硅烷（C8）等非极性或弱极性键合相流动相——水+有机调节剂（如水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇-无机盐缓冲液等）分离机制——“疏溶剂作用”理论应用范围——适用于分离非极性至中等极性的分子型化合物

1.2.3键合相色谱法1-对羟基苯甲酸甲酯2-对羟基苯甲酸乙酯3-对羟基苯甲酸丙酯4-对羟基苯甲酸丁酯当溶质分子的极性一定时，若增大流动相的极性（水相比例增大），则降低流动相对溶质分子的洗脱能力，使溶质的分配比增大，保留时间增大；反之亦然。固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶2-苯酚3-乙酰苯4-硝基苯5-苯甲酸甲酯6-甲苯反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。反相色谱分离实例1.2.3键合相色谱法流动相要求：（1）纯度要高：色谱纯→过滤（0.45μm有机膜）→脱气；

（2）对色谱柱、固定相和分离组分要有惰性；

（3）对样品要有适宜的溶解度；

（4）与检测器要相匹配：紫外检测器：要求流动相在紫外区吸收很弱；

示差折光检测器：要求流动相与样品组分的折光率相差较大。常用溶剂极性顺序：水>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>四氢呋喃>二氯甲烷实际上采用适当比例的二元混合溶剂可适应不同类型的样品分析，有时采用三元甚至四元混合溶剂以获得最佳分离。实际使用中，采用甲醇-水体系已能满足多数样品的分离要求。1.2.4离子色谱法离子色谱法是利用不同待测离子对固定相上的交换基团亲和力差别而实现分离。定义1.2.4离子色谱法分离原理抑制型（双柱型）交换反应：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH洗脱反应：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX与组分反应：R-H++NaX→R-Na++HX与洗脱剂反应：R-H++NaOH→R-Na++H2O加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。分离柱抑制柱1.2.4离子色谱法分离原理非抑制型（单柱型）使用更低交换容量的固定相，常使用浓度很低、电导率很低的流动相，如0.1-1.0mmol/L的苯甲酸、邻苯二甲酸或它们的盐溶液。由于本底电导较低,试样离子被洗脱后可直接被电导检测器所检测。1.2.4离子色谱法固定相实际上是离子交换剂，离子交换基团+基质上。基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。类型：阳离子和阴离子交换剂。前者用于分离碱性化合物，后者用于酸性化合物。类型符号官能团强阳离子交换剂SCX—SO3H弱阳离子交换剂WCX—COOH强阴离子交换剂SAX—N+R3弱阴离子交换剂WAX—NH21.2.4离子色谱法流动相大都采用水缓冲溶液，有时用有机溶剂+水缓冲溶液。增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力，使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱；反之，则保留时间增大，后出色谱柱。pH增大，酸的离解度增大，保留时间增加，后出柱；有机碱的离解度降低，保留时间减小，先出柱。缓冲溶液中缓冲剂浓度增大，保留时间会减小。1.2.5凝胶色谱法凝胶色谱法又称分子排阻色谱法，它是以多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同（分子尺寸大小）而使各组分分离。分离原理小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。1.2.5凝胶色谱法分离过程1-分子大小不同的混合物上柱；2-洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3-大小分子分开；4-大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。1.2