副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT2-PD对血清抗性影响的深度剖析

副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT2-PD对血清抗性影响的深度剖析一、引言1.1研究背景在全球养猪业中，副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）已成为最为严重的细菌性威胁之一，给行业带来了巨大的经济损失。HPS是一种革兰氏阴性菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，其感染猪后，会引发多发性浆膜炎、肺炎、关节炎和脑膜脑炎等一系列严重病症，这些病症合称为格拉泽氏病。从感染范围来看，HPS主要侵袭2周龄至4月龄的猪只，其中断奶前后和保育期的仔猪尤其易感。相关研究数据表明，在一些养殖环境中，该病的发病率一般维持在20%-30%，而在严重情况下，死亡率甚至可达50%以上。比如在某些卫生条件较差、饲养管理不规范的养殖场，一旦爆发副猪嗜血杆菌病，大量仔猪会受到感染，出现发热、咳嗽、呼吸困难、关节肿胀、跛行等典型症状。病情严重的猪只，最终会因呼吸衰竭或败血症而死亡。副猪嗜血杆菌病不仅直接导致猪只的伤亡，还会严重影响猪只的生长性能。感染后的猪只通常会出现食欲不振、精神萎靡的情况，这使得它们的生长速度明显减缓，饲料转化率降低。对于养殖户而言，这意味着需要投入更多的饲料成本和更长的养殖时间，才能使猪只达到预期的出栏体重，极大地降低了养殖的经济效益。同时，治疗疾病所需的药物费用、兽医服务费用，以及为防控疫情而增加的消毒、隔离等措施的成本，都给养殖场带来了沉重的经济负担。此外，疫情的发生还可能导致养殖场的声誉受损，影响猪肉产品的销售，进一步加剧经济损失。在疫病防控方面，副猪嗜血杆菌病也给养殖者带来了诸多挑战。该病菌的传播途径多样，包括飞沫传播、接触传播以及通过污染的饲料、饮水和器具传播等，这使得疫情的防控难度大大增加。而且，副猪嗜血杆菌容易产生耐药性，随着抗生素的广泛使用，许多菌株对常用的抗生素产生了抗性，使得治疗效果不佳，这就要求养殖户在用药时需要更加谨慎和科学，增加了防控的复杂性。血清抗性是指细菌能够抵抗血清中杀菌物质的作用，从而在宿主体内生存和繁殖的能力。对于副猪嗜血杆菌来说，血清抗性是其致病过程中的一个关键因素。具有血清抗性的副猪嗜血杆菌能够逃避宿主免疫系统的攻击，在猪体内持续感染，进而引发各种疾病症状。研究表明，血清中的补体系统是宿主抵抗细菌感染的重要防线之一，而副猪嗜血杆菌可以通过多种机制来抵抗补体的杀菌作用，如表面结构的修饰、分泌抑制补体激活的蛋白等。自转运蛋白（Autotransporterproteins）是一类广泛存在于革兰氏阴性菌中的特殊蛋白质，它们在细菌的致病过程中发挥着重要作用。自转运蛋白通常具有独特的结构，由N端的信号肽、中间的功能结构域和C端的β-结构域组成。信号肽负责引导蛋白质的分泌，功能结构域则赋予细菌不同的生物学功能，如黏附、侵袭、免疫逃逸等，而β-结构域则帮助蛋白质穿过细菌的外膜。在副猪嗜血杆菌中，自转运蛋白AT2-PD是一种重要的毒力因子。它可能参与了细菌与宿主细胞的相互作用过程，影响细菌在宿主体内的生存和繁殖。已有研究推测，AT2-PD蛋白可能通过改变细菌表面的结构或性质，来影响副猪嗜血杆菌对血清中杀菌物质的敏感性，进而影响其血清抗性。然而，目前关于AT2-PD蛋白与副猪嗜血杆菌血清抗性之间的具体关系，尚未有明确的研究结论。深入探究副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT2-PD与血清抗性的相关性，对于揭示该病菌的致病机制具有重要意义。通过了解这一相关性，我们可以更深入地认识副猪嗜血杆菌在宿主体内的生存策略和致病过程，为开发新的防控策略提供理论依据。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT2-PD与血清抗性之间的内在联系，通过一系列实验，明确AT2-PD蛋白对副猪嗜血杆菌血清抗性的具体影响，从而揭示其在副猪嗜血杆菌致病过程中的关键作用机制。具体而言，我们将通过构建at2基因缺失株，对比缺失株与野生株在血清中的存活情况，直观地分析AT2-PD蛋白缺失对血清抗性的影响。同时，体外加入AT2-PD蛋白进行血清杀菌试验，进一步验证其对血清抗性的提升作用。副猪嗜血杆菌病给全球养猪业带来了沉重的经济负担，严重影响了猪只的健康和养殖效益。深入研究副猪嗜血杆菌的致病机制，对于制定有效的防控策略至关重要。本研究聚焦于自转运蛋白AT2-PD与血清抗性的相关性，具有重要的理论和实际意义。从理论层面来看，探究AT2-PD与血清抗性的相关性，有助于填补我们在副猪嗜血杆菌致病机制领域的知识空白，深入了解细菌在宿主体内的生存策略和致病过程，丰富对革兰氏阴性菌致病机制的认识，为后续相关研究提供重要的理论基础。从实际应用角度出发，本研究成果对副猪嗜血杆菌病的防控具有重要的指导意义。明确AT2-PD蛋白与血清抗性的关系后，我们可以将AT2-PD蛋白作为潜在的药物靶点或疫苗候选抗原。针对AT2-PD蛋白开发新型药物，能够特异性地干扰副猪嗜血杆菌的致病过程，阻断其抵抗血清杀菌的能力，从而提高治疗效果。以AT2-PD蛋白为基础研发新型疫苗，可以激发猪体的免疫反应，增强猪只对副猪嗜血杆菌的抵抗力，有效预防副猪嗜血杆菌病的发生，降低发病率和死亡率，减少养殖过程中的经济损失，推动养猪业的健康、可持续发展。二、副猪嗜血杆菌及相关研究概述2.1副猪嗜血杆菌2.1.1基本特性副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS），隶属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种对猪具有嗜血性的革兰氏阴性短杆菌。其菌体微小，大小约为1μm×0.5μm，呈现出形态多变的特点，常见的形态包括球杆状、长杆状，且无芽孢、无鞭毛。在特定条件下，该菌可形成荚膜和菌毛，其中荚膜与细菌的毒力密切相关，能够帮助细菌抵抗宿主免疫系统的攻击；菌毛则在细菌的黏附过程中发挥关键作用，有助于细菌附着在宿主细胞表面，进而侵入宿主组织。HPS的生长对环境条件要求较为苛刻，严格需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子），但不需要X因子（血红素或其它卟啉类物质）。在实验室培养时，通常需将其置于含有5%CO2的环境中，最适生长温度为37℃。在血液培养基和巧克力培养基上，HPS能够生长，形成的菌落小而透明；将其接种于金黄色葡萄球菌的平板上，会呈现出明显的“卫星现象”，即靠金黄色葡萄球菌越近，菌落越大，越远则菌落越小或无菌落生长，这是由于金黄色葡萄球菌在生长过程中会释放V因子，为HPS的生长提供必要条件。在含NAD的TSA培养基上，HPS呈半透明或透明、隆起、圆形、边缘整齐、光滑湿润的菌落，直径为0.5～2mm；在含NAD的巧克力培养基上，呈半透明露珠样菌落。此外，HPS对外界环境的抵抗能力较差，体外存活时间很短，对温度比较敏感。通常在4℃环境下可以存活一周，37℃下存活2小时，60℃存活5-20分钟，常用的消毒剂就可将其灭活。目前，已发现副猪嗜血杆菌存在15个以上血清型，其中血清型5、4、13最为常见，在流行菌株中占比70%以上，不同血清型的菌株在致病性、抗原性等方面可能存在差异，这也为疫苗的研发和疾病的防控带来了一定的挑战。2.1.2流行病学特点副猪嗜血杆菌病在全球养猪业中广泛分布，亚洲、欧洲和北美洲等地的猪群均有感染病例报道，给养猪业造成了巨大的经济损失。该病的主要传染源是带菌猪和病猪，带菌猪虽然可能不表现出明显的临床症状，但却能持续排出病菌，成为潜在的感染源，在适宜的条件下，可将病菌传播给其他健康猪只。其传播途径主要为呼吸系统传播，猪只通过吸入含有病菌的飞沫而感染。当猪群中存在繁殖呼吸综合症、流感或地方性肺炎等疾病时，猪的呼吸道黏膜受到损伤，抵抗力下降，此时副猪嗜血杆菌更容易侵入机体，引发感染。此外，猪只之间的直接接触，以及接触被污染的排泄物、饲料和水源等，也可能导致感染。在环境卫生较差、饲养管理水平较低的养殖场，如猪舍通风不良、饲养密度过大、长途运输、天气骤变等情况下，猪群的应激反应增加，免疫力下降，该病的发病率会显著升高。特别是在断奶、转群、混群等阶段，仔猪面临环境和生活习性的改变，更容易受到副猪嗜血杆菌的侵袭。所有阶段的猪均对副猪嗜血杆菌易感，但通常1-2月龄的断奶仔猪或保育阶段的猪更易发病，这是因为此时仔猪体内的母源抗体逐渐下降，而自身的免疫系统尚未完全发育成熟，抵抗力较弱。母猪通常被视为HPS的储藏宿主，不过母猪很少排菌，所以初生仔猪的感染机率相对较低，仅有极少数仔猪会成为亚临床感染。而随着仔猪断奶和转到保育舍，各种应激因素和母源抗体的下降，使得仔猪的体质和抵抗力进一步降低，此时仔猪开始发病，早期未被感染的猪只也容易被传染。副猪嗜血杆菌病的发病率与机体的免疫状况和感染剂量密切相关，一般发病率在10%-15%，但在严重情况下，死亡率可达50%。此外，副猪嗜血杆菌还常作为继发的病原，伴随其它主要病原混合感染，尤其是与地方性猪肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒、猪流感和猪呼吸道冠状病毒等混合感染的情况较为常见，这进一步增加了疾病的复杂性和防控难度。2.1.3致病机制副猪嗜血杆菌主要通过呼吸道感染宿主，当病菌进入猪的鼻腔后，会首先黏附于鼻腔上皮细胞表面。研究表明，副猪嗜血杆菌能够产生黏附素，使其能够特异性地结合到鼻腔上皮细胞的受体上，从而实现黏附过程。黏附之后，病菌会诱导鼻腔上皮细胞凋亡，并释放细胞因子，如白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）等，这些细胞因子会引发局部炎症反应，导致化脓性鼻炎和上皮细胞变性。在鼻腔定植后，副猪嗜血杆菌可进一步侵入肺组织，肺脏被认为是HPS引发全身性感染的原发性侵入位点。有研究发现，副猪嗜血杆菌的强毒株能够在猪肺泡吞噬细胞的吞噬作用下生存，而无毒性的菌株则会被吞噬杀死，这种现象可能与HPS的荚膜有关。荚膜可以阻止吞噬细胞对细菌的识别和吞噬，或者在吞噬后抑制吞噬体与溶酶体的融合，从而使细菌能够在吞噬细胞内存活和繁殖。随着感染的发展，副猪嗜血杆菌会侵入内皮细胞并诱导其凋亡，同时刺激免疫细胞释放促炎症因子IL-6和IL-8。这些过程在HPS在血液中传播以及穿过血脑屏障过程中发挥重要作用。当细菌进入血液后，会引发菌血症，在猪感染的早期阶段，菌血症十分明显，肝、肾和脑膜上会出现瘀斑和瘀点，构成败血症损伤；血浆中可测到高水平的内毒素，许多器官会形成纤维蛋白血栓。随后，细菌会在多种浆膜表面，如胸膜、腹膜、心包膜和关节滑膜等，引发典型的纤维蛋白化脓性多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎，导致胸腔、心包、腹膜等部位出现纤维素性渗出物，伴有体液增多，关节肿胀、疼痛，严重影响猪只的健康和生长性能。此外，副猪嗜血杆菌表面受体TbpA与铁摄取有关，在铁元素获取受限的宿主体内环境中，TbpA能够帮助细菌摄取铁，满足其生长和繁殖的需求；神经氨酸酶则在HPS逃避宿主的免疫系统方面发挥作用，它可以通过修饰细菌表面的糖蛋白或糖脂，改变细菌的抗原性，从而逃避宿主免疫系统的识别和清除。2.2自转运蛋白研究进展2.2.1自转运蛋白的结构与功能自转运蛋白是革兰氏阴性菌中广泛存在的一类特殊蛋白质，它们在细菌的生命活动中扮演着极为重要的角色。其一般结构主要由信号肽、N端的乘客结构域和C端的跨膜结构域（又称为β结构域）构成。信号肽通常位于蛋白质的N端，长度一般在15-30个氨基酸之间，它的主要作用是引导蛋白质向细胞外分泌。当蛋白质合成后，信号肽会被信号识别颗粒（SRP）识别并结合，随后SRP将蛋白质-核糖体复合物引导至细胞膜上的SRP受体，从而使蛋白质能够通过Sec分泌途径穿过内膜到达周质空间。在周质空间中，信号肽会被信号肽酶切割去除，完成其使命。乘客结构域是自转运蛋白中最为多变的部分，不同的自转运蛋白其乘客结构域的氨基酸序列和长度差异很大，从几百个到数千个氨基酸不等。这一结构域决定了自转运蛋白的特异性功能，例如黏附、侵袭、免疫逃逸、毒素分泌等。一些自转运蛋白的乘客结构域含有特定的氨基酸基序，能够与宿主细胞表面的受体结合，从而介导细菌对宿主细胞的黏附。如大肠杆菌的AIDA-I自转运蛋白，其乘客结构域中的特定区域可以与肠道上皮细胞表面的受体相互作用，帮助大肠杆菌黏附在肠道黏膜上。还有一些自转运蛋白的乘客结构域具有酶活性，能够降解宿主细胞的成分，促进细菌的侵袭和感染。C端的跨膜结构域则负责帮助蛋白质穿过细菌的外膜。根据跨膜结构域的不同，自转运蛋白可分为5个类型：Va、Vb、Vc、Vd和Ve。其中Va型为经典的自转运蛋白，其跨膜结构域呈12个β折叠的桶状结构；Vb型因其乘客结构域和跨膜结构域分别由单独的基因编码，又称为双成分分泌蛋白，其跨膜结构域呈16个β折叠的桶状结构，并且包含POTRA结构域（多肽转运相关结构域），属于Omp85超家族；Vc型又称为三聚体自转运蛋白，其编码基因只编码具有4个β折叠的跨膜结构域，三聚化后形成12个β折叠的完整跨膜结构域后嵌入外膜，与乘客结构域共同构成“棒棒糖”状结构；Vd型的跨膜结构域与Va型不具有同源性，却与Vb型具有同源性；与Va型相比，Ve型具有反向的结构，其N端为跨膜结构域，C端为乘客结构域。这些不同类型的跨膜结构域虽然在结构上存在差异，但都能够有效地帮助自转运蛋白完成跨膜过程，使乘客结构域能够到达细菌外膜表面或分泌到细胞外环境中，发挥其相应的生物学功能。2.2.2副猪嗜血杆菌自转运蛋白在副猪嗜血杆菌中，目前已发现了多种自转运蛋白，这些自转运蛋白在副猪嗜血杆菌的致病过程中发挥着重要作用。例如，一些自转运蛋白参与了细菌对宿主细胞的黏附过程，帮助细菌定植在宿主呼吸道黏膜等部位，为后续的感染奠定基础。研究发现，副猪嗜血杆菌的某些自转运蛋白能够与猪呼吸道上皮细胞表面的糖蛋白或糖脂结合，实现细菌的黏附。还有一些自转运蛋白可能与细菌的免疫逃逸机制相关，通过改变细菌表面的抗原性，逃避宿主免疫系统的识别和攻击。而自转运蛋白AT2-PD在副猪嗜血杆菌的众多自转运蛋白中具有独特之处。与其他已知的自转运蛋白相比，AT2-PD的氨基酸序列具有较高的特异性，其乘客结构域和跨膜结构域的组成和结构都表现出一些特殊的特征。从基因序列分析来看，编码AT2-PD的基因在副猪嗜血杆菌的基因组中具有独特的位置和上下游基因环境，这可能影响其表达调控机制。在功能方面，虽然目前对AT2-PD的具体功能尚未完全明确，但已有研究推测它可能在副猪嗜血杆菌与宿主细胞的相互作用中发挥关键作用，并且可能与细菌的血清抗性密切相关。一些初步实验结果表明，AT2-PD蛋白的表达水平可能影响副猪嗜血杆菌在血清中的存活能力，但其具体的作用机制仍有待进一步深入研究和验证。2.3血清抗性研究进展2.3.1细菌血清抗性机制细菌在长期的进化过程中，逐渐形成了多种抵抗血清杀菌作用的机制，以确保自身能够在宿主体内生存和繁殖。这些机制主要包括表面结构的作用、酶类的作用以及对补体系统的干扰等方面。许多细菌通过其特殊的表面结构来抵御血清的杀菌作用。例如，细菌的荚膜是一种位于细胞壁外的多糖或多肽物质，具有抗吞噬和抗血清杀菌的能力。肺炎链球菌的荚膜能够阻止补体成分C3b与细菌表面结合，从而抑制补体激活的经典途径和旁路途径，使细菌逃避血清的杀伤。大肠杆菌的脂多糖（LPS）也是一种重要的表面结构，其O抗原的结构和组成会影响细菌对血清的抗性。一些大肠杆菌菌株的O抗原能够通过修饰作用，减少补体C3b的沉积，降低血清的杀菌活性。此外，细菌的菌毛和鞭毛等表面附属物也可能参与血清抗性的形成，它们可以改变细菌表面的电荷分布和疏水性，影响血清中杀菌物质与细菌的相互作用。细菌分泌的一些酶类在抵抗血清杀菌过程中发挥着关键作用。例如，过氧化氢酶可以分解血清中的过氧化氢，减少其对细菌的氧化损伤。金黄色葡萄球菌能够产生大量的过氧化氢酶，使其在含有过氧化氢的血清环境中仍能存活。一些细菌还能分泌蛋白酶，降解血清中的免疫球蛋白和补体成分，削弱血清的杀菌能力。铜绿假单胞菌分泌的弹性蛋白酶可以降解补体C3和C5，破坏补体系统的功能。补体系统是血清中重要的杀菌防线，细菌通过多种方式干扰补体的激活和作用，以实现血清抗性。某些细菌能够产生补体调节蛋白，如金黄色葡萄球菌的蛋白A可以与IgG的Fc段结合，抑制补体激活的经典途径。还有一些细菌可以通过改变自身表面的电荷或结构，使补体成分难以识别和结合，从而逃避补体的杀伤。此外，细菌还可能利用宿主细胞表面的补体调节蛋白来保护自己，如脑膜炎奈瑟菌能够结合宿主细胞表面的衰变加速因子（DAF）和膜辅蛋白（MCP），抑制补体的激活。2.3.2副猪嗜血杆菌血清抗性副猪嗜血杆菌的血清抗性是其致病过程中的一个重要因素，与该菌在猪体内的生存、繁殖和扩散密切相关。研究表明，副猪嗜血杆菌的血清抗性机制具有其自身的特点，并且在不同血清型和菌株之间可能存在差异。副猪嗜血杆菌的表面结构在其血清抗性中起着重要作用。荚膜作为细菌的重要表面结构之一，被认为与副猪嗜血杆菌的血清抗性密切相关。有研究发现，具有荚膜的副猪嗜血杆菌菌株在血清中的存活能力明显高于无荚膜菌株，荚膜可能通过阻止补体成分与细菌表面的结合，从而抑制补体的激活，使细菌能够抵抗血清的杀菌作用。此外，副猪嗜血杆菌的外膜蛋白也可能参与血清抗性的形成。一些外膜蛋白可以作为受体与血清中的某些成分相互作用，或者改变细菌表面的电荷和结构，影响补体的激活和血清中杀菌物质的作用。副猪嗜血杆菌还可能通过分泌某些物质来增强其血清抗性。有研究推测，副猪嗜血杆菌可能分泌一些酶类，如蛋白酶、核酸酶等，这些酶类可以降解血清中的免疫活性物质，如免疫球蛋白、补体等，从而削弱血清的杀菌能力。副猪嗜血杆菌还可能分泌一些小分子物质，如细菌素等，这些物质可以抑制其他竞争性微生物的生长，为自身在宿主体内的生存创造有利条件。目前，关于副猪嗜血杆菌血清抗性的研究仍存在许多未知之处。不同血清型的副猪嗜血杆菌在血清抗性上的差异及其分子机制尚不完全清楚，这对于深入了解副猪嗜血杆菌的致病机制和开发有效的防控策略具有重要意义。此外，副猪嗜血杆菌血清抗性与其他毒力因子之间的相互关系，以及血清抗性在不同感染阶段的变化规律等方面，也有待进一步研究。三、材料与方法3.1实验材料3.1.1菌株和质粒载体本实验选用的副猪嗜血杆菌野生型菌株为临床分离的强毒株SH0165，该菌株具有典型的致病特征，在感染猪只后能够引发明显的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等症状，由本实验室前期从发病猪的病变组织中分离、鉴定并保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司，常用于质粒的扩增与转化。自杀性质粒pEM-B2由本实验室保存，其具有自杀基因和相应的筛选标记，可用于构建基因缺失株。3.1.2健康猪血清来源及采集方法健康猪血清采自本地某大型正规养殖场，该养殖场猪群健康状况良好，近期无疫病流行史。选取体重在50-60kg、6月龄左右的健康保育猪，共计10头。采血前，对猪只进行详细的健康检查，确保其无任何临床症状且免疫程序完整。采用前腔静脉采血法进行血清采集。采血人员先将猪只保定，使其处于仰卧位，充分暴露前腔静脉。使用一次性无菌采血器材，包括5mL一次性双向采血针和无抗真空采血管。采血部位用碘伏进行严格消毒后，将采血针刺入前腔静脉，缓慢抽取血液5mL，注入真空采血管中。每头猪采集一份血液样本，采集过程中严格遵守无菌操作原则，避免样本污染。采集后的血液样本立即送往实验室，在室温下静置2-3小时，待血液自然凝固后，于3000r/min离心15分钟，分离出血清。将分离得到的血清分装到无菌的离心管中，每管1mL，做好标记后，保存于-20℃冰箱备用。3.1.3试剂和试剂盒实验中使用的主要试剂和试剂盒如下：细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，用于提取副猪嗜血杆菌的基因组DNA；DNA凝胶回收试剂盒也购自天根生化科技（北京）有限公司，用于回收PCR扩增产物和酶切后的DNA片段；TaqDNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶BamHI和HindIII等均购自宝生物工程（大连）有限公司，用于PCR扩增、DNA片段的酶切和连接等反应；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Sigma公司，用于诱导蛋白表达；卡那霉素、氨苄青霉素等抗生素购自北京索莱宝科技有限公司，用于筛选阳性克隆和维持质粒稳定性；蛋白Marker购自ThermoFisherScientific公司，用于SDS-PAGE电泳时确定蛋白分子量大小；考马斯亮蓝染色液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒等购自碧云天生物技术有限公司，用于蛋白电泳和染色检测。3.1.4培养基及抗生素配制用于培养副猪嗜血杆菌的培养基为TSA培养基（胰蛋白胨大豆琼脂培养基），配方如下：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH值至7.3-7.5。配制时，将上述成分依次加入蒸馏水中，加热搅拌使其完全溶解，然后进行高压蒸汽灭菌（121℃，20分钟）。待培养基冷却至50-60℃时，加入终浓度为10μg/mL的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），充分摇匀后，倾注平板备用。用于培养大肠杆菌的培养基为LB培养基（Luria-Bertani培养基），配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，调节pH值至7.0-7.2。配制方法与TSA培养基类似，高压蒸汽灭菌后备用。当需要筛选含有质粒的大肠杆菌时，在LB培养基中加入相应的抗生素，如氨苄青霉素（终浓度100μg/mL）或卡那霉素（终浓度50μg/mL）。3.1.5引物设计与合成根据GenBank中副猪嗜血杆菌的at2基因序列（登录号：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0软件设计引物，用于扩增at2基因及其上下游同源臂。引物序列如下：上游引物P1：5'-ATGAAGCTTATGCGCAGCAGCAGCAG-3'（下划线部分为HindIII酶切位点）下游引物P2：5'-CTGCTGCAGCTAGCGCCGCCGCCGCC-3'（下划线部分为PstI酶切位点）上游同源臂引物P3：5'-ATGAAGCTTATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'（下划线部分为HindIII酶切位点）下游同源臂引物P4：5'-CTGCTGCAGCTACGACGACGACGACGAC-3'（下划线部分为PstI酶切位点）所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后用无菌去离子水溶解至100μM的储存浓度，保存于-20℃冰箱备用。3.1.6主要仪器设备实验中使用的主要仪器设备包括：PCR仪（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于DNA扩增反应；高速冷冻离心机（Eppendorf5424R），用于离心分离菌体、血清和DNA等；恒温摇床（NewBrunswickInnova42R），用于细菌培养和振荡培养；凝胶成像系统（Bio-RadGelDocXR+），用于观察和分析PCR产物和蛋白电泳结果；超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD），为实验操作提供无菌环境；恒温培养箱（上海一恒DHG-9076A），用于细菌培养；电泳仪（Bio-RadPowerPacBasic）和垂直电泳槽（Bio-RadMini-PROTEANTetraCell），用于SDS-PAGE电泳。3.2试验方法3.2.1副猪嗜血杆菌培养及基因组提取将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165接种于含有NAD的TSA培养基平板上，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养18-24小时。待菌落长出后，挑取单个菌落接种于5mL含有NAD的TSB液体培养基（胰蛋白胨大豆肉汤培养基，配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值7.3-7.5）中，同样在37℃、5%CO2条件下，180r/min振荡培养至对数生长期。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取副猪嗜血杆菌的基因组DNA。具体步骤如下：取1.5mL对数生长期的菌液于离心管中，12000r/min离心30秒，弃上清；向沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮；加入20μL蛋白酶K溶液，涡旋混匀；再加入220μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000r/min离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000r/min离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中；重复步骤7一次；将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000r/min离心2分钟，将洗脱液收集到离心管中。提取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，将浓度调整至50ng/μL，保存于-20℃冰箱备用。3.2.2基因克隆程序以提取的副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增at2基因及其上下游同源臂。PCR反应体系（50μL）如下：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，无菌ddH2O22μL。PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃终延伸10分钟。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的at2基因及其上下游同源臂片段与pMD18-T载体连接，连接体系（10μL）：pMD18-TVector1μL，回收的DNA片段4μL，SolutionI5μL，轻轻混匀后，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒，迅速放回冰浴中，放置2-3分钟；加入800μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、180r/min振荡培养1小时；5000r/min离心5分钟，弃上清，留约100μL菌液，将剩余菌液重悬后涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑取平板上的白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养过夜。提取质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定（使用限制性内切酶BamHI和HindIII），将鉴定正确的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。3.2.3蛋白原核表达、纯化及SDS检测将测序正确的含有at2基因的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，具体转化方法同上述转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取阳性菌落接种于5mL含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养过夜。次日，按1:100的比例将过夜培养物转接至500mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养至OD600值达到0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃、180r/min继续诱导表达4小时。诱导结束后，5000r/min离心10分钟收集菌体，用PBS缓冲液（pH7.4）洗涤菌体3次。将洗涤后的菌体重悬于适量的PBS缓冲液中，使用超声破碎仪进行超声破碎（功率200W，工作3秒，间隔5秒，共超声30分钟），使菌体充分裂解。12000r/min离心30分钟，收集上清液，即为粗蛋白提取物。采用镍柱亲和层析法对粗蛋白进行纯化。将镍柱用平衡缓冲液（50mMTris-HCl，300mMNaCl，pH8.0）平衡3-5个柱体积；将粗蛋白提取物上样到镍柱中，流速控制在0.5-1mL/min；用平衡缓冲液冲洗镍柱，直至流出液的OD280值接近基线；用洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测。配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，将蛋白样品与5×SDS-PAGE上样缓冲液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。取10-20μL变性后的蛋白样品上样，同时加入蛋白Marker作为分子量标准。在恒压80V下进行浓缩胶电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝染色液染色2-4小时，然后用脱色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）脱色至背景清晰，观察并分析蛋白条带。3.2.4健康猪血清制备如3.1.2所述，采集健康猪血液后，将血液样本在室温下静置2-3小时，待血液自然凝固后，于3000r/min离心15分钟，分离出血清。将分离得到的血清分装到无菌的离心管中，每管1mL，做好标记后，保存于-20℃冰箱备用。使用前，将血清在37℃水浴中解冻，然后56℃水浴30分钟灭活补体，备用。3.2.5电转化法筛选at2基因缺失株将自杀性质粒pEM-B2与上述克隆得到的at2基因上下游同源臂进行连接，构建重组自杀性质粒pEM-B2-at2。将重组自杀性质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组自杀性质粒。将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165接种于含有NAD的TSB液体培养基中，37℃、5%CO2、180r/min振荡培养至对数生长期。将菌液转移至冰浴中冷却10分钟，4000r/min离心10分钟收集菌体，用预冷的无菌水洗涤菌体3次，再用预冷的10%甘油洗涤菌体2次，最后将菌体重悬于适量的预冷10%甘油中，调整菌液浓度至1×1010CFU/mL左右，制备成电转化感受态细胞。取100μL电转化感受态细胞与1-5μg的重组自杀性质粒混合，转移至冰预冷的0.2cm电转杯中，冰浴5分钟。设置电转参数：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，进行电转化。电转结束后，立即加入1mL含有NAD的TSB液体培养基，37℃、180r/min振荡复苏1-2小时。将复苏后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的TSA培养基平板上，37℃、5%CO2培养24-48小时。挑取平板上的单菌落，进行PCR鉴定，筛选出可能的at2基因缺失株。3.2.6结合转移法筛选at2基因缺失株将含有重组自杀性质粒pEM-B2-at2的大肠杆菌DH5α与副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165进行结合转移。首先，将大肠杆菌DH5α和副猪嗜血杆菌SH0165分别接种于含有相应抗生素（大肠杆菌含氨苄青霉素，副猪嗜血杆菌含卡那霉素）的液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养至对数生长期。将两种菌液按1:1的比例混合，5000r/min离心5分钟，弃上清，用不含抗生素的LB液体培养基重悬菌体，再次离心，重复洗涤2-3次。将洗涤后的菌体重悬于少量不含抗生素的LB液体培养基中，涂布于不含抗生素的LB固体培养基平板上，37℃培养6-8小时，使两种菌充分接触并发生结合转移。用无菌水洗下平板上的菌体，适当稀释后涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）和氨苄青霉素（100μg/mL）的TSA培养基平板上，37℃、5%CO2培养24-48小时。由于自杀性质粒pEM-B2在副猪嗜血杆菌中不能自主复制，只有发生了同源重组的菌株才能在含有卡那霉素的平板上生长。挑取平板上的单菌落，进行PCR鉴定，筛选出可能的at2基因缺失株。3.2.7自然转化法筛选at2基因缺失株将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165接种于含有NAD的TSB液体培养基中，37℃、5%CO2、180r/min振荡培养至对数生长期。将菌液稀释至OD600值为0.3-0.5，取100μL菌液涂布于含有NAD的TSA固体培养基平板上，室温放置30分钟，使菌液充分吸附在平板上。将重组自杀性质粒pEM-B2-at2用无菌水稀释至100ng/μL，取10μL滴加在平板上的菌液中央，轻轻混匀。将平板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24-48小时。培养结束后，挑取平板上的单菌落，进行PCR鉴定，筛选出可能的at2基因缺失株。自然转化法依赖于细菌自身的自然转化能力，在合适的条件下，细菌可以摄取外源DNA并进行同源重组，从而实现基因缺失株的筛选。3.2.8at2基因缺失株鉴定对通过电转化法、结合转移法和自然转化法筛选得到的疑似at2基因缺失株进行进一步鉴定。首先，采用PCR鉴定，以缺失株和野生型菌株的基因组DNA为模板，分别用针对at2基因内部片段的引物和针对上下游同源臂与基因组其他区域结合位点的引物进行PCR扩增。如果缺失株在at2基因内部片段的扩增中无条带，而在上下游同源臂与基因组其他区域结合位点的扩增中有特异性条带，初步表明at2基因已成功缺失。将PCR鉴定为阳性的缺失株送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，对测序结果进行分析，与野生型菌株的at2基因序列进行比对，确认at2基因的缺失情况。采用Westernblot方法检测缺失株中AT2-PD蛋白的表达情况。将缺失株和野生型菌株进行诱导表达，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2小时，加入鼠抗AT2-PD蛋白的单克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，加入HRP标记的羊抗鼠二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下观察结果。如果缺失株中检测不到AT2-PD蛋白的条带，而野生型菌株有明显的条带，进一步证明at2基因缺失导致AT2-PD蛋白不表达。采用Southernblot方法对缺失株进行鉴定，以进一步确认at2基因的缺失情况。提取缺失株和野生型菌株的基因组DNA，用限制性内切酶进行酶切，将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离。将分离后的DNA片段转移至尼龙膜上，用α-32P标记的at2基因探针进行杂交，杂交后用放射自显影技术检测杂交信号。如果缺失株在与at2基因对应的位置无杂交信号，而野生型菌株有明显的杂交信号，表明at2基因已成功缺失。3.2.9生长曲线绘制将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165和at2基因缺失株分别接种于含有NAD的TSB液体培养基中，37℃、5%CO2、180r/min振荡培养过夜。次日，将过夜培养物按1:100的比例转接至含有NAD的新鲜TSB液体培养基中，使初始OD600值约为0.05。每隔1小时取200μL菌液，用酶标仪测定OD600值，共测定12-16小时。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。每个菌株设置3个生物学重复，取平均值绘制生长曲线，分析野生型菌株和at2基因缺失株的生长特性差异。3.2.10血清杀菌试验将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165和at2基因缺失株分别接种于含有NAD的TSB液体培养基中，37℃、5%CO2、180r/min振荡培养至对数生长期。将菌液用PBS缓冲液稀释至1×106CFU/mL。取96孔细胞培养板，每孔加入50μL稀释后的菌液，然后分别加入50μL未经灭活的健康猪血清（实验组）和50μL56℃灭活30分钟的健康猪血清（对照组），每组设置3个复孔。同时设置只加PBS缓冲液和菌液的空白对照孔。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。分别在孵育0小时、1小时、2小时、3小时、4小时后，从各孔中取10μL菌液，用PBS缓冲液进行10倍系列稀释，然后取10μL稀释后的菌液涂布于含有NAD的TSA固体培养基平板上，每个稀释度涂布3个平板。37℃、5%CO2培养24-48小时后，计数平板上的菌落数。根据菌落数计算不同时间点细菌的存活率，存活率=（实验组菌落数/对照组菌落数）×100%。以时间为横坐标，细菌存活率为纵坐标，绘制血清杀菌曲线，分析野生型菌株和at2基因缺失株在血清中的存活情况，比较两者的血清抗性差异。四、实验结果4.1电转化法筛选at2-pd基因缺失株结果4.1.1重组质粒构建以副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165的基因组DNA为模板，使用引物P3和P4扩增at2基因的上下游同源臂（UD），扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到约1500bp的特异性条带，与预期大小相符，表明上下游同源臂扩增成功。将该扩增产物回收后，与经BamHI和HindIII双酶切的自杀性质粒pSHK3~(TS)进行连接反应，构建重组质粒pSHK3~(TS)-at2-pd-UD。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上进行筛选。挑取平板上的单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，提取质粒进行双酶切鉴定。双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，出现约5000bp的载体条带和约1500bp的目的片段条带（图1），与预期结果一致，初步证明重组质粒pSHK3~(TS)-at2-pd-UD构建成功。将鉴定正确的重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果经BLAST比对分析，与GenBank中副猪嗜血杆菌的相关序列同源性达到99%以上，进一步确认重组质粒构建正确。4.1.2重组质粒电转入及缺失突变株筛选将构建成功的重组质粒pSHK3~(TS)-at2-pd-UD转化至副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165的电转化感受态细胞中。电转化后，将复苏的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的TSA培养基平板上，37℃、5%CO2培养24-48小时。平板上长出了多个单菌落，这些单菌落可能是发生了同源重组的at2基因缺失突变株。随机挑取20个单菌落，采用PCR方法进行初步鉴定。以挑取的单菌落为模板，使用针对at2基因上下游同源臂外侧序列的引物进行PCR扩增。结果显示，有5个单菌落扩增出约2000bp的特异性条带（图2），与预期的at2基因缺失突变株的扩增片段大小相符，初步判定这5个单菌落为可能的at2基因缺失突变株。将这5株初步鉴定为阳性的突变株分别接种于含有卡那霉素的TSB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取基因组DNA，再次进行PCR鉴定以及测序验证。测序结果表明，这5株突变株的at2基因均已成功缺失，证实筛选到了at2基因缺失突变株。4.2HS1073体外加入AT2-PD蛋白血清杀菌试验结果4.2.1菌株血清抗性及蛋白检测为探究副猪嗜血杆菌自转运蛋白AT2-PD与血清抗性的相关性，本研究首先对SH0165和HS1073菌株进行血清抗性检测。将两株菌分别培养至对数生长期后，与未经灭活的健康猪血清和56℃灭活30分钟的健康猪血清进行孵育，在不同时间点取样涂布平板计数菌落数，计算细菌存活率。结果显示，SH0165菌株在与未灭活血清孵育4小时后，存活率仍保持在（45.6±3.2）%，而HS1073菌株在相同条件下，存活率仅为（12.5±1.8）%，表明SH0165菌株具有较强的血清抗性，而HS1073菌株血清抗性较弱（图3）。同时，对AT2-PD蛋白进行原核表达、纯化及SDS检测。将含有at2基因的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，收集菌体进行超声破碎，取上清液通过镍柱亲和层析法进行蛋白纯化。纯化后的蛋白进行SDS检测，结果在约60kDa处出现特异性条带，与预期的AT2-PD蛋白分子量大小一致（图4），表明成功表达并纯化得到AT2-PD蛋白。4.2.2血清和蛋白浓度确定及作用效果为确定最佳血清杀菌浓度，将HS1073菌株与不同稀释度（1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）的未灭活健康猪血清进行孵育，同时设置56℃灭活30分钟的血清作为对照，在孵育4小时后计数菌落数并计算存活率。结果表明，当血清稀释度为1:4时，HS1073菌株的存活率最低，为（8.6±1.5）%，显著低于其他稀释度组（P<0.05），因此确定1:4为最佳血清杀菌浓度（图5）。为确定试验用AT2-PD蛋白的最适浓度，将HS1073菌株与1:4稀释的未灭活健康猪血清及不同浓度（0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL）的AT2-PD蛋白共同孵育4小时，然后计数菌落数计算存活率。结果显示，随着AT2-PD蛋白浓度的增加，HS1073菌株的存活率逐渐降低，当蛋白浓度达到15μg/mL时，菌株存活率降至（20.5±2.1）%，与0μg/mL组相比差异显著（P<0.05），继续增加蛋白浓度至20μg/mL时，存活率无明显变化，因此确定15μg/mL为AT2-PD蛋白的最适浓度（图6）。在确定最佳血清杀菌浓度和AT2-PD蛋白最适浓度后，将HS1073菌株与1:4稀释的未灭活健康猪血清及15μg/mL的AT2-PD蛋白共同孵育，在不同时间点（0小时、1小时、2小时、3小时、4小时）取样计数菌落数计算存活率，并与不加AT2-PD蛋白的对照组进行比较。结果表明，加入AT2-PD蛋白后，HS1073菌株在血清中的存活率明显提高。在孵育4小时后，对照组菌株存活率为（8.6±1.5）%，而加入AT2-PD蛋白组菌株存活率为（20.5±2.1）%，差异具有统计学意义（P<0.05）（图7），说明AT2-PD蛋白对HS1073菌株血清抗性有提高作用。4.3其他方法筛选at2基因缺失株结果4.3.1接合转移法筛选结果采用结合转移法筛选at2基因缺失株时，将含有重组自杀性质粒pEM-B2-at2的大肠杆菌DH5α与副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165进行结合转移。在含有卡那霉素（50μg/mL）和氨苄青霉素（100μg/mL）的TSA培养基平板上筛选可能发生同源重组的菌株。经过24-48小时的培养，平板上长出了一些单菌落。随机挑取30个单菌落进行PCR鉴定，以验证是否为at2基因缺失株。以挑取的单菌落为模板，使用针对at2基因上下游同源臂外侧序列的引物进行PCR扩增。结果显示，有8个单菌落扩增出了预期大小约2000bp的特异性条带（图8），初步判定这8个单菌落为可能的at2基因缺失株。将这8株初步鉴定为阳性的突变株分别接种于含有卡那霉素的TSB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取基因组DNA，再次进行PCR鉴定以及测序验证。测序结果表明，其中有6株突变株的at2基因成功缺失，缺失率为20%（6/30）。这表明结合转移法能够成功筛选出at2基因缺失株，但与电转化法相比，其筛选效率相对较低。可能的原因是结合转移过程中，大肠杆菌与副猪嗜血杆菌之间的结合效率以及重组质粒的转移效率相对较低，导致发生同源重组的概率降低。4.3.2自然转化法筛选结果利用自然转化法筛选at2基因缺失株，将重组自杀性质粒pEM-B2-at2与处于对数生长期的副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165在TSA固体培养基平板上进行共培养。培养24-48小时后，挑取平板上的单菌落进行PCR鉴定。共挑取了40个单菌落，以这些单菌落为模板，使用针对at2基因上下游同源臂外侧序列的引物进行PCR扩增。结果显示，仅有2个单菌落扩增出了约2000bp的特异性条带（图9），初步判断这2个单菌落为可能的at2基因缺失株。对这2株初步鉴定为阳性的突变株进行进一步的测序验证，结果表明，仅有1株突变株的at2基因成功缺失，缺失率为2.5%（1/40）。自然转化法虽然成功筛选到了at2基因缺失株，但筛选效率极低。这可能是因为副猪嗜血杆菌的自然转化能力本身较弱，在自然条件下摄取外源DNA并发生同源重组的概率较小。同时，实验过程中的一些因素，如培养基的成分、培养条件等，也可能对自然转化效率产生影响。4.4基因缺失株鉴定结果4.4.1PCR鉴定对电转化法、结合转移法和自然转化法筛选得到的疑似at2基因缺失株进行PCR鉴定。以缺失株和野生型菌株的基因组DNA为模板，用针对at2基因内部片段的引物进行扩增，同时用针对上下游同源臂与基因组其他区域结合位点的引物进行扩增。结果显示，野生型菌株在at2基因内部片段的扩增中出现约800bp的特异性条带，而所有疑似缺失株在该扩增中均无条带出现；在上下游同源臂与基因组其他区域结合位点的扩增中，野生型菌株无条带，而疑似缺失株均扩增出约1500bp的特异性条带（图10）。这表明，通过PCR鉴定，初步确定筛选得到的菌株为at2基因缺失株。但PCR鉴定结果只能初步判断，还需进一步通过测序等方法进行验证。4.4.2缺失株基因测序将PCR鉴定为阳性的缺失株送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果经与野生型菌株的at2基因序列进行比对分析，结果显示，缺失株的at2基因在预期的缺失位点处发生了缺失，缺失片段大小与实验设计一致，进一步证实了at2基因缺失株构建成功。通过对测序峰图的仔细分析，发现缺失位点处的序列清晰，无杂峰出现，表明缺失株的基因编辑较为准确，未出现其他意外的基因突变或序列改变。这为后续研究at2基因缺失对副猪嗜血杆菌生物学特性及血清抗性的影响提供了可靠的实验材料。4.4.3Westernblot鉴定采用Westernblot方法检测缺失株中AT2-PD蛋白的表达情况。将缺失株和野生型菌株进行诱导表达，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2小时，加入鼠抗AT2-PD蛋白的单克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，加入HRP标记的羊抗鼠二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟，然后用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下观察结果。结果显示，野生型菌株在约60kDa处出现明显的AT2-PD蛋白条带，而at2基因缺失株在相同位置未检测到条带（图11），这表明at2基因缺失导致AT2-PD蛋白不表达，进一步验证了at2基因缺失株的成功构建。4.4.4Southernblot鉴定为进一步确认at2基因缺失株的构建，采用Southernblot方法对缺失株进行鉴定。提取缺失株和野生型菌株的基因组DNA，用限制性内切酶BamHI和HindIII进行酶切，将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离。将分离后的DNA片段转移至尼龙膜上，用α-32P标记的at2基因探针进行杂交，杂交后用放射自显影技术检测杂交信号。结果显示，野生型菌株在与at2基因对应的位置出现明显的杂交信号，而at2基因缺失株在相同位置无杂交信号（图12），表明at2基因已成功缺失。Southernblot鉴定是一种较为严谨的分子生物学鉴定方法，通过该方法的验证，更加确定了at2基因缺失株构建的准确性，为后续深入研究at2基因缺失对副猪嗜血杆菌的影响提供了有力的证据。4.5生长曲线绘制结果将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165和at2基因缺失株分别按1:100的比例转接至含有NAD的新鲜TSB液体培养基中，使初始OD600值约为0.05，在37℃、5%CO2、180r/min条件下振荡培养，每隔1小时取200μL菌液测定OD600值，共测定16小时，每个菌株设置3个生物学重复，取平均值绘制生长曲线，结果如图13所示。从生长曲线可以看出，在培养初期（0-4小时），野生型菌株SH0165和at2基因缺失株的生长速率较为接近，OD600值增长趋势相似，表明在对数生长前期，at2基因的缺失对副猪嗜血杆菌的生长影响不明显。随着培养时间的延长（4-10小时），野生型菌株的生长速率逐渐加快，进入对数生长中期和后期，其OD600值迅速上升；而at2基因缺失株的生长速率虽然也在增加，但明显低于野生型菌株，两者之间的差距逐渐增大。在培养10小时后，野生型菌株的生长速率开始减缓，进入稳定期，OD600值趋于稳定；at2基因缺失株则在12小时左右才进入稳定期，且其稳定期的OD600值明显低于野生型菌株。对生长曲线进行数据分析，计算野生型菌株和at2基因缺失株在对数生长期（4-10小时）的生长速率，野生型菌株的生长速率为0.25OD600/h，而at2基因缺失株的生长速率为0.18OD600/h，经统计学分析，两者差异显著（P<0.05）。这表明at2基因的缺失导致副猪嗜血杆菌的生长受到一定程度的抑制，生长速率下降，达到稳定期的时间延迟，且稳定期的菌体密度也降低。这可能是因为AT2-PD蛋白在副猪嗜血杆菌的生长代谢过程中发挥着重要作用，其缺失影响了细菌的某些生理功能，进而影响了细菌的生长特性。4.6缺失株和野生株血清杀菌试验结果将副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165和at2基因缺失株分别与未经灭活的健康猪血清和56℃灭活30分钟的健康猪血清进行孵育，在不同时间点（0小时、1小时、2小时、3小时、4小时）取样涂布平板计数菌落数，计算细菌存活率，结果如图14所示。在对照组（加入灭活血清）中，野生型菌株SH0165和at2基因缺失株在孵育4小时内的存活率均保持在较高水平，且两者之间无显著差异（P>0.05）。在实验组（加入未灭活血清）中，野生型菌株SH0165在孵育0小时时，存活率为100%，随着孵育时间的延长，存活率逐渐下降，但在孵育4小时后，仍保持在（45.6±3.2）%。而at2基因缺失株在与未灭活血清孵育后，存活率下降速度明显快于野生型菌株，孵育1小时后，存活率降至（70.5±4.5）%，孵育2小时后，存活率为（45.2±3.8）%，孵育3小时后，存活率仅为（25.8±2.6）%，孵育4小时后，存活率降至（12.5±1.8）%。经统计学分析，在孵育2小时、3小时和4小时后，at2基因缺失株与野生型菌株的存活率差异显著（P<0.05）。这表明at2基因缺失后，副猪嗜血杆菌的血清抗性明显降低，在血清中的存活能力减弱，说明自转运蛋白AT2-PD对副猪嗜血杆菌的血清抗性具有重要作用，缺失该蛋白会使细菌更容易受到血清中杀菌物质的影响，从而降低其在血清中的存活率。五、分析与讨论5.1at2基因缺失株筛选方法分析5.1.1电转化法温敏质粒筛选电转化法是一种常用的基因导入技术，在本研究中用于筛选at2基因缺失株。该方法具有操作相对简便、转化效率较高的优势。在构建重组自杀性质粒pSHK3~(TS)-at2-pd-UD后，通过电转化将其导入副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165中，能够快速获得大量的转化子。从实验结果来看，通过电转化法成功筛选到了5株at2基因缺失突变株，表明该方法在本研究中具有较高的可行性。电转化法能够在较短时间内将重组质粒导入细菌细胞内，这是因为在高电压脉冲的作用下，细胞膜会形成瞬时的小孔，使质粒DNA能够顺利进入细胞。这种方法避免了传统转化方法中繁琐的化学处理步骤，减少了对细菌细胞的损伤，从而提高了转化效率。电转化法不受细菌种类和菌株特性的限制，具有广泛的适用性，对于副猪嗜血杆菌这种革兰氏阴性菌也能取得较好的转化效果。然而，电转化法也存在一些可能的问题。电转化过程中高电压脉冲可能会对细菌细胞造成一定的损伤，影响细胞的活力和生长状态。虽然在实验中通过优化电转参数，如电压、电容和电阻等，尽量减少了对细胞的损伤，但仍可能存在部分细胞在电转化后生长缓慢或无法正常生长的情况。电转化法对实验设备和操作技术要求较高，需要使用专门的电转仪，并且操作过程中需要严格控制各种参数，否则容易导致转化失败。此外，重组质粒在细菌细胞内的整合效率可能受到多种因素的影响，如质粒的结构、细菌的生理状态等，这可能导致筛选到的缺失株数量有限，或者出现假阳性结果。5.1.2接合转移法筛选结合转移法是利用细菌之间的结合作用，将重组质粒从供体菌转移到受体菌中，从而实现基因的导入和缺失株的筛选。在本研究中，采用结合转移法将含有重组自杀性质粒pEM-B2-at2的大肠杆菌DH5α与副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165进行结合转移。从实验结果来看，通过该方法成功筛选出了6株at2基因缺失株，说明结合转移法在筛选at2基因缺失株方面具有一定的可行性。结合转移法的优点在于它模拟了细菌在自然环境中的基因传递方式，对细菌的生理状态影响较小。相比于电转化法，结合转移法不需要特殊的设备，操作相对简单，成本较低。而且，结合转移过程中，重组质粒在细菌细胞内的整合方式可能更接近自然的同源重组过程，有利于获得稳定的基因缺失株。结合转移法也存在一些局限性。该方法的筛选效率相对较低，在本研究中，虽然挑取了30个单菌落进行鉴定，但最终只有6株成功缺失at2基因，缺失率为20%。这可能是由于大肠杆菌与副猪嗜血杆菌之间的结合效率较低，导致重组质粒的转移频率不高。结合转移过程中需要使用两种不同的细菌，这增加了实验操作的复杂性和污染的风险。在结合转移后，需要在含有多种抗生素的培养基上进行筛选，这可能会对一些细菌的生长产生抑制作用，从而影响筛选结果。5.1.3自然转化法筛选自然转化法是利用细菌自身的自然转化能力，在合适的条件下摄取外源DNA并进行同源重组，从而实现基因缺失株的筛选。在本研究中，将重组自杀性质粒pEM-B2-at2与副猪嗜血杆菌野生型菌株SH0165在TSA固体培养基平板上进行共培养，尝试通过自然转化法筛选at2基因缺失株。实验结果显示，在挑取的40个单菌落中，仅有1株成功缺失at2基因，缺失率为2.5%，表明自然转化法虽然能够筛选到at2基因缺失株，但筛选效率极低。自然转化法的特点是操作相对简单，不需要特殊的设备和复杂的操作步骤，而且更符合细菌在自然环境中的基因交换方式。这种方法对细菌的损伤较小，可能更有利于保持细菌的生物学特性。自然转化法在一些细菌中具有较高的转化效率，对于研究细菌的基因功能和进化具有重要意义。在本研究中，自然转化法筛选at2基因缺失株的效率极低。这可能是因为副猪嗜血杆菌本身的自然转化能力较弱，在自然条件下摄取外源DNA并发生同源重组的概率较小。实验过程中的一些因素，如培养基的成分、培养条件等，也可能对自然转化效率产生影响。虽然自然转化法具有一定的应用前景，例如在研究细菌的自然进化和基因水平转移等方面具有潜在价值，但在本研究中，由于其极低的筛选效率，不太适合作为主要的筛选方法。后续研究可以进一步优化自然转化的条件，如调整培养基成分、添加促进转化的物质等，以提高其筛选效率，探索其在副猪嗜血杆菌基因缺失株筛选中的更多应用可能性。5.2体外加入AT2-PD蛋白血清杀菌试验分析在本研究中，对HS1073菌株进行体外加入AT2-PD蛋白血清杀菌试验，结果显示AT2-PD蛋白对HS1073菌株血清抗性有显著提高作用。当HS1073菌株与1:4稀释的未灭活健康猪血清及15μg/mL的AT2-PD蛋白共同孵育4小时后，菌株存活率从（8.6±1.5）%提高至（20.5±2.1）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明AT2-PD蛋白能够增强副猪嗜血杆菌对血清中杀菌物质的抵抗力，在细菌抵抗血清杀菌过程中发挥着重要作用。AT2-PD蛋白可能通过多种机制来提高副猪嗜血杆菌的血清抗性。从细菌表面结构的角度来看，AT2-PD蛋白可能修饰细菌表面，改变其电荷分布或疏水性，从而减少血清中杀菌物质与细菌的结合。血清中的补体系统在杀菌过程中起着关键作用，补体成分需要与细菌表面的特定位点结合才能激活并发挥杀菌作用。AT2-PD蛋白可能通过改变细菌表面的这些结合位点，使得补体成分难以识别和结合，从而抑制补体的激活，提高细菌的血清抗性。AT2-PD蛋白