汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)

HB-infusionTM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusionTM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的GibsonAssemblyDNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。HB-infusionTM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25bp同源序列（图1，图3）。将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusionTMMastermix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。图1.HB-infusionTM快速克隆试剂盒原理示意图。1.线性化目的载体（左上）；2.PCR获取目的片段。设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3.按照一定比例把二者混合在HB-infusionTM的2预混液内，50C反应20min后直接转化E.coli即可。二、HB-infusionTM试剂盒的优点1.相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusionTM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2.对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3.连接片段之间不会引入任何其他序列；4.可以同时克隆多个片段。三、产品包装产品组成使用次数体积2xHB-infusionTMMastermix20tests200lPositivelinearizedpUCvector（250ng）5tests25lPositivecontrolinsert(500ng)5tests25l储存条件-20℃四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0pmols。DNA拼接效率随着拼接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低。附：片段摩尔数量计算公式：pmols=片段质量(ng)1000/(碱基对数650daltons)（碱基数越多，pmols越少；质量越大，pmols越多），举例如下：线性化载体（~5000bp）50ng插入片段（~500bp）10~25ng注：50ng的5000bp（0.015pmols）的线性化dsDNA和10~25ng（0.03~0.075pmols）500bp的PCR产物体系（PCR产物和线性化载体的摩尔比=2：1~5：1）。五、操作步骤1.制备线性化载体和插入片段1.1.载体制备---线性化处理A.质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。注：1.为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。酶切最好能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。GibsonAssembly拼接DNA的原理说明DCBADCBA包含重叠区域的DNA片段均匀混在一起，Mix内的5‘外切酶可以从5’端消化DNA双链中一条链（A）；重叠区域的DNA形成单链，在50°C配对（这一步不需要酶的参与）（B）；同时外切酶的活性在50°C会逐渐丧失；DNA聚合酶从5‘-3’方向延伸（类似PCR中引物结合之后的