DB15T 2025-2020 牛和猪源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法

DB15Real-timePCRMethodforAuthentificationofCattleandPigDerivedMaterials2020-10-20发布内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T2025—2020本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件起草单位：锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中本文件主要起草人：郭梁、雅梅、海小、其勒木格、钱俊平、刘国强、IDB15/T2025—2020牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法本文件描述了动物产品（肉、乳）中牛和猪源性成分的实时荧光PCR本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中牛和猪源性成分的定性检GB/T6682分析实验室用水规格和GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循1DB15/T2025—20205试剂和材料5.2异戊醇。5.3异丙醇。），），）：FAM-CTCTCATGTAGCTAGTGCGTTTAAATAGGG-TAMRAHEX-TTCTTGCATGGTTGTGTAATTGAATATAGGT-TAMRAROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-B2DB15/T2025—20206.1实时荧光PCR仪：通道数≥3，温度控制精度<±0.1℃。6.5金属浴或恒温水浴锅：温度控制精度<±0.5℃。分混匀，装入清洁容器中，加封后，注明标记称取100mg均质固态样品于1.5mL灭菌离心管中；加入700μLCTAB提取液（5.6），充分混匀，加入等体积三氯甲烷和异戊醇混合液（体积比为24:1），旋涡混匀，13新离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，13000rpm离心5min，弃去上清液，75%乙醇洗涤两次（13000rpm离心30s弃去上清液），室温3DB15/T2025—2020管上层乳脂和中间层的液体，保留底部沉淀；向离心管中加入600μL），），后续提取步骤按照7.2.1方法进行。用灭菌水代替样品进行核酸抽提作为提取空白对照。也可以使用同ng/μL时，建议用灭菌水稀释；若浓度小于10ng/μL或比值小于1.7时，建议重新进行DNc=A×N×50/1000„„„„„„„„„„„（1）c—DNA浓度，单位为微克每微升(μg/μL设置阳性对照、阴性对照、空白对照以及提取空白对照。所有样品设置平行反应。实时荧光PCR反应体系见表2。反应程序根据不同厂家的商品试剂盒或不同型号的实时荧光PCR仪进4DB15/T2025—2020b)阴性对照：特异性探针无荧光对数增长或9结果判定与表述9.1结果判定9.2结果表述9.2.1样品阳性，表述为“检出牛或/和猪源性成分”。9.2.2样品阴性，表述为“未检出牛或/和猪源性成分”。5DB15/T2025—2020A.1牛特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（120bp）及引物和探针位置TTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTAAACGGCTACATGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGA.2猪特异性基因实时荧光PCR扩增产物核苷酸序列（121bp）及引物和探针位置TTGAATAAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAGCATG