CN120210078A 贝莱斯芽孢杆菌Bvcon2及其在大菱鲆养殖中的应用

(83)生物保藏信息(71)申请人烟台市海洋经济研究院(烟台市渔业技术推广站、烟台市海洋捕捞增殖管理站)地址264003山东省烟台市莱山区银海路32号内2号A61PA23KA23K31/04(2006.01)10/18(2016.01)50/80(2016.01)(72)发明人王亮刘晓丹赵晓伟王鹤刘燕英张岚汲生磊王玥(74)专利代理机构北京中济纬天专利代理有限公司11429专利代理师马国冉(54)发明名称中的应用本发明公开了贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2及其在大菱养殖中的应用，属于微生物技术领域。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2024年12月27日，保藏编号为CCTCCNO:M20242926.本发明的有益之处在于：该菌株对大菱无致病性，具有良好的益生潜力，将其发酵制成菌剂并拌饲添加投喂大菱后，不仅可以促进养殖大菱生长、提高大菱鲜胰蛋白酶和超氧化物歧化酶活性、改善大菱肠道菌群结构、提升大菱肠道微生物多样性水平，还可延缓大菱因感染杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌21.贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2,分离自海参养殖池，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2BacillusvelezensisBv-con2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2024年12月27日，保藏编号为CCTCCNO:M20242926。2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2在大菱养殖中的应用，其特征在于，所述应用包括：(1)在制备提高大菱生长性能的菌剂中的应用，所述生长性能包括体长和体重；(2)在制备促进大菱消化吸收营养物质的菌剂中的应用；(3)在制备改善大菱鲠肠道菌群结构的菌剂中的应用；(4)在制备抗杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌BH2-4和恶臭假单胞菌PPD2中的任意一种或几种病原菌感染的菌剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌剂的制备方法如下：将贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2接种于发酵培养基中，在36-38℃下发酵48h,得到浓度≥1×10⁸CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2发酵液，其中，所述发酵培养基的15g/L,玉米粉6-10g/L,酵母膏3-5g/L,磷酸二氢钾0.1-3g/L,硫酸镁0.5-1g/L,pH=5.5-3技术领域[0001]本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2及其在大菱鲜养殖中的应用，属于微生物技术领域。背景技术地区重要的海水养殖种类。但随着养殖规模的扩张，种质退化、水质恶化、冰鲜杂鱼投喂等因素导致养殖大菱病害频发。因盲目用药，不仅造成致病菌耐药，也使得渔药在鱼体内大量残留，影响水产品质量安全，严重阻碍了产业的绿色健康发展。如何减少抗生素类渔药使用，寻求绿色健康防病手段是破解当前病害问题的最佳途径。[0003]益生菌的使用可实现病害源头防治，在减少病原菌侵害、强化饲料营养结构、提高消化性能、增强机体抗逆性能以及改善养殖水体环境等方面发挥了积极作用，已成为水产养殖业中改善养殖生物健康状况的有效策略之一。[0004]芽孢杆菌(Bacillus)是一类杆状、能够产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有抗逆性的同时还具有广谱抑菌活性，在生物防病中具有显著优势。[0005]贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)作为芽孢杆菌的新种，在生长与繁殖过程中可以产生多种活性抑菌物质，其代谢产物具有广谱的抑菌活性，常被用于农作物、养殖发明内容[0006]本发明的目的在于：提供一株来源于环境(海参养殖池)、可促进大菱生长发育、改善大菱肠道菌群结构、提高大菱鲜免疫力的贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2及其作为大菱鲠益生菌在大菱养殖中的应用。[0007]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2,分离自海参养殖池，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2BacillusvelezensisBv-con2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国[0008]前述贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2在大菱养殖中的应用，所述应用包括：(1)在制备提高大菱生长性能的菌剂中的应用，所述生长性能包括体长和体重；(2)在制备促进大菱消化吸收营养物质的菌剂中的应用；(3)在制备改善大菱肠道菌群结构的菌剂中的应用；(4)在制备抗杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌BH2-4和恶臭假单胞菌PPD2中的任意一种或几种病原菌感染的菌剂中的应用。将贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2接种于发酵培养基中，在36-38℃下发酵48h,得到浓度4≥1×10⁸CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2发酵液，其中，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖6-15g/L,玉米粉6-10g/L,酵母膏3-5g/L,磷酸二氢钾0.1-3g/L,硫酸镁0.5-1g/L,pH=[0010]本发明的有益之处在于：(1)本发明筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2对大菱无致病性，且从基因层面解析发现其具有良好的益生潜力；(2)本发明筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2的发酵液(菌剂)拌饲投喂养殖大菱鲠时，可以促进养殖大菱鲜生长，提高大菱鲠消化相关酶(胰蛋白酶)和抗氧化相关酶(超氧化物歧化酶)活性，改善大菱肠道菌群结构，全面提升大菱鲠肠道微生物多样性水平；(3)拌饲投喂60天后，大幅提高了大菱的机体免疫力，尤其感染大菱常见病原菌(杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌BH2-4、恶臭假单胞菌PPD2)后，死亡情况较对照组明显好转。试验结果表明有效提高大菱仔鱼抗病力。附图说明[0011]图1是菌株Bv-con2的革兰氏染色结果图。具体实施方式[0012]以下结合具体实施例对本发明作具体介绍。2024年02月，在位于山东省烟台市蓬莱区某海参养殖场的海参养殖池进水口、池底中央、排水口3个不同区域多点采集环境底泥样品，采样点去除表层浮泥后，取5-10cm深层底泥。每个位点取底泥样品100g,分别装于无菌密封袋中，-80℃保存备用。取每个位点底泥样品10g,加90mL无菌PBS缓冲液震荡混匀，然后加入直径0.1-0.5mm的灭菌玻璃珠涡旋震荡10min,之后于5000rpm离心5min,取上清。重复操作2次，合并上清液，分别制成进水口环[0014]将上述环境微生物样品进行10⁻¹至10⁻5梯度稀释，每个梯度分别取10μL涂布于添加有2wt%NaCl的营养琼脂平板上，在28℃条件下倒置培养48h,从中挑取不同形态的菌落(共计26个)分别进行纯化培养，直至获得纯培养物，最后用终体积分数为4[0015]将纯化好的26株菌株进行16SrRNA序列测定、比对，从中选取具有潜在益生功能的菌株开展后续试验。初步筛选出一株来源于海参养殖池排水口环境微生物样品，10⁻³梯度稀释后分离获得的菌株用于后续试验，将该菌株记为Bv-con2。[0016]二、菌株Bv-con2的形态特征及生理生化特性菌株Bv-con2在营养琼脂培养基上呈乳白色、不透明状，菌落表面粗糙、正中隆起、有褶皱。[0017]菌株Bv-con2的革兰氏染色结果见图1。染色结果显示：菌株Bv-con2为革兰氏阳性短杆菌。5用大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒对菌株Bv-con2进行IMVC生化系统鉴定。鉴[0019]三、菌株Bv-con2的鉴定及全基因组信息(1)16SrRNA测序比对用细菌16SrRNA通用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(SEQIDNo:2)、增，得到菌株Bv-con2的16SrRNA核苷酸序列(SEQIDN[0020]经NCBI在线BLAST同源性比对，结果显示：菌株Bv-con2与菌株BacillusvelezensisCBMB205(NR_116240.1)相似度为97.68%。[0021]初步判定菌株Bv-con2为贝莱斯芽孢杆菌。菌株Bv-con2与菌株BacillusvelezensisCBMB205平均核苷酸同源性(ANI)在97.87%～99.82%之间，基因组数字DNA杂交值(dDDH)在78.22%～86.41%之间，与其它芽孢杆菌ANI值低于分类阈值95%,dDDH值低于70%。[0023]鉴定结果：结合16SrRNA测序结果及生理生化特征鉴定结果，确定菌株Bv-con2为贝莱斯芽孢杆菌，记为贝莱斯芽孢杆菌Bv-con2(拉丁文学名：BacillusvelezensisBv-为更好地了解菌株Bv-con2的基因组信息，用试剂盒提取菌株Bv-con2的全基因组DNA,在IlluminaHISsq平台完成全基因组测序工作。使用FastQC对样本的测序数据进行统(1)菌株Bv-con2基因组全长为3891358bp,GC含量为46.39%,基因预测结果显示：共注释到3840个编码基因，编码基因总长度3473842bp,功能基因覆盖基因组总长度的[0025](2)在原核生物COG数据库注释到21类2939个编码基因，其中，注释到氨基酸转运[0026](3)在基因功能分类体系GO数据库注释到3376个基因，注释的编码基因中分别有61.55%、26.07%及12.38%的编码基因参与生物过程、分子功能与细胞组成。[0027](4)在KEGG生物系统数据库注释到1630个基因，其中，参与代谢的编码基因最多，占77.67%。[0028](5)将基因集蛋白序列与CAZy数据库比对，注释到65个碳水化合物活性酶基因，其[0029](6)菌株蛋白总数目3749个，其中，预测到CYT胞浆蛋白2793个，肽蛋白251个。将保存于-80℃冰箱中备用的菌株Bv-con2接种于添加有2wt%NaCl的营养琼脂平板中进行活化，然后挑取指数生长期的单菌落于营养肉汤中，28℃震荡扩大培养，收集培养6[0031]购置平均体重为0.91g±0.06g的健康大菱仔鱼(健康的表现为：个体有活力，体表无明显病灶，体表和鳃经显微镜观察无寄生虫感染),暂养一周，然后随机分成低浓度注射组、中浓度注射组、高浓度注射组、注射对照组和空白对照组，每组10尾大菱仔鱼。[0032]低浓度注射组、中浓度注射组和高浓度注射组分别注射浓度为10'CFU/mL、10CFU/照组不做任何处理。然后密切观察各组大菱鲠仔鱼的死亡情况。尾大菱鲜仔鱼死亡，注射对照组和空白对照组各有1尾大菱鲠仔鱼死亡，未死亡的大菱仔健康大菱鲜相对安全。[0034]此外，在基因注释中并未注释到致病性芽孢杆菌常见的溶血素BL、肠毒素NHE等相关毒力基因，并且菌株Bv-con2的毒力因子注释比例仅为5.87%。由此可以确定：菌株Bv-con2基本无致病力。为了获得大量高密度菌液，以通用培养基碳源和氮源为基础，对培养基配方及发酵条件进行优化，优化后的培养基配方及发酵条件分别如下：培养基配方：葡萄糖6-15g/L,玉米粉6-10g/L,酵母膏3-5g/L,磷酸二氢钾0.1-3g/L,硫酸镁0.5-1g/L,pH=5.5-7.0。[0036]发酵条件：种子液添加比例1%,发酵温度36-38℃,发酵时间48h。[0037]在本具体实施方式中，培养基配方具体为：葡萄糖8g/L,玉米粉5g/L,酵母膏3g/L,磷酸二氢钾0.1g/L,硫酸镁0.05g/L,pH=6.0。在37.5℃下发酵48h后，发酵液(即菌剂)浓度达到了2.6×10⁹CFU/mL。[0038]将发酵液的浓度调整至1×10⁸CFU/mL,用于进行后续益生菌添加实验，将该发酵液记为菌剂Bv-con2。将初始体重0.82±0.01g、体长2.81±0.02cm的大菱仔鱼随机分成添加组和对[0040]对照组投喂从市面上购买得到的鲠蝶类颗粒饲料，每天早晚各投喂1次，按照体重3%投喂日粮；添加组投喂添加有菌剂Bv-con2的同种饲料，每天早晚各投喂1次，按照体重3%投喂日粮。[0041]添加组投喂的添加有菌剂Bv-con2的同种饲料的配制方法具体如下：将菌剂Bv-con2(浓度1×10⁸CFU/mL)按照25mL:100g的比例均匀喷洒至从市面上购买得到的鲠蝶类颗粒饲料上，混合均匀后晾干投喂。为保证活菌数量，添加组投喂的添加有菌剂Bv-con2的饲料每日新鲜配制。[0042]1、饲料添加菌剂Bv-con2对大菱仔鱼生长性能的影响投喂60天后，添加组和对照组每个平行随机取样15尾，测量体长、体重，分析添加组和对照组的增重率、特定生长率等生长指标。7特定生长率(SGR,%/d)=[(1nW-1nW)/t]×100%[0044]添加组和对照组大菱仔鱼平均体长和平均体重的统计结果以及增重率和特定生长率的计算结果见表1。[0045]表1饲料添加菌剂Bv-con2后大菱仔鱼生长指标的变化[0046]注：同一列中相同的上标字母表示组间差异不显著(p>0.05),不同的上标字母表示组间有显著差异(p<0.05)。[0047]由表1可知：添加组大菱仔鱼的平均体重、增重率、特定生长率均较对照组差异[0048]以上结果说明：饲料中添加菌剂Bv-con2能够有效促进大菱鲠仔鱼生长。[0049]2、饲料添加菌剂Bv-con2对大菱鲠仔鱼消化、抗氧化相关酶活性的影响投喂60天后，添加组和对照组每个平行随机取样9尾，在冰盘中迅速解剖并分离肝脏，用预冷的灭菌PBS溶液冲洗，滤纸吸干水分。在冰水浴条件下，将肝脏样品和9倍体积的无菌生理盐水匀浆，然后在4℃条件下4000r/min离心10min,收集上清液，获得10%肝脏匀浆[0050]用试剂盒测定上述肝脏匀浆液中胰蛋白酶(TPS)、脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AMS)等消化酶的活性和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(ALP)等氧化酶的活[0051]添加组和对照组大菱仔鱼肝脏中各消化酶和各氧化酶的活性测定结果见表2。[0052]表2饲料添加菌剂Bv-con2后大菱仔鱼肝脏中各酶的活性变化[0053]注：同一列中相同的上标字母表示组间差异不显著(p>0.05),不同的上标字母表示组间有显著差异(p<0.05)。[0054]由表2可知：除淀粉酶(AMS)和过氧化氢酶(CAT)以外，添加组大菱鲜仔鱼肝脏中的8各消化酶和各氧化酶的活性均高于对照组，其中，胰蛋白酶(TPS)、超氧化物歧化酶(SOD)差异显著,脂肪酶(LPS)、碱性磷酸酶(ALP)差异不显著。[0055]上述结果与菌株Bv-con2的全基因组预测信息一致。全基因组测序信息提示：菌株Bv-con2可能具有降解纤维素、几丁质及淀粉的能力，可用作饲料添加剂或有机废物降解[0056]以上结果说明：添加菌剂Bv-con2可以在一定程度上促进宿主大菱鲠仔鱼对营养物质的消化吸收，并且增强免疫能力。[0057]3、饲料添加菌剂Bv-con2对大菱鲠仔鱼肠道菌群多样性的影响投喂60天后，添加组和对照组每个平行随机取样9尾，对添加组和对照组大菱鲠仔鱼的肠道菌群多样性进行检测，检测结果见表3。[0058]表3饲料添加菌剂Bv-con2后大菱鲠仔鱼肠道菌群多样性的变化辛普森指数[0059]由表3可知：在评价菌群多样性的香农指数、辛普森指数、ACE指数、Chao指指数五个指标中，添加组数值均高于对照组(差异不显著),添加组大菱仔鱼肠道菌群丰度更高。[0060]以上结果说明：添加菌剂Bv-con2在一定程度上丰富了大菱仔鱼肠道微生物种类，增加了大菱鲜仔鱼肠道微生物多样性程度。[0061]经分析，投喂60天后，添加组增加了大菱鲠仔鱼肠道核心菌群变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteriota)的丰度，尤其增加了红杆菌、疣微菌和乳酸杆菌等细菌的丰度。[0062]综上，添加菌剂Bv-con2不仅可以提高大菱仔鱼肠道核心菌群数量，还可以增加大菱仔鱼肠道微生物丰度与多样性水平，对大菱仔鱼抵御外界不良环境具有积极作[0063]七、饲料添加菌剂Bv-con2对大菱仔鱼抗病力的影响选取杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌BH2-4、恶臭假单胞菌PPD2进行人工感染。以上菌株均是大菱常见的病原菌。[0064]将杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌BH2-4、恶臭假单续人工感染。[0065]另外，将上述调整好浓度的病原菌按照体积比1:1:1:1进行混合，制作成混合病原9菌备用。益生菌添加实验结束后，将添加组和对照组的大菱仔鱼暂养一周，暂养期间投[0067]添加组和对照组每个平行随机取样60尾，添加组(180尾)和对照组(180尾)均分成6个注射组(5个注射病原菌组及1个注射对照组),每个注射组30尾。其中，5个注射病原菌组分别单独腹腔注射上述调整好浓度的杀鲑气单胞菌BHAS-1、杀鱼爱德华氏菌H4-S18、副乳房链球菌BH2-4、恶臭假单胞菌PPD2及混合病原菌100μL,注[0068]感染后每天观察并记录各注射组大菱仔鱼的死亡数量，人工感染10天后停止实验，统计各注射组大菱鲜仔鱼的存活数量。(1)对照组：在注射病原菌后，第2天开始出现死亡，第4天和第5天死亡持续增加，出现死亡高峰，从第6天开始死亡数量逐渐减少；[0070]各注射组大菱鲠仔鱼的存活数量统计结果见表4。[0071]表4各注射组大菱鲠仔鱼的存活数量统计结果28尾25尾10尾27尾2尾23尾5尾20尾3尾30尾30尾(1)对照组：注射不同病原菌后，感染大菱仔鱼存活率分别为26.67%(注射杀鲑气单胞菌BHAS-1)、33.33%(注射杀鱼爱德华氏菌H4-S18)、6.67%(注射副乳房链球菌BH2-(2)添加组：注射不同病原菌后，感染大菱仔鱼存活率分别为93.34%(注射杀鲑气单胞菌BHAS-1)、83.34%(注射杀鱼爱德华氏菌H4-S18)、90.00%(注射副乳房链球菌BH2-[0073]对比添加组和对照组的死亡情况可知，外源添加菌剂Bv-con2可以有效抵御杀鲑病原菌感染导致的大菱发病死亡，大幅降低大菱鲠死亡率。[0074]3、人工感染后免疫相关基因的表达量变化人工感染实验结束后，取添加组和对照组注射病原后仍存活的全部个体，在冰盘中迅速解剖并分离肝脏，用预冷的灭菌PBS溶液冲洗，滤纸吸干水分，得到2份肝脏混合样[0075]称取20mg添加组肝脏混合样品和对照组肝脏混合样品，分别置于液氮中研磨，用仪中进行实