（正式版）DB65∕T 4204-2019 《绵羊幼羔体外胚胎生产技术操作规程》

绵羊幼羔体外胚胎生产技术操作规程2019-08-01实施2019-08-01实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布IDB65/T4204—2019本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编写。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本标准由新疆维吾尔自治区标准化技术委员会技术归口。本标准主要起草单位：新疆畜牧科学院生物技术研究所(新疆畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心)、新疆维吾尔自治区畜牧总站。李晓林、唐森、黎霞、蒋晓梅、程黎明、张建光、黄俊成。本标准实施应用中的疑问，请咨询新疆畜牧科学院生物技术研究所/新疆维吾尔自治区畜牧总站。对本标准的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)、新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市新华南路408号)、新疆畜牧科学院生物技术研究所(乌鲁木齐市经济技术开发区阿里山街468号)、新疆维吾尔自治区畜牧总站(乌鲁木齐市新华南路408号)。新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话传真邮编：830004新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话传真邮编：830004新疆畜牧科学院生物技术研究所联系电话传真邮编：830000新疆维吾尔自治区畜牧总站联系电话传真邮编：8300041本标准规定了绵羊幼羔供体的选择、激素处理、活体手术采卵、体外受精、体外培养等技术操作规程。本标准适用于绵羊幼羔体外胚胎生产技术操作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY/T1571羊胚胎移植技术规程DB65/T4073成年绵羊体外胚胎生产技术操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。供体donor可用于体外胚胎生产、出生4周至8周龄的绵羊母羔。绵羊幼羔体外胚胎生产juvenileinvitroembryotransfer对绵羊幼羔使用能促进卵泡发育的激素进行处理，再通过活体采卵、体外成熟、体外受精、体外培养等一系列操作的技术。4绵羊幼羔供体的选择选择体质健壮、无疾病史、谱系清楚、体重、毛色、体型等特征符合品种要求、出生4周至8周龄绵羊母羔，作为幼羔体外胚胎生产的供体。5供体绵羊幼羔的激素处理药品及器材见附录A。5.2供体激素处理方法2供体每天早、晚分别肌肉注射1次FSH(间隔12h),连续注射2d,共4次，每次注射FSH剂量为506供体活体手术采卵供体手术采卵过程如下：a)术前准备：在供体注射完第4次FSH时，禁饮禁食。将手术室清洁消毒，室温维持在20℃~25℃之间；b)麻醉及保定：肌肉注射静松灵0.1mL～0.15mL,仰卧于手术架上并保定；c)备皮消毒：手术部位在离乳房前端约2cm处，腹中线两侧均可。刮毛刀刮去肥皂水湿润的手术部位羊毛，用加有新洁尔灭的消毒水清洗干净。将2%～4%的碘酒涂抹于手术部位消毒5min,再用75%酒精对手术部位脱碘；d)手术：在手术部位覆盖手术创布并固定。避开血管，用手术刀将手术部位纵向切开3mm～5mm长的创口，使皮下结缔组织分离，暴露肌膜。用手术刀将肌膜轻轻切开，暴露肌肉层，再用刀柄后端将肌肉层和腹膜钝性分离。食指和中指从创口进入，在骨盆腔、耻骨前沿触摸子宫角，并小心地将子宫、卵巢引出创口外；e)活体采卵：用齿部包裹橡胶管的止血钳夹住卵巢系膜，预防抽卵时卵巢大量出血。将带有8号针头的10mL注射器吸取2mL～3mL抽卵液，抽吸突出卵巢表面的卵泡，边抽吸卵泡，边用35℃盐水喷洒卵巢表面，以湿润卵巢并减少出血。回收卵泡液约6mL时，推入经抽卵液湿润的试管，放入置于37℃水浴锅内的试管架上沉淀5min～10min。全部卵泡抽吸完后，用温盐水反复冲洗卵巢、输卵管及子宫等暴露于体外的组织，在卵巢上均匀涂抹油剂青霉素后，缓慢从创口送入腹腔，向腹腔内倒入250mL甲硝唑，以预防术后粘连；f)缝合：用可吸收缝合线缝合肌肉层后，在切口上均匀洒磺胺结晶粉后，再缝合皮肤层，喷碘酊g)捡卵：弃去试管内卵泡液上清，留约2mL沉淀液，倒入60mm培养皿内，用抽卵液洗涤试管底部3次，一并倒入培养皿，在体视显微镜下捡出所有卵母细胞。7卵母细胞的体外成熟培养提前3h将加有0.6mL/孔体外成熟培养液的四孔板和3mL/管体外成熟培养液的试管，放置于38.6℃、5%CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中平衡。将捡出的卵母细胞用抽卵液洗涤3次，再用体外成熟液洗涤3次，按50枚～70枚/孔放入四孔板内，在二氧化碳箱内培养24h～26h。8体外受精按照DB65/T4073的要求，对体外成熟培养24h～26h的羔羊卵母细胞进行体外受精操作。9体外受精按照DB65/T4073的要求，对羔羊供体的体外受精胚胎进行体外培养操作。A.2.2所需主要器材器(8号针头)、持针钳、圆针、三棱针、缝合线、圆底试管、水浴锅。SOF配方：6.29mg/mLNaCl+0.534mg/mL