简易合成的细胞器靶向碳点研究

[8]。因此推断位于260nm的峰是因C=C键π-π*跃迁导致的，而位于328nm处的峰与C=O、C=N中的n-π*跃迁有对应关系。此外，从图中NCDs溶液对日光和紫外光的响应图的对比可以看出，在日光下NCDs呈褐色，而在紫外光线激发下，该NCDs发光的颜色是亮黄色的（UV365nm）。其次，可以从荧光光谱（图3.3b）中看出NCDs的最大激发波长EX为410nm左右（紫线），荧光发射波长EM峰值在560nm左右（黄线）。除此之外，实验还绘制了不同激发波长下的3D荧光光谱（图3.3c），可以从图中看出不同激发波长条件下，荧光发射波长随之改变的情况。从图中可以看出，该CDs具有一个发射中心，且发射不依赖于激发。图3.3(a)NCDs的UV-vis吸收光谱（红线）以及NCDs溶液对日光和紫外光的响应图；(b)激发光谱（紫线）、最大激发波长下的发射光谱（黄线）；(c)不同激发波长下的3D荧光光谱三、NCDs的稳定性在复杂的实际应用场景中，碳点会处于弱酸甚至强酸的环境中（比如动物的消化系统），因此，除了结构表征和光学表征之外，对于碳点的稳定性及生物相容性也提出了很高的要求。对此，实验对NCDs在NaCl溶液、不同离子强度、不同pH值和不同辐照时间等多种环境下的荧光强度进行了测试。先用NCDs与不同浓度的氯化钠溶液混合探究此条件下NCDs的荧光光强，NaCl是经典的盐类。通过NaCl浓度的变化来模拟生理盐水（生理盐水是渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液0.9%的氯化钠溶液）等环境，以此观察NCDs的稳定性，确保碳点在人体血液等其他生物体的组织、器官应用场景中能够保持其荧光效果。（图3.4a）NaCl溶液浓度从0μm到1000μm，间隔100μm。由图中可得，随着NaCl浓度的逐渐提高，NCDs光强仅略微发生改变，且波动的范围很有限。因此NaCl的浓度并不会造成荧光光强的减弱或增强，这意味着NCDs具有在高浓度NaCl溶液的样本或者生物组织中靶向脂滴的可能性。接下来评估了NCDs在长时间紫外灯照射下的光稳定性，用紫外光UV365nm照射NCDs一个小时，由（图3.4b）可见，随着时间的推移，NCDs荧光光强几乎没有改变，说明NCDs具有良好的光学稳定性，能够在稳定激发的情况下持续输出稳定的荧光。同时，pH也是重要的外界环境因素，不同pH值下NCDs的归一化荧光强度(图3.4c）展示了NCDs在不同pH值下的荧光稳定性。在强碱环境下（pH>11），荧光强度开始降低。因此，NCDs不适用于检测强碱环境中的细胞-。而另一方面，NCDs在强酸和中性（pH4~10）环境下，荧光强度没有太大的改变，表现出良好的荧光稳定性，即NCDs能在强酸和中性环境下具有良好的稳定性。人体细胞的pH值在中性pH值范围（正常范围在7.35-7.45之间），因此NCDs有着在人体细胞活组织内检测脂滴的可能性。在pH大于10的情况下，NCDs的检测能力一般，针对于此实验加入了多种在细胞中常见离子探究哪种离子能有效增益NCDs的强度（图3.4d）如图所示，发现加入Cu2+后，可以大幅增强NCDs的荧光强度，而其余离子的存在对NCDs的荧光响应几乎没有影响,Cu2+其效果显著是别的离子的两倍。接着实验研究了向NCDs溶液中加入Cu2+后，NCDs的荧光强度随pH的变化，可以看出，Cu2+使NCDs在pH4~11都可以保持两倍于单独NCDs强度的效果（图3.4c）。综上所述，本文提出的NCDs具有良好的化学稳定性、光学稳定性等优点。NCDs的优良稳定性使其有望作为真实复杂环境样品中检测脂滴的荧光探针，而良好的生物相容性，为其在生物方面的应用打下了基础。图3.4(a)不同浓度的NaCl溶液下NCDs的归一化荧光强度；(b)紫外光照射下NCDs的归一化强度响应随时间的变化；(c)不同pH值下NCDs的归一化荧光强度；(d)Cu3+离子对NCDs的增益效果四、NCDs靶向脂滴及成像质量的分析为了对实验的效果有更加直观深入的研究，实验针对碳点靶向脂滴的效果做了更高级的表征，利用共聚焦显微镜先对已被碳点染色细胞进行表征(图3.4a）,可以看出细胞内外的各种物质、细胞器等有明显的分散不均状态，图中被标记脂滴球状明显清晰。其次，在观察下488nm激发NCDs靶向细胞后的细胞可以明显看到绿光碳点发出的荧光（图3.4b）,能对细胞内的脂滴进行精准的附着。将两幅图重合在一起可以直观的看出脂滴在细胞内的分布情况（图3.4c）,可以从图中看出，实验制备的NCDs具备较高的靶向质量和荧光效果。从共聚焦显微镜的结果来看，实验制备的NCDs基本达到了预期的实验目的：靶向脂滴，因为脂滴在细胞中的位置大部分都在细胞质图3.4(a)NCDs靶向脂滴后的共聚焦显微图；(b)共聚焦显微镜下488nm激发通道图；(c)merge通道混合此外，还做了细胞共定位实验（图3.5），紫色是脂滴商用染料BODIPY640，绿色是碳点，粉白色的是merge混合通道，从共定位选区（图中的黄线所连接的区域，共定位系数0.76）可以看出本文提出的碳点基本能和商用脂滴染料的成像质量媲美，可以对脂滴细胞进行定位，NCDs与BODIPY640荧光强度分布也接近。图3.5(a)bodipy640靶向脂滴；(b)merge通道混合；(c)NCDs靶向脂滴第四章总结本文提供了一种靶向脂滴的掺氮碳点NCDs的制备工艺，并对其进行了简化，还对碳点的物化特征和光学特征进行了表征；除此之外，还借助共聚焦显微镜观察在实际应用碳点靶向脂滴中的效果，与商用脂滴染料进行了细胞共定位实验的对比。在本文中主要优化了以下内容：一是简化制备工艺。本文提出的掺氮碳点NCDs的制备可以概括为“一烘两透一冻”。期间制备过程对环境等要求不高，制备流程简明，去除了冗余的步骤。二是在简易合成的基础上，尽可能的让该碳点发挥出最好的荧光效果。这点在与其他商用染色剂的荧光效果进行对比的过程中，证明了碳点是具备靶向脂滴的能力的，荧光效果也较为明显。由于时间有限，靶向细胞器碳点的原理、设计及制备还有许多内容尚未研究，针对以后的研究有以下几点思考：因对特定细胞器摄取方式的模糊和对碳点表面官能团设计偏差，可能会让所制备的碳点靶向效果不佳或者荧光能力不强，应在过往文献提供的经验和思路上做合理大胆的尝试和研究。在针对未来碳点的实际生物应用或者临床研究关注碳点是否会被其他细胞内的物质影响靶向和荧光能力，尤其关注碳点发出的光是否会被细胞内的其他细胞器或者物质吸收，从而抑制了其荧光能力。针对人体内的细胞等特殊的生物体设计制备的碳点要尽可能避免碳点对正常生理过程是否会造成意外的影响，避免对生物体产生不可逆转的副作用。针对碳点的研究应追求更高时间分辨率，以追踪更快的细胞动态，观察到更多细节，为生物医学、病理学等领域提供更加细致的数据和信息。本文提出的工艺虽然简易，但因烘烤碳点过程中的高温条件无法在考虑成本的情况下进行推广，无法实现量产。因此探究一种可以规模化、产业化的碳点对于其发展至关重要，这对碳点的设计和工艺的优化都提出了挑战。

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