上海交通大学医学院分子生物学课程第二章-RNA-2

第四节调节基因表达的RNA一、RNA干扰（RNAinterferenc，RNAi）的发现1990年，Napoli矮脚牵牛花实验在牵牛花PlantCell,1990

1995年，郭苏和导师坎菲思（KennethKemphues）《Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditis

elegans》1998年，安德鲁·法尔（AndrewZ.Fire）克雷格·梅洛（CraigC.Mello）Nature,1998秀丽新小杆线虫par-1基因Cell,1995第一篇以“RNA干扰”命名该现象及阐述机制的文章2001年，托马斯·塔什尔（ThomasTuschl）2001年，美国《科学》杂志评选年度十大科学进展

ElbashirSMandTuschlT.Nature,2001第一篇探讨哺乳动物细胞中RNA干扰现象的文章《Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells》2002年，美国《科学》杂志评选年度十大科学进展之首

2001年，BernsteinE分离鉴定果蝇Dicer《Roleforabidentate

ribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference》Nature,2001

2006年，JenniferDoudnaX射线衍射晶体分析技术《Structurebasisfordouble-StrandedRNAprocessingbyDicer》Science,2006纯化并结晶

Giardia

intestinalis

Dicer

2006年，美国斯坦福大学医学院安德鲁·法尔（AndrewZ.Fire）"fortheirdiscoveryofRNAinterference–

genesilencingbydouble-strandedRNA"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006AndrewZ.FireCraigC.Mello马萨诸塞大学医学院克雷格·梅洛（CraigC.Mello）获得诺贝尔医学和生理学奖二、RNA干扰(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)的一种形式。RNAi是指外源双链RNA进入细胞后，引起与其序列同源的特异基因mRNA

降解的现象－－属于转录后基因沉默antisense－－转录水平﹡knock-out－－DNA水平RNAi－－转录后水平基因沉默优点：①方便快捷②高特异性功能：分析特定基因在细胞内的功能。③高效性④作用广泛性“ImmuneSystem”oftheGenome

①

AntiviralDefense②

SuppressTransposonActivity③

ResponsetoAberrantRNAs三、RNA干扰机制1、启动阶段：dsRNA被Dicer逐步切割成siRNA

（smallinterferingRNA

）

2、效应阶段:①

Risc形成：siRNA与蛋白质聚集形成Risc（Risc，RNA-inducedsilencingcomplex）②Risc激活：siRNA双链解开。③激活的Risc定位到同源mRNA上，降解该mRNARiscRiscRisc5`3`四、RNA干扰过程中的关键元件1.dsRNA（doublestrandRNA）①RNA病毒：ssRNAdsRNARNA指导的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase,RdRp）RdRp3`OH5`p5`p3`OH3`OH5`pRdRp②人工导入dsRNA2.DicerRNaseIII家族成员－－核酸内切酶，特异性识别并切割dsRNA

dsRNA结合结构域（dsRNA-bindingdomain,dsRBD）RNaseIII催化结构域解旋酶结构域（helicasedomain）dsRNAsiRNADicerafrontviewofthecrystalstructureofGiardia

intestinalisDicer

ATP依赖PAZ结构域3.siRNAduplex结构：双链3`端突出2个核苷酸21～23个核苷酸3`OH5`p5`p3`OH21nucleotides2ntoverhang4.Risc（RNA-inducingsilencingcomplex）RNA诱导的沉默复合物组分：siRNAAgo（Argonauteproteinfamily）－－结合募集siRNARNAhelicase（RNA解旋酶）－－形成单链siRNA……RiscRisc正义链反义链反义链激活的RiscATP依赖RNase（内切酶、外切酶）－－切割目标mRNA3`OH5`pRisc反义链降解5.RdRp（RNAdependentRNApolymerase）RNA依赖的RNA聚合酶放大效应：微量siRNA，明显干扰效应可能机制：①

siRNA

重复利用②目的mRNA直接扩增3`OH5`pRdRpRisc反义链激活的Risc5`3`DicersecondarysiRNAprimarysiRNAmechanismofRNAi脱靶效应（off-target）②正义链干扰③

反义链seed-region活性①剂量依赖RiscRiscATP依赖（+）（-）（+）（-）Risc（-）mRNARisc（+）off-targeton-target正义链干扰反义链seed-region活性（+）（-）5`5`3`3`seedregion2~7核苷酸（-）RiscmRNAmRNAmRNARiscRisc3`3`5`5`3`5`五、RNA干扰研究的一般技术路线1、目的基因的确定2、siRNA序列的设计3、获得siRNA产物4、siRNA转移5、RNA干扰效果检测siRNA序列的设计：一般设计原则（1）从mRNA的AUG起始密码子（避开5‘和3’端的非翻译区）开始，寻找“AA”二连序列，并记录其3‘端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。GC含量在30%～50%左右的siRNA为宜。

（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除可能的同源序列。（3）选出合适的靶序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，找到最有效的siRNA序列。

（4）设置合理的阴性对照：scramblesiRNA

与siRNA组成相同，但序列不同。获得siRNA产物（1）化学合成－－已知有效的siRNA。（2）体外转录－－筛选siRNA。（3）Dicer（RNaseIII）降解dsRNA－－快速经济地研究某个基因功能。200～1000nt体外转录dsRNA目的基因Dicer①②③siRNAmixture（4）siRNA表达载体（5）siRNA表达框架siRNA转移（1）脂质体介导的转染（2）病毒介导的感染（3）电穿孔RNA干扰效果检测（1）mRNA：RT-PCR、定量PCR、Northern。（2）蛋白质：Western、ELISA、免疫荧光（3）生理生化表型参数：六、微小RNA（microRNA，miRNA）1、miRNA：广泛存在于真核细胞中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，由约22nt组成的单链RNA。2、miRNA的发现：《TheC.elegansheterochronicgenelin24encodessmall

RNAs

withantisensecomplementaritytolin-14》1993年，Leeetal，Cell线虫，lin-4→lin-142000年，Reinhartetal，Nature线虫，let-7《The21nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditis

elegans》拟南芥，水稻斑马鱼，果蝇鼠，人3、miRNA的成熟：①

长的内源性转录本（pri-miRNA）②70nt茎环结构miRNA前体（pre-miRNA）③

miRNA双链④

miRNA单链-Risc复合物microRNA基因组pri-miRNApre-miRNApre-miRNAmiRNAduplexDicer单链miRNADrosha

RNaseRisc活化miRNA胞核胞浆Exportin53`5`5`3`miRNAduplexRisc（+）（-）Risc（+）（-）目标mRNA3`5`4、miRNA与目标mRNA的作用模式：①3`UTR不完全互补，抑制翻译。②编码区完全互补，降解mRNA。（类似siRNA与目标mRNA的结合与降解）③上述两种模式均具备。5`5、miRNA的生理功能：时空性表达（组织特异性和阶段特异性）→控制个体发育3`5`3`lin-4：第一、二期let-7：第三、四期和成虫期

miRNA

产生：基因组（正常）来源：内源转录本直接来源：发夹状pre-miRNA

结构：单链互补性：不完全互补或完全互补特异性：相对较低

作用部位：3`UTR或编码区

对基因的影响：抑制翻译或降解目标mRNA

生理功能：调节内源基因的表达控制个体发育

siRNA

病毒感染、转座子移位、导入dsRNA（异常）病毒RNA或转基因（外源）

长链dsRNA

单链

完全互补较高

编码区或UTR

降解目标mRNA

抵抗病毒感染、抑制转座子活性miRNA与siRNA的比较：均为Dicer的切割产物：长度