T-CBPIA 0011-2025 生物制药用无血清细胞培养基质量标准

CCSC2761CBPIAⅠT/CBPIA0011—2025 Ⅰ Ⅱ 12规范性引用文件 13术语和定义 14质量管理 25技术要求 36检验方法 47检验规则 5 69细胞培养基说明书 6附录A（规范性）贴壁细胞培养基检测方法 8附录B（规范性）悬浮细胞培养基检测方法 T/CBPIA0011—2025Ⅱ本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件适用于生物制药（包括蛋白药、基因治疗药、人用疫苗及兽用疫苗等）领域用无血清细胞培养基的生产管理、质量管理等活动。值得注意的是，如涉及生物制药用无血清细胞培养基生产及质量相关变更的，应当按照现有法规和变更相关技术指导原则执行，不得依据本文件改变已经批准的注册生产工艺及质控规程。本文件由健顺生物科技（南通）有限公司提出。本文件由中国生化制药工业协会归口管理。本文件起草单位：健顺生物科技（南通）有限公司、北京昭衍药物检定研究有限公司。本文件主要起草人：罗顺、李彦斌、王嘉琪、张业炘。T/CBPIA0011—20251生物制药用无血清细胞培养基质量标准本文件规定了生物制药用无血清细胞培养基的质量控制、技术要求、检验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存要求。本文件适用于以非动物源原料生产的无血清细胞培养基的质量控制，无血清细胞培养基适用于生物制药（包括蛋白药、基因治疗药、人用疫苗及兽用疫苗等）生产和检验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。●GB/T1.1-2020标准化工作导则●GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备●GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备●GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备●GB/T9724化学试剂pH值测定通则●GB/T39486化学试剂电感耦合等离子体质谱分析方法通则●ICHQ7原料药GMP指南●《中国药典》通则0412电感耦合等离子体质谱法●《中国药典》通则0631pH值测定法●《中国药典》通则0632渗透压摩尔浓度测定法●《中国药典》通则0831干燥失重测定法●《中国药典》通则0902澄清度检查法●《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法●《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法●《中国药典》通则3301支原体检查法●《中国药典》第一增补本通则9120氨基酸分析指导原则3术语和定义3.1生物制药用无血清细胞培养基T/CBPIA0011—20252适用于生物制药（包括蛋白药、基因治疗药、人用疫苗及兽用疫苗等）的生产和检验，可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。3.2微量元素微量元素是指在细胞培养基中含量占比极少的元素，如影响细胞培养及生物制药产品质量属性的锌、铜、锰、镉、汞、铅、砷元素。本文件中微量元素锌、铜、锰为细胞培养基必需元素。除此之外，基于特殊细胞系的营养需求，微量元素会有差异。本文件中微量元素镉、汞、铅、砷为杂质元素。4质量管理4.1基本原则4.1.1由于生物制药用无血清细胞培养基应用的制品组成成分复杂且一般不能进行终端灭菌，因此，应对无血清细胞培养基的质量进行严格控制以保证后续生物制品的安全有效。4.1.2为保证质量管理体系的实施，产品实现过程中应当考虑对资源的具体要求。包括法规要求、工艺设计与开发、下游企业要求或标准、物料采购、厂房设施和设备、生产过程控制、产品放行、储运条件等，以持续对生产工艺和质量进行改进。鼓励采用信息化手段如实记录生产、检验过程中形成的所有数据，确保产品工艺链持续符合质量要求。4.2企业建立质量体系时应配备足够的人员及满足产品质量控制要求的厂房、设施和设备。细胞培养基微生物实验室和细胞生长实验室应分室进行。4.3生产过程的各工艺步骤应有经确认的工艺参数，形成工艺规程和标准操作规程并在整个生产过程中执行，过程控制应有记录，确保相关数据的真实、完整和可追溯。4.4生产用原材料应满足“生物制品生产用原材料及辅料质量控制”及药典的相关规定。不得含有可能引起人体不良反应的物质。应基于风险利益平衡防止由于安全性、有效性、质量可控性等方面给后续产品造成的风险。4.5与培养基直接接触的包装材料，如PET瓶、PE袋等，应为药品包装材料，在有效期内无细胞毒性，不会对细胞生长产生不良影响。4.6生产和检验应配备具有适当量程和精度的计量衡器、量具、仪器和仪表，并定期进行检定或校准。4.7应定期进行质量回顾，以确认符合预定标准及相关规范的要求。4.8培养基生产企业需对其生产用物料的供应商进行审计，并接受下游企业对培养基生产企业的审计。3T/CBPIA0011—20255技术要求5.1通则生物制药用无血清细胞培养基质量控制是指为满足生物制药相关产品质量属性，对生物制药用无血清细胞培养基的外观、理化指标、微量元素、安全指标、细胞生长、细胞培养基有效成分含量（谷氨酰胺和葡萄糖）建立的产品质量标准。5.2外观要求干粉培养基应颜色均一，无正常视力可见外来杂质及团块，按照配制说明标示的浓度，配制成的液体培养基，目视应澄清透明。5.3理化指标应符合表1要求。表1理化指标检测项目标准要求干燥失重质量分数澄清度澄清pH6.00~7.80渗透压摩尔浓度240~360mOsmol/kg5.4微量元素（型式检验）应符合表2要求。表2微量元素检测项目标准要求锌Zn100~5000ppb铜Cu5~1500ppb锰Mn2~100ppb镉Cd<200ppb汞Hg<200ppb铅Pb<200ppb砷As<200ppb备注：由于部分特殊细胞系的营养需求，一些细胞培养基组分中不一定含有锌、铜、锰等微量元素，这类特殊细胞系的培养基标准要求应参照开发该类培养基内控标准执行。5.5安全指标应符合表3要求。表3安全指标检测项目细菌内毒素标准要求<2EU/g支原体不应检出微生物限度需氧菌总数≤200cfu/g霉菌和酵母菌总数≤50cfu/gT/CBPIA0011—202545.6细胞生长试验通过培养后的细胞形态、细胞生长数量及细胞活率进行评价；根据培养的细胞选择合适的细胞生长实验方法。如果所用培养基适用于贴壁细胞，参照附录A贴壁细胞培养基检测方法。如果所用培养基适用于悬浮细胞，参照附录B悬浮细胞培养基检测方法。细胞实验通过的评价标准：细胞密度、倍增时间试验组的平均值应在历史数据平均值的±25%以内，细胞活率≥90%。5.7细胞培养基有效成分含量（谷氨酰胺和葡萄糖）有效成分含量在培养基标示均值的±10%范围内。6检验方法6.1一般规定除另有说明，将干粉细胞培养基按照配制说明标示的浓度，配制成液体培养基，进行检测；所用试剂均为分析纯试剂；所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液和其他试剂，应按照GB/T601、GB/T602、GB/T603和《中国药典》的规定制备。6.2外观要求取适量试样，置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下，观察其色泽与状态。6.3干燥失重质量分数取适量干粉细胞培养基，按照《中国药典》通则0831干燥失重法测定。6.4澄清度按照《中国药典》通则0902澄清度检查法，观察溶液是否澄清。6.5pH按照《中国药典》通则0631pH值测定法测定。6.6渗透压摩尔浓度按照《中国药典》通则0632渗透压摩尔浓度测定法测定。6.7微量元素按照《中国药典》通则0412电感耦合等离子体质谱法测定。6.8细菌内毒素按照《中国药典》通则1143细菌内毒素检查法测定。6.9支原体按照《中国药典》通则3301支原体检查法测定。T/CBPIA0011—202556.10微生物限度按照《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法测定。6.11细胞培养基有效成分含量（谷氨酰胺和葡萄糖）谷氨酰胺按照《中国药典》第一增补本通则9120氨基酸分析指导原则测定。葡萄糖含量按照葡萄糖检测试剂盒说明书要求测定。6.12细胞生长试验通过细胞培养后观察细胞形态、细胞生长数量和细胞活率，判断细胞生长是否符合要求；根据培养的细胞选择合适的细胞生长实验方法。如果所用培养基适用于贴壁细胞，参照附录A贴壁细胞培养基检测方法。如果所用培养基适用于悬浮细胞，参照附录B悬浮细胞培养基检测方法。7检验规则7.1组批同原料、同工艺、同一台设备同一时间生产的均质产品为一批。7.2取样按照包装生产过程首、中、末分别取样，一般取样量为不少于全检量的三倍，分为独立的三份，一份作为检验用，两份作为留样用；微生物限度取样量为30g。7.3分类检验分出厂检验和型式检验。7.4出厂检验7.4.1每批产品应经生产厂家按照出厂检验项目，检验合格出具检验合格报告后方可出厂。7.4.2出厂检验项目为：外观、干燥失重质量分数、澄清度、pH、渗透压摩尔浓度、细菌内毒素、支原体、微生物限度、细胞培养基有效成分含量（氨基酸等）、细胞生长试验。7.5型式检验7.5.1检验项目为本标准中规定的全部项目。一般情况下，型式检验半年进行一次。7.5.2有下列情况之一时，亦应进行型式检验：●原辅材料有较大变化时；●更改关键工艺或设备时；●新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时；●出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；●相关国家法规规定抽检及再验证需要时。T/CBPIA0011—202567.6判定规则7.6.1样品经检验，所有检测项目全部合格，则判该批产品为合格品。7.6.2样品经检验，如有不合格项，则判该批产品为不合格品。8标志、标签、包装、运输、贮存8.1标志、标签产品包装上印有商标、产品名称、产品编号、配方编号、生产批号、生产日期、有效期、包装规格、生产厂家、生产地址。图案及文字清晰美观，不易褪色。8.2包装8.2.1干粉产品内包装采用双层药用聚乙烯袋（PE袋外包装采用单层铝箔袋装或聚丙烯桶装，包装中含有干燥剂。8.2.2包装规格：1L/包，5L/包，10L/包，50L/包，100L/包，或依据客户需求定制。8.3运输本产品非危险品运输，干燥、密闭、避光，按标识的温度条件运输。8.4贮存本品贮存在通风干燥及不易受潮的场所，储存条件为2℃~8℃、密闭、干燥、避光保存。9细胞培养基说明书细胞培养基说明书的文字、符号、表格、数字、图形等应当准确、清晰、规范，说明书一般应当包括以下内容：9.1产品名称、包装规格9.2预期用途、保存原理9.3主要结构组成或者成分9.4储存条件及有效期9.5适用仪器T/CBPIA0011—202579.6样本要求9.7使用方法9.8注意事项9.9参考文献9.10生产企业的名称、住所、生产地址、联系方式及生产许可证编号或者生产备案凭证编号9.11说明书的编制或者修订日期其他应当标注的内容。8（规范性）贴壁细胞培养基检测方法警示：使用本文件的人员应有培训并具备相关工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。A.1细胞生长一般规定所用试剂和材料均需无菌，操作过程均为无菌操作。A.2试剂和材料A.2.1盐酸溶液（5mol/L）量取浓盐酸41.7mL滴加至纯化水58.3mL中，缓慢搅拌使其溶解均匀，常温保存。A.2.2氢氧化钠溶液I（5mol/L）量取水适量，加入氢氧化钠20g，缓慢搅拌完全溶解后定容至100mL，常温保存。A.2.3氢氧化钠溶液II（0.1mol/L）量取水适量，加入氢氧化钠0.4g，缓慢搅拌完全溶解后，定容至100mL，常温保存。A.2.4乙醇溶液（75%）量取无水乙醇75mL，加入水25mL，摇匀，密封保存。A.2.5平衡盐缓冲液使用市售商业化的PBS干粉，按照配制说明，直接配制。A.2.6胰蛋白酶溶液（0.25%）称取胰蛋白酶250mg，加100mL平衡盐溶液，轻轻搅拌，混匀，过滤除菌，-20℃长期保存使用。A.2.7Vero细胞（或已适应待检细胞培养基的其它贴壁细胞株）无支原体污染，定期检查细胞形态和倍增时间，以使细胞保持与初始状态一致。9A.2.8培养基根据不同的细胞种类选择适应的细胞培养基，按产品使用说明书要求配制。A.3仪器和设备A.3.1生物安全柜百级洁净级别。A.3.2二氧化碳培养箱二氧化碳浓度范围0%～20%，精度为设定值±0.1%，20℃~40℃恒温，控温精度为设定值±0.1℃,控制湿度≤80%。A.3.3细胞计数仪。A.3.4移液管。A.3.5分析天平感量为0.01g。A.3.6pH计测量范围1～14，精度0.002。A.3.7过滤器0.22μm，水相滤膜。A.3.8恒温水浴锅5℃~100℃,精度0.5℃。A.3.9液氮罐。A.3.10止血钳。A.3.11离心机0rpm～5000rpm。T/CBPIA0011—2025A.3.12显微镜倒置相差显微镜。A.3.13细胞培养瓶无菌T25瓶。A.4试验步骤A.4.1培养基制备按照培养基配制说明，配制液体培养基，无菌滤膜过滤至无菌容器内，2℃~8℃密封、避光保存。A.4.2贴壁细胞复苏A.4.2.1生物安全柜紫外灭菌30min后，用75%乙醇溶液喷洒生物安全柜内壁，用纸巾擦拭进行消毒，且自净15min。A.4.2.2在37℃的水浴锅中预热复苏用的培养基，用75%乙醇溶液擦拭培养基瓶的外壁，消毒后放入生物安全柜。A.4.2.3移取已预热的细胞培养基10mL，放入15mL离心管中。再移取已预热的细胞培养基5mL，放入T25瓶中，待用。A.4.2.4从液氮罐中取出细胞，用止血钳夹住冻存管的上部，放入37℃的水浴锅中轻轻搅动，管盖不要浸入水中，待管中的冰块部分溶解后停止解冻。A.4.2.5用纸巾擦干冻存管外水珠，并用浸泡过75%乙醇溶液棉擦拭冻存管的外壁，再将冻存管放入生物安全柜内，用一次性无菌移液管将细胞移入已装有预热培养基的15mL离心管中。A.4.2.6使用离心机200g离心5min，弃上清，轻轻拍散细胞，将T25瓶的培养基加入离心管，轻轻吹打至细胞分散，转移至T25瓶。T/CBPIA0011—2025A.4.2.7将T25瓶的细胞置于37℃,0%~10%（根据细胞需求）二氧化碳培养箱继续培养。A.4.3细胞传代扩增A.4.3.1将培养至第2天~4天的细胞取出（根据不同种类细胞决定培养时间弃上清后，添加平衡盐缓冲液冲清洗两次。A.4.3.2加入0.25%的胰蛋白酶溶液，摇匀，显微镜下观察，待细胞变圆后弃胰蛋白酶。A.4.3.3使用培养基吹打细胞至分散。A.4.3.4按照1:4~1:10的扩增比例将细胞接种至T25（根据不同种类细胞决定接种比例），于37℃,0%~10%（根据细胞需求）二氧化碳培养箱继续培养。A.4.4细胞生长试验A.4.4.1将待检测的培养基加入T25瓶，每瓶5mL，每个条件3个平行。A.4.4.2培养至第2天~4天的细胞取出（根据不同种类细胞决定培养时间按照A.4.3的方法进行消化重悬处理。A.4.4.3按照1:4~1:10的扩增比例将细胞接种至T25瓶（根据不同种类细胞决定接种比例于37℃,0%~10%（根据细胞需求）二氧化碳培养箱继续培养。A.4.5结果判定A.4.5.1细胞形态：细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形、扇形或其他形态，晃动培养液时，细胞不动。A.4.5.2细胞生长：将培养至第2天~4天的细胞取出（根据不同种类细胞决定培养时间按照A.4.3的方法进行消化重悬处理后，取样计数，细胞密度应大于等于初始接种密度的4倍（根据不同种类细胞决定倍数）。A.4.5.3试验组细胞密度△1、倍增时间△2的平均值应在历史数据△3平均值的±25%以内，细胞活率≥90%。T/CBPIA0011—2025注释：细胞密度△1：指单位体积内活细胞的数目，即：多少个细胞每毫升，一般采用人工计数，或者细胞计数仪的方式统计。倍增时间△2：指某一细胞在一定的条件下，从一个细胞分裂为两个细胞所需要的时间。通常用下面的公示计算：DT=Ln(2)×(Day1-Day0)×24/{Ln(VCD1)-Ln(VCD0)}其中，DT为细胞倍增时间；Day1为最终培养天数；Day0为初始培养天数；VCD1最终培养天数时单位体积的细胞数目；VCD0初始培养天数时单位体积的细胞数目。历史数据平均值△3：指对该批次细胞培养基开发及应用中进行细胞试验检测积累的历史数据（至少三批）的平均值，方法同试验组试验方法。T/CBPIA0011—2025(规范性)悬浮细胞培养基检测方法警示：使用本文件的人员应有培训并具备相关工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。B.1细胞生长一般规定所用试剂和材料均需无菌，操作过程均为无菌操作。B.2试剂和材料B.2.1盐酸溶液（5mol/L）量取浓盐酸41.7mL滴加至纯化水58.3mL中，缓慢搅拌使其溶解均匀，常温保存。B.2.2氢氧化钠溶液I（5mol/L）量取水适量，加入氢氧化钠20g，缓慢搅拌完全溶解后定容至100mL，常温保存。B.2.3氢氧化钠溶液II（0.1mol/L）量取水适量，加入氢氧化钠0.4g，缓慢搅拌完全溶解后，定容至100mL，常温保存。B.2.4乙醇溶液（75%）量取无水乙醇75mL，加入水25mL，摇匀，密封保存。B.2.5CHO细胞（或已适应待检细胞培养基的其它悬浮细胞株）无支原体污染，定期检查细胞形态和倍增时间，以使细胞保持与初始状态一致。B.2.6培养基根据不同的细胞种类选择适应的细胞培养基，按产品使用说明书要求配制。B.3仪器和设备B.3.1生物安全柜百级洁净级别。T/CBPIA0011—2025B.3.2二氧化碳培养箱二氧化碳浓度范围0%～20%，精度为设定值±0.1%，20℃~40℃恒温，控温精度为设定值±0.1℃,控制湿度≤80%。B.3.3细胞计数仪。B.3.4移液管。B.3.5分析天平感量为0.01g。B.3.6pH计测量范围1～14，精度0.002。B.3.7过滤器0.22μm，水相滤膜。B.3.8恒温水浴锅0℃~100℃,精度0.5℃。B.3.9液氮罐。B.3.10止血钳。B.3.11离心机0rpm～5000rpm。B.4试验步骤B.4.1培养基制备按照培养基配制说明，配制液体培养基，无菌滤膜过滤至无菌容器内，2℃~8℃密封、避光保存。B.4.2悬浮细胞复苏T/CBPIA0011—2025B.4.2.1生物安全柜紫外灭菌30min后，用75%乙醇溶液喷洒生物安全柜内壁，用纸巾擦拭进行消毒，且自净15min。B.4.2.2在37℃的水浴锅中预热复苏用的培养基，用75%乙醇溶液擦拭培养基瓶的外壁，消毒后放入生物安全柜。B.4.2.3移取已预热的细胞培养基30mL，放入50mL离心管中。再移取已预热的细胞培养基10~30mL（根据待复苏细胞的密度和体积调整放入摇管或摇瓶，待用。B.4.2.4从液氮罐中取出细胞，用止血钳夹住冻存管的上部，放入37℃的水浴锅中轻轻搅动，管盖不要浸入水中，待管中的冰块部分溶解后停止解冻。B.4.2.5用纸巾擦干冻存管外水珠，并用浸泡过75%乙醇溶液棉擦拭冻存管的外壁，再将冻存管放入生物安全柜内，用一次性无菌移液管将细胞移入已装有预热培养基的50mL离心管中。B.4.2.6使用离心机200g离心5min，弃上清，轻轻拍散细胞，将摇管或摇瓶的培养基加入离心管，轻轻吹打至细胞分散，转移至摇管或摇瓶。B.4.2.7将摇管或摇瓶的细胞置于37℃,0%~10%（根据细胞需求）二氧化碳培养箱，设置转速（如用摇管培养，50mm轨道摇动器转速设置为200rpm~250rpm；如用摇瓶培养，50mm轨道摇动器转速为95rpm~125rpm或25mm轨道摇动器转速设置为125rpm~150rpm，保证设备正常运转）并继续培养。B.4.3细胞传代扩增B.4.3.1将培养至第2天~4天的细胞取出（根据不同种类细胞决定培养时间取样计数，检测细胞密度和活率。B.4.3.2按照接种密度为0.3~2.0×106细胞/mL（根据不同细胞种类决定接种密度计算传代所需细胞体积和培养基体积。T/CBPIA0011—2025B.4.3.3用移液管取出相应体积的细胞和培养基置于培养容器中，混匀后取样，用细胞计数仪检测细胞密度和细胞活率。B.4.3.4置于37℃,0%~10%（根据细胞需求）二氧化碳，相对湿度80%的摇床培养箱中（如用摇管培养，50mm轨道摇动器转速设置为200rpm~250rpm；如用摇瓶培养，50mm轨道摇动器转速为95rpm~125rpm或25mm轨道摇动器转速设置为125r