免疫学实验操作手段

免疫学实验操作手段一、免疫学实验概述

免疫学实验是研究机体免疫系统结构、功能及调控机制的重要手段，广泛应用于基础医学、临床诊断和生物技术领域。常见的免疫学实验操作手段包括样本制备、抗体应用、细胞分析、分子检测等。本指南将系统介绍各类免疫学实验的基本原理、操作步骤及注意事项，确保实验结果的准确性和可靠性。

二、免疫学实验的基本流程

（一）实验准备阶段

1.**试剂与耗材准备**：

-配制缓冲液（如PBS、Tris缓冲液等）。

-准备抗体（一抗、二抗）、酶标记物、荧光染料等。

-检查移液器、离心机、培养箱等设备是否校准。

2.**样本采集与处理**：

-根据实验需求采集血液、组织或细胞样本。

-采用无菌操作进行样本处理，如细胞裂解、组织切片等。

3.**实验分组**：

-设置对照组（如阴性对照、空白对照）和实验组，确保结果可比性。

（二）实验操作阶段

1.**样本前处理**：

-细胞样本：洗涤、计数、调整浓度。

-组织样本：固定、脱水、包埋、切片。

2.**免疫反应**：

-抗体孵育：将样本与特异性抗体反应（如ELISA、免疫组化）。

-酶联检测：加入酶底物显色（如TMB、DAB）。

3.**信号检测**：

-光学检测：使用酶标仪或显微镜定量/定性分析。

-荧光检测：流式细胞仪或共聚焦显微镜分析。

（三）结果分析与记录

1.**数据整理**：

-记录各组的吸光度值、荧光强度等定量数据。

-绘制图表（如柱状图、折线图）展示结果趋势。

2.**统计分析**：

-使用SPSS或GraphPad等软件进行差异检验（如t检验、ANOVA）。

-评估实验重复性（如计算CV值）。

三、常用免疫学实验技术

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.**原理**：

-利用抗原抗体特异性结合，通过酶标二抗显色定量目标分子。

2.**操作步骤**：

(1)包被：将抗原包被于微孔板。

(2)封闭：用封闭液阻断非特异性结合位点。

(3)孵育一抗：加入待测样本或标准品。

(4)孵育二抗：加入酶标记的二抗。

(5)显色：加入TMB等酶底物，避光反应30-60分钟。

(6)终止：加入终止液（如H₂SO₄），在酶标仪检测吸光度（450-550nm）。

（二）免疫荧光技术

1.**原理**：

-用荧光标记抗体检测细胞或组织中的目标蛋白，通过显微镜观察定位。

2.**操作步骤**：

(1)细胞固定：用甲醇或甲醛固定细胞。

(2)封闭：用血清封闭内源性过氧化物酶。

(3)孵育一抗：4℃过夜孵育特异性抗体。

(4)孵育二抗：37℃孵育荧光标记的二抗（如AlexaFluor系列）。

(5)成像：使用荧光显微镜（如FITC/DAPI双标）拍照。

（三）流式细胞术（FCM）

1.**原理**：

-通过荧光染料标记细胞，利用激光激发检测细胞表型或胞内物质。

2.**操作步骤**：

(1)细胞制备：洗涤、破膜（如需检测胞内蛋白）。

(2)染色：加入荧光标记抗体（如CD3、Ki-67）。

(3)上机：调整细胞浓度，上流式细胞仪检测。

(4)数据分析：使用FCSExpress等软件分析细胞比例和表达强度。

四、实验注意事项

1.**质量控制**：

-使用已知浓度的标准品校准仪器。

-每个实验设置阴性对照（未标记抗体）。

2.**操作规范**：

-严格无菌操作，避免污染。

-控制孵育时间与温度，确保反应效率。

3.**安全防护**：

-佩戴手套、护目镜，避免试剂接触皮肤。

-荧光染料需避光保存，防止降解。

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**（接上文）三、常用免疫学实验技术**

**(一)酶联免疫吸附实验（ELISA）**

1.**原理**：

*酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）是一种基于抗原抗体特异性结合的固相酶联免疫测定技术。其核心原理是将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）表面，通过加入酶标记的抗体或抗原，与待测样本中的目标分子结合，最后加入酶的底物，产生可测量的颜色反应。通过酶标仪测定吸光度值，从而对样本中的目标分子进行定量或定性分析。ELISA根据检测目标和结合方式不同，主要分为直接法、间接法和竞争法等。

2.**操作步骤（以双抗体夹心法为例，常用于检测蛋白质）**：

***(1)包被（Coating）**：

***目的**：在微孔板表面固定捕获抗体（CaptureAntibody），使其定向排列。

***操作**：

*配制捕获抗体工作液：将捕获抗体用稀释液（如PBS-T或包被缓冲液，pH9.6-10.5）稀释至适当浓度（通常0.5-5µg/mL）。

*加样：向每个微孔中加入100-200µL捕获抗体工作液，设空白孔（只加稀释液）、阳性对照孔（已知浓度标准品）和阴性对照孔（无目标物）。

*孵育：将微孔板置于37°C恒温箱或室温避光环境下孵育2-4小时，或4°C过夜孵育以增强结合。

*洗涤：孵育结束后，小心吸弃孔内液体，用洗涤液（如PBS-T或洗涤缓冲液）洗涤3-5次，每次洗涤时用吸水纸拍干边缘（或使用洗板机），每次洗涤约30-60秒。洗涤是去除未结合抗体的关键步骤，直接影响结果准确性。

***(2)封闭（Blocking）**：

***目的**：封闭微孔板表面未被捕获抗体结合的位点（如孔壁的疏水基团、蛋白残留等），防止后续的非特异性结合。

***操作**：

*配制封闭液：常用封闭液包括5%脱脂奶粉、3-5%BSA（牛血清白蛋白）或非fat奶粉。用稀释液或封闭缓冲液（pH7.2-7.4）配制。

*加样：向每个微孔中加入100-200µL封闭液。

*孵育：室温避光孵育1-2小时，或4°C过夜孵育以获得更充分的封闭效果。

*洗涤：同包被后的洗涤步骤，洗涤3-5次，去除未封闭的封闭液。

***(3)加样（Sample/WesternBlot）**：

***目的**：加入含有待测目标分子的样本或WesternBlot转膜后的膜条，使其与固定在孔内的捕获抗体结合。

***操作**：

*样本准备：根据样本类型（血清、细胞裂解液、组织提取液等）进行适当稀释或直接使用。确保样本无沉淀或气泡。

*加样：向每个微孔中加入100µL样本（或WesternBlot膜条）。

*孵育：室温避光孵育1-2小时，或4°C过夜孵育以增强结合。孵育时间需根据样本浓度和抗体灵敏度优化。

*洗涤：同包被后的洗涤步骤，洗涤3-5次。

***(4)加酶标二抗（Substrate/WesternBlot）**：

***目的**：加入酶标记的二级抗体（DetectionAntibody），该抗体能与样本中结合的捕获抗体（或WesternBlot膜上的目标蛋白）结合。

***操作**：

*配制酶标二抗工作液：将酶标二抗用稀释液或抗体稀释液稀释至适当浓度（通常1-10µg/mL）。

*加样：向每个微孔中加入100µL酶标二抗工作液。

*孵育：室温避光孵育1小时，或4°C过夜孵育。

*洗涤：同包被后的洗涤步骤，洗涤3-5次。此步洗涤尤为重要，需确保去除未结合的二抗，减少背景干扰。

***(5)显色（SubstrateAddition/WesternBlot）**：

***目的**：加入酶的底物，酶催化底物产生有色产物，颜色深浅与结合的酶标二抗量成正比。

***操作**：

*配制底物溶液：根据所用酶（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP）选择相应的底物（如TMB、OPD、BCIP/NBT等），用底物缓冲液配制工作液。注意底物通常需现配现用或低温保存。

*加样：向每个微孔中加入100-200µL底物溶液。注意避光操作，特别是对光敏感的TMB底物。

*显色反应：室温避光孵育15-30分钟。反应时间需根据酶活性和抗体结合情况优化，避免过度反应导致颜色不均或背景过高。可轻微晃动板架促进反应均匀。

***(6)终止（StopSolution/WesternBlot）**：

***目的**：立即停止酶的催化反应，使显色稳定在目标范围内，便于酶标仪检测。

***操作**：向每个微孔中加入50-100µL终止液（如2MH₂SO₄或1MHCl）。终止液会改变底物的pH环境，使颜色反应停止。

***(7)检测（Detection）**：

***目的**：使用酶标仪在特定波长下测定各孔的吸光度值（OD值）。

***操作**：

*设定参数：在酶标仪上设定检测波长（如TMB显色为450nm，设参考波长，通常为630nm）和读数孔。

*测定：将微孔板放在酶标仪中自动读取各孔的OD值。记录数据。

3.**结果分析**：

*使用Excel或专业软件（如GraphPadPrism）进行数据分析。

*计算各样本孔的OD值平均值。

*以空白孔调零（BlankCorrection），扣除背景吸收。

*绘制标准曲线（若使用已知浓度的标准品）：以标准品浓度对数为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。

*计算样本浓度：将样本的平均OD值代入标准曲线方程，计算出样本中目标分子的浓度或相对含量。

*进行统计学分析（如t检验、ANOVA），比较组间差异的显著性。

4.**关键注意事项**：

***微孔板选择**：根据实验需求选择合适的微孔板材质（如聚苯乙烯）和表面处理（如疏水/亲水）。

***抗体质量**：确保抗体特异性强、背景低、效价合适。

***稀释液选择**：所有稀释液应无污染、无酶抑制物，使用无热原水配制。

***洗涤彻底**：洗涤是ELISA成功的关键，必须确保每次洗涤充分，避免背景过高。

***温度控制**：孵育温度和时间需标准化，过高或过低、过长或过短均会影响结果。

***避光操作**：对光敏感的试剂（如TMB底物）需全程避光。

***酶标仪校准**：定期校准酶标仪，确保读数准确。

**(二)免疫荧光技术**

1.**原理**：

*免疫荧光技术（ImmunofluorescenceTechnique）是利用荧光标记的抗体（荧光二抗）或荧光标记的抗原，与细胞或组织样本中的目标分子结合，通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备检测荧光信号，从而实现对目标分子定位、定量或定性分析的技术。根据检测对象不同，可分为免疫细胞荧光和免疫组化荧光。荧光标记的染料在特定波长的激发光照射下会发出不同颜色的荧光，便于多重标记和区分。

2.**操作步骤（以免疫细胞荧光为例）**：

***(1)细胞制备与固定**：

***目的**：制备单细胞悬液或将组织切片，并使细胞/组织成分固定，维持其形态和抗原性。

***操作**：

*细胞悬液：若为新鲜细胞，用胰蛋白酶等消化制成单细胞悬液，洗涤1-2次。

*组织切片：新鲜或福尔马林固定的组织，脱水、透明、石蜡包埋（若做冰冻切片则直接冷冻切片），切片厚度通常为5-10µm。

*固定：根据细胞类型或组织性质选择合适的固定剂。常用固定剂包括：

*甲醇（-20°C，快速冷冻固定，适用于多数细胞和冰冻切片，能较好地保存抗原，但可能导致细胞收缩变形）。

*4%多聚甲醛（pH7.4，室温或4°C，适用于多种细胞和冰冻切片，能较好地固定蛋白质，但可能封闭抗原表位，需后续通透）。

*冰醋酸（-20°C，适用于某些特定抗原，通透性好，但可能导致细胞脆化）。

*处理：将细胞悬液滴加在预先放置好盖玻片的载玻片上，或直接将切片放置在载玻片上，滴加固定液。固定时间通常为10-30分钟，具体时间需优化。

***(2)通透（Permeabilization）**：

***目的**：使细胞膜或细胞壁通透性增加，有利于抗体进入细胞内部结合胞内抗原，或使固定过程中变性的蛋白质恢复部分溶解性。

***操作**：

*选择通透剂：常用通透剂包括0.1%TritonX-100、0.25%NP-40、0.1%SDS（使用需谨慎，可能导致蛋白质变性过度）。

*处理：用冰冷的通透剂溶液（通常含0.1%PBS-Tween20或0.1%SDS）处理细胞或组织切片，室温孵育5-20分钟。通透时间需根据细胞类型和实验目的优化。

*洗涤：用PBS或洗涤缓冲液洗涤3-5次，每次5分钟，以去除通透剂。

***(3)封闭（Blocking）**：

***目的**：封闭细胞表面或组织切片上的内源性过氧化物酶活性（若后续需酶标），以及非特异性结合位点（如细胞表面受体、内源性蛋白等），减少背景荧光。

***操作**：

*选择封闭液：常用封闭液包括5%脱脂奶粉、3-5%BSA（牛血清白蛋白）、血清（同种来源血清效果更佳）。

*处理：将封闭液滴加在样本上，覆盖完全。室温避光孵育30分钟-2小时，或4°C过夜封闭。

*洗涤：同洗涤步骤，洗涤3-5次。

***(4)孵育一抗（PrimaryAntibodyIncubation）**：

***目的**：加入特异性识别目标抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，使其与样本中的目标分子结合。

***操作**：

*配制一抗工作液：将特异性一抗用封闭液或抗体稀释液稀释至适当浓度（通常0.1-10µg/mL，需预实验确定最佳浓度）。

*处理：将一抗工作液滴加在样本上，覆盖完全。建议使用封闭体系（如含血清的封闭液稀释）以提高抗体稳定性。

*孵育：盖上盖玻片或盖皿，置于湿盒中（防止水分蒸发），在4°C冰箱孵育过夜（适用于多数一抗，可增强结合信号），或室温孵育1-2小时（适用于高亲和力一抗或易降解的样本）。

***(5)洗涤**：

***目的**：去除未结合的一抗，减少非特异性信号。

***操作**：用洗涤缓冲液（如PBS-T或0.05%Tween20-PBS）洗涤3-5次，每次5分钟。可根据需要增加洗涤次数。

***(6)孵育二抗（SecondaryAntibodyIncubation）**：

***目的**：加入酶标记或荧光标记的二级抗体，该抗体能与样本中结合的一抗结合，从而间接检测目标抗原。荧光二抗是本技术中最常用的标记方式。

***操作**：

*选择与一抗物种匹配的二抗：例如，若一抗为兔源，则选择羊抗兔IgG荧光二抗。若检测细胞表面蛋白，常选用C3/celllinker等特殊荧光二抗，无需通透步骤。

*配制二抗工作液：将荧光二抗用洗涤缓冲液或抗体稀释液稀释至适当浓度（通常1-10µg/mL）。

*处理：将二抗工作液滴加在样本上，覆盖完全。盖上盖玻片或盖皿，置于湿盒中。

*孵育：室温避光孵育30-60分钟。孵育时间过长可能导致荧光信号扩散。

***(7)洗涤**：

***目的**：去除未结合的二抗。

***操作**：同孵育一抗后的洗涤步骤。

***(8)脱水与封片（DehydrationandMounting）**：

***目的**：使样本从水相转移到有机相，便于荧光观察，并长期保存荧光信号。

***操作**：

*脱水：按梯度增加酒精浓度（如50%,70%,90%,100%乙醇）洗涤2-3次，每次3-5分钟。更换酒精时需用吸水纸吸干边缘液体。

*清洗：用纯丙酮或无水乙醇清洗一次，去除残留水分。

*封片：滴加适量抗荧光淬灭封片剂（MountingMedium）于样本表面，盖上盖玻片。封片剂能有效延长荧光信号的保存时间，并减少荧光淬灭。注意盖玻片边缘要完全被封片剂覆盖，防止水分侵入。

***(9)成像与分析**：

***目的**：使用荧光显微镜或流式细胞仪观察并记录荧光信号。

***操作**：

*荧光显微镜：将封片好的载玻片放置在荧光显微镜上，选择合适的激发光源和滤光片组（根据荧光染料种类选择，如FITC、AlexaFluor488、TRITC、AlexaFluor594等）。调节光圈、对比度等参数，拍照记录。可进行多通道同时成像。

*流式细胞术：若在流式细胞仪上检测，需将样本制成单细胞悬液，调整细胞浓度，上机检测。需设置同型对照（用等浓度同型IgG代替一抗或二抗）以排除非特异性结合。

3.**结果分析**：

***定性分析**：观察目标抗原在细胞内的定位（如细胞核、细胞质、细胞膜）和表达模式（如均匀表达、点状聚集）。

***半定量分析**：通过改变一抗浓度或使用图像分析软件（如ImageJ,ImageProPlus）对荧光强度进行定量分析，比较不同组间的表达差异。

***定量分析（流式细胞术）**：通过设置门控，分析目标细胞群体的荧光强度分布，计算阳性细胞率、平均荧光强度（MFI）等参数。

4.**关键注意事项**：

***抗体选择**：选择特异性强、背景低、已验证过效果的抗体。注意一抗和二抗的物种来源匹配。

***固定剂和通透剂优化**：不同的固定剂和通透剂对抗原的影响不同，需根据实验目的和样本类型进行优化选择。

***封闭充分**：封闭不充分会导致高背景，封闭过度可能封闭抗原表位，导致信号减弱。封闭时间、温度和封闭液浓度需优化。

***荧光淬灭**：盖玻片边缘残留水分或未完全覆盖的封片剂会吸收荧光，导致信号减弱。确保封片剂完全覆盖。

***荧光串色**：不同荧光染料之间可能存在串色，选择光谱分离好的染料，并在成像时使用相应的滤光片组。

***对照设置**：必须设置阴性对照（不加一抗或用同型IgG代替一抗），以排除非特异性结合。

**(三)流式细胞术（FCM）**

1.**原理**：

*流式细胞术（FlowCytometry,FCM）是一种可以对悬浮细胞或组织细碎片段进行快速、多参数、单细胞水平分析的技术。其基本原理是利用液流系统将细胞逐一、单个地通过激光束照射区域，同时收集细胞散射光信号和荧光信号，通过荧光探测器检测并转换成电信号，再经计算机处理，最终获得每个细胞在多个参数（如细胞大小、颗粒度、多种荧光标记物强度等）上的信息。通过使用荧光标记的抗体，可以检测细胞表面的标记物（如细胞因子受体、分选抗体）或胞内标记物（需使用通透/染色试剂盒）。

2.**操作步骤（以检测细胞表面标志物为例）**：

***(1)细胞制备**：

***目的**：获得纯净、单分散的细胞悬液。

***操作**：

*样本处理：新鲜组织需进行酶消化（如胶原酶）或机械破碎（如组织研磨器）获取细胞。血液样本需使用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心分离。

*洗涤：收集到的细胞通常含有培养基、血液成分等杂质，需用PBS或细胞洗涤缓冲液洗涤1-3次，去除杂质。

*计数与调整浓度：使用细胞计数板或细胞计数仪计数细胞总数，并用细胞培养基或细胞洗涤缓冲液将细胞浓度调整至所需范围（通常为1x10⁵-1x10⁸cells/mL，取决于后续实验和仪器设置）。

*预实验（可选）：对于分选实验，需先进行预实验确定最佳分选阈值。

***(2)孵育细胞因子抑制剂（可选）**：

***目的**：阻断细胞表面受体的进一步下调或上调，使细胞表面标记物表达状态稳定。

***操作**：在特定条件下（如37°C、4°C或室温），用含或不含细胞因子抑制剂的缓冲液孵育细胞15-30分钟。常用抑制剂包括Phenylarsineoxide(PAO)、BrefeldinA(BFA)、Monensin等，根据实验目的选择。

***(3)孵育一抗（PrimaryAntibodyIncubation）**：

***目的**：加入特异性识别细胞表面目标分子的单克隆抗体，使其与目标受体结合。

***操作**：

*配制一抗工作液：将特异性一抗用细胞染色缓冲液（通常含血清或BSA以减少非特异性结合，pH7.2-7.4）稀释至适当浓度（通常0.1-10µg/mL）。避免使用Fc封闭剂，除非抗体本身背景很高。

*处理：将细胞悬液与一抗工作液混合，总孵育体积根据细胞浓度调整。建议在4°C孵育过夜（增强结合信号），或室温避光孵育45-60分钟（适用于高亲和力抗体）。

*洗涤：用细胞洗涤缓冲液洗涤1-2次，去除未结合的一抗。

***(4)孵育二抗（SecondaryAntibodyIncubation）**：

***目的**：加入荧光标记的二级抗体，该抗体能与样本中结合的一抗结合，从而间接检测目标细胞表面抗原。

***操作**：

*选择与一抗物种来源匹配且荧光通道兼容的二抗。例如，若一抗为鼠源，则选择兔抗鼠IgG荧光二抗（如PE,APC,AlexaFluor系列等）。

*配制二抗工作液：用细胞染色缓冲液稀释荧光二抗至适当浓度（通常1-10µg/mL）。

*处理：将细胞悬液与二抗工作液混合，避光孵育30-60分钟。

*洗涤：用细胞洗涤缓冲液洗涤1-2次，去除未结合的二抗。

***(5)（可选）孵育胞内抗体**：

***目的**：若需检测胞内抗原，需使用专用的细胞内染色试剂盒，使细胞膜通透，使抗体能进入胞内结合目标分子。

***操作**：

*膜通透：根据试剂盒说明书，用含固定剂和通透剂的溶液处理细胞，通常在4°C孵育20-30分钟。

*孵育一抗（胞内）：用含血清的缓冲液将胞内一抗稀释，孵育（如4°C过夜或室温1小时）。

*洗涤。

*孵育二抗（胞内）：用荧光二抗孵育。

*闭膜：用含高浓度脂质体的封膜剂（如Paraformaldehyde/Cholesterol）处理细胞，使细胞膜恢复完整性，防止后续荧光串色。

*洗涤。

***(6)（可选）使用同型对照**：

***目的**：排除非特异性结合，评估背景荧光水平。

***操作**：用等浓度、等种属来源的未标记二抗或IgG替代一抗或二抗进行孵育和洗涤。实验中需同时检测样本细胞和对照细胞的荧光信号。

***(7)上机检测**：

***目的**：将细胞悬液加入流式细胞仪，进行信号采集。

***操作**：

*混合：将处理好的细胞悬液与流式细胞仪上样缓冲液（如FACSFlow,PhosphateBufferedFillingSolution）按比例混合。

*上样：打开流式细胞仪，设置检测参数（如设门、选择荧光通道、调整流速等）。缓慢将细胞悬液泵入流式细胞仪。

*检测：仪器自动对每个细胞进行散射光和荧光信号的检测，并将数据传输至计算机。

***(8)数据分析**：

***目的**：使用流式细胞术分析软件（如FCSExpress,FlowJo）对采集到的原始数据进行处理和解读。

***操作**：

*转换：将原始数据文件（.fcs）导入分析软件。

*设门：根据细胞前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号，设置门控区，去除细胞团块、双细胞、死细胞等非目标细胞。

*绘图：选择感兴趣的荧光参数，绘制散点图、直方图、条形图等，如FSCvsSSC散点图初步分选，目标荧光抗体散点图分析细胞群体比例和表达强度。

*分析：计算阳性细胞率、平均荧光强度（MFI）、中位数（MedIAN）等统计参数，比较不同实验组间的差异。

3.**结果分析**：

***定性分析**：判断目标抗原是否在特定细胞亚群上表达。

***定量分析**：通过设置门控和统计分析，定量评估细胞亚群的比例和目标分子的表达水平。

4.**关键注意事项**：

***抗体质量与特异性**：选择高纯度、高特异性的荧光标记抗体。

***细胞活力**：流式实验要求细胞保持良好的活力（通常>95%），冻融次数不宜过多。

***染色时间与温度**：孵育时间和温度对染色效果影响显著，需根据抗体说明书和预实验结果优化。

***抗体浓度**：抗体浓度过高可能导致信号饱和，浓度过低则信号微弱，需优化浓度。

***同型对照**：必须设置同型对照，用于评估背景荧光和排除非特异性结合。

***荧光串色**：高亲和力荧光染料（如PE,APC）之间可能存在串色，需选择兼容的荧光通道组合，并在分析时进行串色校正。

***设门策略**：合理的设门是准确分析结果的前提，需根据FSC/SSC散点图和实验目的仔细选择。

***避免固定**：大多数流式检测细胞表面标志物时，不建议使用强固定剂（如甲醛），以免导致受体下调或构象变化。

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**（文档结束）**

一、免疫学实验概述

免疫学实验是研究机体免疫系统结构、功能及调控机制的重要手段，广泛应用于基础医学、临床诊断和生物技术领域。常见的免疫学实验操作手段包括样本制备、抗体应用、细胞分析、分子检测等。本指南将系统介绍各类免疫学实验的基本原理、操作步骤及注意事项，确保实验结果的准确性和可靠性。

二、免疫学实验的基本流程

（一）实验准备阶段

1.**试剂与耗材准备**：

-配制缓冲液（如PBS、Tris缓冲液等）。

-准备抗体（一抗、二抗）、酶标记物、荧光染料等。

-检查移液器、离心机、培养箱等设备是否校准。

2.**样本采集与处理**：

-根据实验需求采集血液、组织或细胞样本。

-采用无菌操作进行样本处理，如细胞裂解、组织切片等。

3.**实验分组**：

-设置对照组（如阴性对照、空白对照）和实验组，确保结果可比性。

（二）实验操作阶段

1.**样本前处理**：

-细胞样本：洗涤、计数、调整浓度。

-组织样本：固定、脱水、包埋、切片。

2.**免疫反应**：

-抗体孵育：将样本与特异性抗体反应（如ELISA、免疫组化）。

-酶联检测：加入酶底物显色（如TMB、DAB）。

3.**信号检测**：

-光学检测：使用酶标仪或显微镜定量/定性分析。

-荧光检测：流式细胞仪或共聚焦显微镜分析。

（三）结果分析与记录

1.**数据整理**：

-记录各组的吸光度值、荧光强度等定量数据。

-绘制图表（如柱状图、折线图）展示结果趋势。

2.**统计分析**：

-使用SPSS或GraphPad等软件进行差异检验（如t检验、ANOVA）。

-评估实验重复性（如计算CV值）。

三、常用免疫学实验技术

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.**原理**：

-利用抗原抗体特异性结合，通过酶标二抗显色定量目标分子。

2.**操作步骤**：

(1)包被：将抗原包被于微孔板。

(2)封闭：用封闭液阻断非特异性结合位点。

(3)孵育一抗：加入待测样本或标准品。

(4)孵育二抗：加入酶标记的二抗。

(5)显色：加入TMB等酶底物，避光反应30-60分钟。

(6)终止：加入终止液（如H₂SO₄），在酶标仪检测吸光度（450-550nm）。

（二）免疫荧光技术

1.**原理**：

-用荧光标记抗体检测细胞或组织中的目标蛋白，通过显微镜观察定位。

2.**操作步骤**：

(1)细胞固定：用甲醇或甲醛固定细胞。

(2)封闭：用血清封闭内源性过氧化物酶。

(3)孵育一抗：4℃过夜孵育特异性抗体。

(4)孵育二抗：37℃孵育荧光标记的二抗（如AlexaFluor系列）。

(5)成像：使用荧光显微镜（如FITC/DAPI双标）拍照。

（三）流式细胞术（FCM）

1.**原理**：

-通过荧光染料标记细胞，利用激光激发检测细胞表型或胞内物质。

2.**操作步骤**：

(1)细胞制备：洗涤、破膜（如需检测胞内蛋白）。

(2)染色：加入荧光标记抗体（如CD3、Ki-67）。

(3)上机：调整细胞浓度，上流式细胞仪检测。

(4)数据分析：使用FCSExpress等软件分析细胞比例和表达强度。

四、实验注意事项

1.**质量控制**：

-使用已知浓度的标准品校准仪器。

-每个实验设置阴性对照（未标记抗体）。

2.**操作规范**：

-严格无菌操作，避免污染。

-控制孵育时间与温度，确保反应效率。

3.**安全防护**：

-佩戴手套、护目镜，避免试剂接触皮肤。

-荧光染料需避光保存，防止降解。

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**（接上文）三、常用免疫学实验技术**

**(一)酶联免疫吸附实验（ELISA）**

1.**原理**：

*酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）是一种基于抗原抗体特异性结合的固相酶联免疫测定技术。其核心原理是将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）表面，通过加入酶标记的抗体或抗原，与待测样本中的目标分子结合，最后加入酶的底物，产生可测量的颜色反应。通过酶标仪测定吸光度值，从而对样本中的目标分子进行定量或定性分析。ELISA根据检测目标和结合方式不同，主要分为直接法、间接法和竞争法等。

2.**操作步骤（以双抗体夹心法为例，常用于检测蛋白质）**：

***(1)包被（Coating）**：

***目的**：在微孔板表面固定捕获抗体（CaptureAntibody），使其定向排列。

***操作**：

*配制捕获抗体工作液：将捕获抗体用稀释液（如PBS-T或包被缓冲液，pH9.6-10.5）稀释至适当浓度（通常0.5-5µg/mL）。

*加样：向每个微孔中加入100-200µL捕获抗体工作液，设空白孔（只加稀释液）、阳性对照孔（已知浓度标准品）和阴性对照孔（无目标物）。

*孵育：将微孔板置于37°C恒温箱或室温避光环境下孵育2-4小时，或4°C过夜孵育以增强结合。

*洗涤：孵育结束后，小心吸弃孔内液体，用洗涤液（如PBS-T或洗涤缓冲液）洗涤3-5次，每次洗涤时用吸水纸拍干边缘（或使用洗板机），每次洗涤约30-60秒。洗涤是去除未结合抗体的关键步骤，直接影响结果准确性。

***(2)封闭（Blocking）**：

***目的**：封闭微孔板表面未被捕获抗体结合的位点（如孔壁的疏水基团、蛋白残留等），防止后续的非特异性结合。

***操作**：

*配制封闭液：常用封闭液包括5%脱脂奶粉、3-5%BSA（牛血清白蛋白）或非fat奶粉。用稀释液或封闭缓冲液（pH7.2-7.4）配制。

*加样：向每个微孔中加入100-200µL封闭液。

*孵育：室温避光孵育1-2小时，或4°C过夜孵育以获得更充分的封闭效果。

*洗涤：同包被后的洗涤步骤，洗涤3-5次，去除未封闭的封闭液。

***(3)加样（Sample/WesternBlot）**：

***目的**：加入含有待测目标分子的样本或WesternBlot转膜后的膜条，使其与固定在孔内的捕获抗体结合。

***操作**：

*样本准备：根据样本类型（血清、细胞裂解液、组织提取液等）进行适当稀释或直接使用。确保样本无沉淀或气泡。

*加样：向每个微孔中加入100µL样本（或WesternBlot膜条）。

*孵育：室温避光孵育1-2小时，或4°C过夜孵育以增强结合。孵育时间需根据样本浓度和抗体灵敏度优化。

*洗涤：同包被后的洗涤步骤，洗涤3-5次。

***(4)加酶标二抗（Substrate/WesternBlot）**：

***目的**：加入酶标记的二级抗体（DetectionAntibody），该抗体能与样本中结合的捕获抗体（或WesternBlot膜上的目标蛋白）结合。

***操作**：

*配制酶标二抗工作液：将酶标二抗用稀释液或抗体稀释液稀释至适当浓度（通常1-10µg/mL）。

*加样：向每个微孔中加入100µL酶标二抗工作液。

*孵育：室温避光孵育1小时，或4°C过夜孵育。

*洗涤：同包被后的洗涤步骤，洗涤3-5次。此步洗涤尤为重要，需确保去除未结合的二抗，减少背景干扰。

***(5)显色（SubstrateAddition/WesternBlot）**：

***目的**：加入酶的底物，酶催化底物产生有色产物，颜色深浅与结合的酶标二抗量成正比。

***操作**：

*配制底物溶液：根据所用酶（如辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP）选择相应的底物（如TMB、OPD、BCIP/NBT等），用底物缓冲液配制工作液。注意底物通常需现配现用或低温保存。

*加样：向每个微孔中加入100-200µL底物溶液。注意避光操作，特别是对光敏感的TMB底物。

*显色反应：室温避光孵育15-30分钟。反应时间需根据酶活性和抗体结合情况优化，避免过度反应导致颜色不均或背景过高。可轻微晃动板架促进反应均匀。

***(6)终止（StopSolution/WesternBlot）**：

***目的**：立即停止酶的催化反应，使显色稳定在目标范围内，便于酶标仪检测。

***操作**：向每个微孔中加入50-100µL终止液（如2MH₂SO₄或1MHCl）。终止液会改变底物的pH环境，使颜色反应停止。

***(7)检测（Detection）**：

***目的**：使用酶标仪在特定波长下测定各孔的吸光度值（OD值）。

***操作**：

*设定参数：在酶标仪上设定检测波长（如TMB显色为450nm，设参考波长，通常为630nm）和读数孔。

*测定：将微孔板放在酶标仪中自动读取各孔的OD值。记录数据。

3.**结果分析**：

*使用Excel或专业软件（如GraphPadPrism）进行数据分析。

*计算各样本孔的OD值平均值。

*以空白孔调零（BlankCorrection），扣除背景吸收。

*绘制标准曲线（若使用已知浓度的标准品）：以标准品浓度对数为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。

*计算样本浓度：将样本的平均OD值代入标准曲线方程，计算出样本中目标分子的浓度或相对含量。

*进行统计学分析（如t检验、ANOVA），比较组间差异的显著性。

4.**关键注意事项**：

***微孔板选择**：根据实验需求选择合适的微孔板材质（如聚苯乙烯）和表面处理（如疏水/亲水）。

***抗体质量**：确保抗体特异性强、背景低、效价合适。

***稀释液选择**：所有稀释液应无污染、无酶抑制物，使用无热原水配制。

***洗涤彻底**：洗涤是ELISA成功的关键，必须确保每次洗涤充分，避免背景过高。

***温度控制**：孵育温度和时间需标准化，过高或过低、过长或过短均会影响结果。

***避光操作**：对光敏感的试剂（如TMB底物）需全程避光。

***酶标仪校准**：定期校准酶标仪，确保读数准确。

**(二)免疫荧光技术**

1.**原理**：

*免疫荧光技术（ImmunofluorescenceTechnique）是利用荧光标记的抗体（荧光二抗）或荧光标记的抗原，与细胞或组织样本中的目标分子结合，通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备检测荧光信号，从而实现对目标分子定位、定量或定性分析的技术。根据检测对象不同，可分为免疫细胞荧光和免疫组化荧光。荧光标记的染料在特定波长的激发光照射下会发出不同颜色的荧光，便于多重标记和区分。

2.**操作步骤（以免疫细胞荧光为例）**：

***(1)细胞制备与固定**：

***目的**：制备单细胞悬液或将组织切片，并使细胞/组织成分固定，维持其形态和抗原性。

***操作**：

*细胞悬液：若为新鲜细胞，用胰蛋白酶等消化制成单细胞悬液，洗涤1-2次。

*组织切片：新鲜或福尔马林固定的组织，脱水、透明、石蜡包埋（若做冰冻切片则直接冷冻切片），切片厚度通常为5-10µm。

*固定：根据细胞类型或组织性质选择合适的固定剂。常用固定剂包括：

*甲醇（-20°C，快速冷冻固定，适用于多数细胞和冰冻切片，能较好地保存抗原，但可能导致细胞收缩变形）。

*4%多聚甲醛（pH7.4，室温或4°C，适用于多种细胞和冰冻切片，能较好地固定蛋白质，但可能封闭抗原表位，需后续通透）。

*冰醋酸（-20°C，适用于某些特定抗原，通透性好，但可能导致细胞脆化）。

*处理：将细胞悬液滴加在预先放置好盖玻片的载玻片上，或直接将切片放置在载玻片上，滴加固定液。固定时间通常为10-30分钟，具体时间需优化。

***(2)通透（Permeabilization）**：

***目的**：使细胞膜或细胞壁通透性增加，有利于抗体进入细胞内部结合胞内抗原，或使固定过程中变性的蛋白质恢复部分溶解性。

***操作**：

*选择通透剂：常用通透剂包括0.1%TritonX-100、0.25%NP-40、0.1%SDS（使用需谨慎，可能导致蛋白质变性过度）。

*处理：用冰冷的通透剂溶液（通常含0.1%PBS-Tween20或0.1%SDS）处理细胞或组织切片，室温孵育5-20分钟。通透时间需根据细胞类型和实验目的优化。

*洗涤：用PBS或洗涤缓冲液洗涤3-5次，每次5分钟，以去除通透剂。

***(3)封闭（Blocking）**：

***目的**：封闭细胞表面或组织切片上的内源性过氧化物酶活性（若后续需酶标），以及非特异性结合位点（如细胞表面受体、内源性蛋白等），减少背景荧光。

***操作**：

*选择封闭液：常用封闭液包括5%脱脂奶粉、3-5%BSA（牛血清白蛋白）、血清（同种来源血清效果更佳）。

*处理：将封闭液滴加在样本上，覆盖完全。室温避光孵育30分钟-2小时，或4°C过夜封闭。

*洗涤：同洗涤步骤，洗涤3-5次。

***(4)孵育一抗（PrimaryAntibodyIncubation）**：

***目的**：加入特异性识别目标抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，使其与样本中的目标分子结合。

***操作**：

*配制一抗工作液：将特异性一抗用封闭液或抗体稀释液稀释至适当浓度（通常0.1-10µg/mL，需预实验确定最佳浓度）。

*处理：将一抗工作液滴加在样本上，覆盖完全。建议使用封闭体系（如含血清的封闭液稀释）以提高抗体稳定性。

*孵育：盖上盖玻片或盖皿，置于湿盒中（防止水分蒸发），在4°C冰箱孵育过夜（适用于多数一抗，可增强结合信号），或室温孵育1-2小时（适用于高亲和力一抗或易降解的样本）。

***(5)洗涤**：

***目的**：去除未结合的一抗，减少非特异性信号。

***操作**：用洗涤缓冲液（如PBS-T或0.05%Tween20-PBS）洗涤3-5次，每次5分钟。可根据需要增加洗涤次数。

***(6)孵育二抗（SecondaryAntibodyIncubation）**：

***目的**：加入酶标记或荧光标记的二级抗体，该抗体能与样本中结合的一抗结合，从而间接检测目标抗原。荧光二抗是本技术中最常用的标记方式。

***操作**：

*选择与一抗物种匹配的二抗：例如，若一抗为兔源，则选择羊抗兔IgG荧光二抗。若检测细胞表面蛋白，常选用C3/celllinker等特殊荧光二抗，无需通透步骤。

*配制二抗工作液：将荧光二抗用洗涤缓冲液或抗体稀释液稀释至适当浓度（通常1-10µg/mL）。

*处理：将二抗工作液滴加在样本上，覆盖完全。盖上盖玻片或盖皿，置于湿盒中。

*孵育：室温避光孵育30-60分钟。孵育时间过长可能导致荧光信号扩散。

***(7)洗涤**：

***目的**：去除未结合的二抗。

***操作**：同孵育一抗后的洗涤步骤。

***(8)脱水与封片（DehydrationandMounting）**：

***目的**：使样本从水相转移到有机相，便于荧光观察，并长期保存荧光信号。

***操作**：

*脱水：按梯度增加酒精浓度（如50%,70%,90%,100%乙醇）洗涤2-3次，每次3-5分钟。更换酒精时需用吸水纸吸干边缘液体。

*清洗：用纯丙酮或无水乙醇清洗一次，去除残留水分。

*封片：滴加适量抗荧光淬灭封片剂（MountingMedium）于样本表面，盖上盖玻片。封片剂能有效延长荧光信号的保存时间，并减少荧光淬灭。注意盖玻片边缘要完全被封片剂覆盖，防止水分侵入。

***(9)成像与分析**：

***目的**：使用荧光显微镜或流式细胞仪观察并记录荧光信号。

***操作**：

*荧光显微镜：将封片好的载玻片放置在荧光显微镜上，选择合适的激发光源和滤光片组（根据荧光染料种类选择，如FITC、AlexaFluor488、TRITC、AlexaFluor594等）。调节光圈、对比度等参数，拍照记录。可进行多通道同时成像。

*流式细胞术：若在流式细胞仪上检测，需将样本制成单细胞悬液，调整细胞浓度，上机检测。需设置同型对照（用等浓度同型IgG代替一抗或二抗）以排除非特异性结合。

3.**结果分析**：

***定性分析**：观察目标抗原在细胞内的定位（如细胞核、细胞质、细胞膜）和表达模式（如均匀表达、点状聚集）。

***半定量分析**：通过改变一抗浓度或使用图像分析软件（如ImageJ,ImageProPlus）对荧光强度进行定量分析，比较不同组间的表达差异。

***定量分析（流式细胞术）**：通过设置门控，分析目标细胞群体的荧光强度分布，计算阳性细胞率、平均荧光强度（MFI）等参数。

4.**关键注意事项**：

***抗体选择**：选择特异性强、背景低、已验证过效果的抗体。注意一抗和二抗的物种来源匹配。

***固定剂和通透剂优化**：不同的固定剂和通透剂对抗原的影响不同，需根据实验目的和样本类型进行优化选择。

***封闭充分**：封闭不充分会导致高背景，封闭过度可能封闭抗原表位，导致信号减弱。封闭时间、温度和封闭液浓度需优化。

***荧光淬灭**：盖玻片边缘残留水分或未完全覆盖的封片剂会吸收荧光，导致信号减弱。确保封片剂完全覆盖。

***荧光串色**：不同荧光染料之间可能存在串色，选择光谱分离好的染料，并在成像时使用相应的滤光片组。

***对照设置**：必须设置阴性对照（不加一抗或用同型IgG代替一抗），以排除非特异性结合。

**(三)流式细胞术（FCM）**

1.**原理**：

*流式细胞术（FlowCytometry,FCM）是一种可以对悬浮细胞或组织细碎片段进行快速、多参数、单细胞水平分析的技术。其基本原理是利用液流系统将细胞逐一、单个地通过激光束照射区域，同时收集细胞散射光信号和荧光信号，通过荧光探测器检测并转换成电信号，再经计算机处理，最终获得每个细胞在多个参数（如细胞大小、颗粒度、多种荧光标记物强度等）上的信息。通过使用荧光标记的抗体，可以检测细胞表面的标记物（如细胞因子受体、分选抗体）或胞内标记物（需使用通透/染色试剂盒）。

2.**操作步骤（以检测细胞表面标志物为例）**：

***(1)细胞制备**：

***目的**：获得纯净、单分散的细胞悬液。

***操作**：

*样本处理：新鲜组织需进行酶消化（如胶原酶）或机械破碎（如组织研磨器）获取细胞。血液样本需使用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心分离。

*洗涤：收集到的细胞通常含有培养基、血液成分等杂质，需用PBS或细胞洗涤缓冲液洗涤1-3次，去除杂质。

*计数与调整浓度：使用细胞计数板或细胞计数仪计数细胞总数，并用细胞培养基或细胞洗涤缓冲液将细胞浓度调整至所需范围（通常为1x10⁵-1x10⁸cells/mL，取决于后续实验和仪器设置）。

*预实验（可选）：对于分选实验，需先进行预实验确定最佳分选阈值。

***(2)孵育细胞因子抑制剂（可选）**：

***目的**：阻断细胞表面受体的进一步下调或上调，使细胞表面标记物表达状态稳定。

***操作**：在特定条件下（如37°C、4°C或室温），用含或不含细胞因子抑制剂的缓冲液孵育细胞15-30分钟。常用抑制剂包括Phenylarsineoxide(PAO)、BrefeldinA(BFA)、Monensin等，根据实验目的选择。

***(3)孵育一抗（PrimaryAntibodyIncuba