DB13-T 1116-2009 焦糖色中的4-甲基咪唑的测定 高效液相色谱法

DB13T11162009焦糖色中的4甲基咪唑的测定高效液相色谱法本标准规定了采用高效液相色谱法测定焦糖色中4甲基咪唑含量的方法。本标准适用于各类焦糖色产品中4甲基咪唑的定量分析。样品经甲醇水溶液提取，采用C18色谱柱分离，以甲醇水溶液为流动相进行梯度洗脱，在210nm波长下检测。外标法定量，方法检出限为0.5mg/kg，定量限为1.5mg/kg，加标回收率为92.5%~105.3%，相对标准偏差小于3.0%。2原理焦糖色样品中的4甲基咪唑经甲醇水溶液超声提取后，通过离心分离去除不溶性杂质，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤。滤液注入高效液相色谱系统，在C18反相色谱柱上，采用甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱，利用4甲基咪唑在210nm波长处的紫外吸收特性进行检测。根据保留时间定性，外标工作曲线法定量。3试剂与材料3.1试剂3.1.1甲醇：色谱纯3.1.2水：超纯水，电阻率≥18.2MΩ·cm3.1.34甲基咪唑标准品：纯度≥99.0%3.1.4甲酸：色谱纯3.2溶液配制3.2.1流动相A：甲醇水（10:90，V/V），含0.1%甲酸3.2.2流动相B：甲醇水（90:10，V/V），含0.1%甲酸3.2.3提取溶剂：甲醇水（50:50，V/V）3.2.44甲基咪唑标准储备溶液（1000mg/L）：准确称取0.1000g4甲基咪唑标准品，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，4℃避光保存，有效期3个月。3.2.54甲基咪唑标准工作溶液：准确吸取适量标准储备溶液，用提取溶剂逐级稀释成浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L的标准工作溶液，现用现配。3.3材料3.3.1微孔滤膜：0.45μm，有机系3.3.2针式过滤器：13mm×0.45μm，有机系3.3.3容量瓶：10mL、25mL、50mL、100mL3.3.4移液管：1mL、5mL、10mL4仪器与设备4.1高效液相色谱仪：配备紫外检测器或二极管阵列检测器4.2色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm，或相当者4.3分析天平：感量0.0001g4.4超声波清洗器：功率250W，频率40kHz4.5离心机：转速≥10000r/min4.6涡旋混合器4.7恒温水浴锅4.8pH计：精度±0.014.9微量进样器：10μL、50μL、100μL5分析步骤5.1样品处理准确称取2.0g（精确至0.001g）焦糖色样品于50mL具塞离心管中，加入20.0mL提取溶剂，涡旋混合2min，超声提取30min，期间每隔10min涡旋混合一次。提取液于10000r/min离心10min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液待测。5.2色谱条件5.2.1流动相：A相为甲醇水（10:90，V/V），含0.1%甲酸；B相为甲醇水（90:10，V/V），含0.1%甲酸5.2.2梯度洗脱程序：0~10min，10%B~30%B；10~15min，30%B~50%B；15~20min，50%B~10%B；20~25min，10%B5.2.3流速：1.0mL/min5.2.4柱温：30℃5.2.5检测波长：210nm5.2.6进样量：10μL5.3标准曲线绘制分别吸取10μL各浓度标准工作溶液注入高效液相色谱仪，按5.2规定的色谱条件进行测定。以4甲基咪唑浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。5.4样品测定取10μL样品待测液注入高效液相色谱仪，按5.2规定的色谱条件进行测定，记录峰面积，根据标准曲线计算样品中4甲基咪唑的含量。6结果计算样品中4甲基咪唑的含量按式（1）计算：X=(c×V)/m式中：X——样品中4甲基咪唑的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c——从标准曲线上查得的样品溶液中4甲基咪唑的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V——样品溶液的定容体积，单位为毫升（mL）；m——样品质量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。7精密度和准确度7.1精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。7.2准确度本方法的加标回收率为92.5%~105.3%，相对标准偏差小于3.0%。8检出限和定量限本方法的检出限为0.5mg/kg，定量限为1.5mg/kg。9注意事项9.1标准溶液应现用现配，避免长时间放置导致降解。9.2样品提取过程中应严格控制超声时间和温度，避免4甲基咪唑分解。9.3色谱柱使用后应充分清洗，延长使用寿命。9.4流动相使用前应超声脱气，避免基线噪声。9