免疫学抗体检测操作规程

免疫学抗体检测操作规程一、概述

免疫学抗体检测是利用抗原抗体特异性结合原理，通过检测样本中目标抗体的存在或含量，进行疾病诊断、健康评估或研究分析的重要技术。本规程旨在规范免疫学抗体检测的操作流程，确保检测结果的准确性和可靠性。操作人员需严格按照规程执行，熟悉相关仪器设备、试剂原理及安全注意事项。

二、仪器与试剂准备

（一）仪器设备

1.酶标仪

2.微量移液器（不同量程）

3.水浴锅

4.电动混匀器

5.冰箱（2-8℃）

6.超净工作台

（二）试剂与耗材

1.标准品/质控品

2.样本稀释液（pH7.4PBS缓冲液）

3.酶标抗体（辣根过氧化物酶标记）

4.底物溶液（TMB显色液）

5.终止液（2MH₂SO₄）

6.96孔酶标板

7.无菌吸头

三、操作步骤

（一）样本处理

1.样本采集：采集静脉血或组织样本，避免溶血。

2.处理方法：

(1)血清样本：室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清。

(2)组织样本：匀浆后加入蛋白酶K消化，提取总蛋白。

（二）加样步骤

1.配制样本：将样本用稀释液按1:5稀释，混匀。

2.加样操作：

(1)设定复孔，每孔加入100μL样本或标准品。

(2)设阴性对照（空白稀释液）、阳性对照（已知抗体标准）。

（三）孵育与反应

1.抗体孵育：

(1)加入50μL酶标抗体，37℃孵育60分钟。

(2)用稀释液洗涤3次，每次300μL，吸干。

2.显色反应：

(1)加入100μL底物溶液，避光孵育30分钟。

(2)加入50μL终止液，终止反应。

（四）结果检测

1.酶标仪检测：450nm波长读板，记录OD值。

2.数据分析：计算样本浓度，对比阳性对照确定结果。

四、质量控制

（一）质控要求

1.每批次检测必须包含阴性对照和阳性对照。

2.标准曲线R²值应≥0.98。

（二）常见问题排查

1.结果偏高：检查样本是否存在干扰物（如高甘油三酯）。

2.结果偏低：确认抗体浓度及孵育时间是否准确。

五、安全注意事项

（一）个人防护

1.佩戴手套、护目镜，实验服覆盖皮肤。

2.操作后用75%酒精消毒台面。

（二）废弃物处理

1.化学废弃物按实验室规定分类处理。

2.废弃吸头和酶标板统一收集。

六、记录与保存

（一）记录要求

1.记录样本编号、检测日期、操作人。

2.保存原始数据及结果分析报告。

（二）试剂保存

1.酶标抗体及底物需避光保存于2-8℃。

2.使用后未开封试剂可冷藏保存1个月。

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**一、概述**

免疫学抗体检测是利用抗原抗体之间高度特异性的结合反应，通过体外实验方法检测生物样本（如血清、血浆、组织液等）中特定抗体的存在、浓度或活性。该技术广泛应用于医学诊断（如传染病筛查、自身免疫性疾病检测）、生物研究（如药物研发、疫苗效果评估）、食品安全（如过敏原检测）等领域。抗体检测方法多样，常见的包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、胶体金免疫层析法（试纸条）等。本规程以酶联免疫吸附试验（ELISA）为例，详细阐述抗体检测的操作流程。本规程旨在为实验室操作人员提供标准化的操作指导，确保检测过程的规范性和检测结果的准确性、可靠性，减少操作误差和潜在风险。

**二、仪器与试剂准备**

（一）仪器设备

1.酶标仪：具备450nm滤光片，推荐使用双波长酶标仪（如450/600nm）以提高精度，需定期校准。配备可移动的吸液针头，确保读数一致。

2.微量移液器：配置不同量程（如1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL），需经过校准，并使用对应规格的无菌吸头。操作人员应熟悉其使用方法，特别是预吸、吹打、触壁等关键步骤。

3.水浴锅：温度范围可调（建议0-60℃），具有温度均匀性监测功能，配备智能控温系统。

4.电动混匀器/涡旋混合器：用于混匀样本、试剂和洗涤液，确保充分均匀。涡旋混合器适用于小体积快速混匀，需注意避免过度涡旋导致气泡或样品变性。

5.冰箱：用于保存低温要求试剂（2-8℃）和样本，确保温度稳定。

6.超净工作台/生物安全柜：提供无菌操作环境，防止样品污染。使用前需进行空间灭菌（如紫外灯照射30分钟，或使用循环风杀菌模式），并检查风速和过滤器状态。

7.电子天平：用于精确称量试剂（如洗涤液、稀释液），精度至少为±0.1mg。

8.移液枪架：便于规范操作和存放移液器。

9.实验台：建议使用耐腐蚀、易清洁的材料。

（二）试剂与耗材

1.样本稀释液：通常为磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4±0.1），需新鲜配制或使用商业试剂盒提供的即用型稀释液。使用前需确认无沉淀或污染。

2.酶标抗体（检测抗体）：即用于捕获样本中目标抗原或直接与样本中目标抗原结合的酶标抗体。需检查试剂说明书，了解其工作浓度、储存条件（通常为2-8℃或-20℃）和有效期。使用前需在室温或37℃水浴中适当复温（根据说明书要求，通常15-30分钟），并充分混匀。

3.标准品/质控品：标准品用于建立标准曲线，质控品用于监控批间和批内变异。标准品应具有已知浓度且在有效期内的证书。质控品应覆盖临床诊断或研究的相关范围。需按说明书要求稀释或直接使用。

4.抗原包被液：用于包被固相载体的溶液，通常是含0.05%Tween-20的PBS或包被缓冲液（根据抗体性质选择）。需新鲜配制或按说明书使用。

5.底物溶液（TMB显色液）：辣根过氧化物酶（HRP）的显色剂，通常是含有TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）和H₂O₂的溶液。需新鲜配制或使用试剂盒配套试剂，避免光照。显色液对光敏感，配制和储存需避光。

6.终止液：用于终止酶促反应，通常是2MH₂SO₄或浓盐酸。需现配现用，具有强酸性，操作时需小心。

7.96孔酶标板：聚苯乙烯材质，需具有低吸附性，建议使用预包被板或经处理（如用包被液封闭）的板。使用前检查板孔是否清洁、透明，无破损。

8.无菌吸头：根据不同加样体积选择合适规格（如200μL、100μL、50μL、10μL等），需保证无菌，建议使用一次性无菌吸头。

9.封闭液（可选）：如脱脂奶粉、BSA（牛血清白蛋白）溶液，用于阻断非特异性结合位点，减少背景干扰。通常为含0.05%Tween-20的PBS或封闭缓冲液。

10.洗涤液：通常为含0.05%Tween-20的PBS或洗涤缓冲液。需使用纯化水配制，确保无离子污染物。使用前需混匀。

**三、操作步骤**

（一）样本处理与准备

1.样本接收与标识：接收样本时核对样本标签信息与委托单是否一致，记录样本编号、接收时间。确保样本量充足（至少满足检测所需体积及浪费）。对样本进行清晰标识，防止混淆。

2.样本储存：未检测样本根据要求储存于2-8℃或-20℃冰箱，避免反复冻融。需记录冻融次数。

3.样本处理：

(1)血清/血浆样本：室温静置30分钟～1小时，使标本充分凝血（对于血浆样本）。3000rpm离心10分钟，小心吸取上清，避免吸到管底沉淀或组织碎屑。若样本为高脂血症，可能需进行脂血清除或稀释处理。

(2)组织样本：新鲜组织或冻存组织块用无菌生理盐水冲洗。根据组织类型选择合适的匀浆方法（如组织捣碎器、超声波细胞粉碎机），匀浆时可加入蛋白酶K（根据说明书浓度）进行组织蛋白消化。10000rpm离心20分钟，取上清液。必要时可通过透析或超滤去除大分子物质或蛋白酶。

(3)其他样本（如尿液、脑脊液等）：按相应样本类型说明书处理，必要时进行离心或过滤。

4.样本稀释：根据试剂盒说明书要求，用样本稀释液将样本进行适当稀释。例如，若要求样本稀释50倍，则取100μL样本加入含有400μL稀释液的离心管中，充分混匀。混匀可用涡旋混合器快速混匀或颠倒混匀10次以上。稀释后的样本需在规定时间内完成检测，避免长时间放置导致抗体活性变化。

（二）ELISA板准备与包被（以双抗体夹心法为例）

1.试剂平衡：所有试剂（稀释液、包被液、抗体、酶标抗体、洗涤液、底物液、终止液）在使用前均需在室温或37℃水浴中平衡15-30分钟，使其温度与反应体系一致，减少因温差带来的误差。

2.包被板处理：

(1)取出酶标板，检查板孔是否有破损或污渍。如有问题，应更换新板。

(2)用移液器吸取适量包被液（含抗原），加入每个孔中，每孔约100-200μL。注意加样速度均匀，避免产生气泡。

(3)将酶标板置于湿盒（底部垫有湿润纱布或保鲜膜）中，封口膜封好，放入37℃水浴箱或恒温箱孵育1-4小时（具体时间根据说明书和抗原稳定性确定）。孵育过程中保持湿度，防止板底液体蒸发。

3.洗涤：孵育结束后，小心吸弃板内液体（可倾斜板子，用吸水纸吸去边缘液体，但不要吸干孔内液体）。用洗板机或手工洗涤：

(1)向每个孔加入洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）约250μL，浸泡1-2分钟。

(2)弹出或吸弃洗涤液。重复此洗涤步骤5次。

(3)洗涤后，可在酶标仪上用空白孔调零（调零背景），确保后续读数准确。或直接吸干/吹干残余洗涤液（建议使用洗板机的吸水功能，避免气泡）。

（三）样本/标准品加样与孵育

1.加样样本/标准品：在洗涤后的酶标板上，用微量移液器依次加入样本稀释液（或标准品稀释液）和样本/标准品。每个样本/标准品设复孔（至少2孔）。建议按以下顺序加样：阴性对照、空白对照（仅稀释液）、低浓度标准品、中浓度标准品、高浓度标准品、样本1、样本2……。每个孔加入体积必须准确（通常是100μL）。

2.孵育：将加样后的酶标板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒温箱孵育1-2小时（具体时间根据说明书和抗体性质确定）。孵育过程中避免震动，确保抗体与样本/标准品充分结合。

（四）洗涤（封闭后）

1.吸弃孵育液：同包被后的洗涤步骤，小心吸弃孔内液体。

2.洗涤：向每个孔加入洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）约250μL，浸泡1-2分钟。

3.弹出或吸弃洗涤液。重复此洗涤步骤5次。

4.吸干/吹干残余洗涤液。此步洗涤对后续结果影响很大，需彻底。

（五）加酶标抗体

1.复温与混匀：取出酶标抗体，在室温或37℃水浴中平衡15-30分钟。充分混匀酶标抗体，确保HRP标记的抗体分布均匀。

2.加样：用微量移液器依次向每个孔中加入酶标抗体。每个样本/标准品设复孔。每孔加入体积必须准确（通常是100μL）。

3.孵育：将加样后的酶标板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒温箱孵育1小时左右（具体时间根据说明书和抗体性质确定）。孵育过程中避免震动。

（六）洗涤（酶标抗体孵育后）

1.吸弃孵育液：小心吸弃孔内液体。

2.洗涤：向每个孔加入洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）约250μL，浸泡1-2分钟。

3.弹出或吸弃洗涤液。重复此洗涤步骤5次。

4.吸干/吹干残余洗涤液。此步洗涤对于去除未结合的酶标抗体至关重要，需非常彻底，以降低背景值。

（七）加底物溶液显色

1.复温与混匀：取出底物溶液（TMB显色液），在室温或37℃水浴中平衡5-10分钟。**注意：底物溶液通常对光敏感，此步骤应在避光条件下进行或使用避光酶标板。**充分混匀底物溶液。

2.加样：用微量移液器依次向每个孔中加入底物溶液。每孔加入体积必须准确（通常是100μL）。**加完底物后，应立即放入避光环境中孵育。**

3.孵育：将加样后的酶标板放入37℃避光水浴箱孵育15-30分钟（具体时间根据说明书和底物稳定性确定）。孵育过程中避免震动和光线直射。显色程度与抗体浓度成正比，但需注意避免过度孵育导致颜色褪色。

（八）加终止液终止反应

1.吸弃底物液：小心吸弃孔内显色液（注意不要吸干）。

2.加终止液：用微量移液器依次向每个孔中加入终止液。每孔加入体积必须准确（通常是50-100μL，需根据终止液浓度和酶标仪读数范围调整）。终止液为强酸，加入时会产生气体，需缓慢加入并确保混合均匀。

3.静置：加入终止液后，混匀酶标板（轻轻摇晃或拍打），使颜色充分反应。然后静置几分钟，待颜色稳定。

（九）结果检测

1.立即读板：终止反应后，**应立即**使用酶标仪在450nm波长处读取OD值。对于双波长检测，同时读取450nm和600nm（或参考波长）的OD值，计算吸光度差值（450-600nm）以排除背景干扰。

2.记录数据：准确记录每个孔的OD值。同时记录酶标板上的样本/标准品位置。

3.处理数据：将原始OD值导入数据分析软件（如Excel、专业ELISA数据分析软件），根据标准品的浓度和OD值绘制标准曲线（常用四参数Logistic曲线或线性回归），计算样本的浓度或相对含量。

**四、质量控制**

（一）质控要求

1.每个实验都必须包含：

(1)阴性对照：不含目标抗体的样本稀释液或生理盐水，用于检测非特异性结合和背景信号。

(2)阳性对照：含有已知浓度目标抗体的标准品或质控品，用于确认检测系统工作正常，并评估灵敏度。

(3)样本复孔：每个样本至少做两个平行孔，计算平均值，以减少随机误差。若两个孔结果差异过大（如超过平均值的20%或说明书规定范围），需重新检测该样本。

2.标准曲线建立：使用至少3个浓度梯度（通常跨越3个数量级）的标准品绘制标准曲线。标准曲线应具有良好的线性关系，R²值（相关系数）通常要求≥0.98或根据说明书要求。

3.质控品检测：使用批内质控（同批样本检测）和批间质控（不同批样本或不同实验日检测）质控品。质控品结果应在预定的范围内（如±15%或±20%的靶值范围，具体参考质控品说明书）。质控结果失控时，需查找原因并重新检测。

4.空白对照检查：空白对照的OD值应较低，通常在0.1-0.2之间（根据仪器和试剂灵敏度调整），若空白值过高，提示洗涤不彻底或试剂/样本污染。

（二）常见问题排查与解决

1.**背景过高（所有孔OD值均偏高）**：

*检查洗涤是否彻底，洗涤液是否正确使用（含Tween-20）。

*检查酶标板是否清洁，有无油污或划痕。

*检查试剂是否污染（如酶标抗体、底物开盖时间过长）。

*检查样本是否含有高浓度非特异性物质（如高甘油三酯、高脂血，可能需要预处理或稀释）。

*检查操作过程有无非特异性结合（如封闭不充分或过度）。

2.**背景过低（所有孔OD值均偏低）**：

*检查底物溶液是否新鲜，储存条件是否正确。

*检查酶标抗体是否失效或储存不当。

*检查孵育时间是否不足或温度不适宜。

*检查样本稀释是否过度或加样体积不准确。

3.**标准曲线线性差（R²<0.98）**：

*检查标准品是否在有效期内，储存是否正确。

*检查标准品是否被污染或溶解不均匀。

*检查包被抗原浓度是否合适。

*检查各步骤孵育时间、温度是否一致且正确。

*检查洗涤过程是否规范，有无气泡。

4.**样本结果偏高**：

*检查样本是否被污染。

*检查样本是否含有高浓度钩状效应物质（Heterophilicantibodies，可能与靶抗体竞争结合位点，需尝试高稀释度检测）。

*检查样本处理是否不当（如脂血未处理）。

5.**样本结果偏低**：

*检查样本是否被稀释过度。

*检查加样过程是否准确，有无加样错误。

*检查酶标抗体是否失效或储存不当。

*检查孵育过程是否充分。

**五、安全注意事项**

（一）个人防护

1.**必须**佩戴实验服、口罩、防护眼镜或面屏。长时间操作或处理刺激性试剂时，应佩戴手套（建议使用丁腈或乳胶手套）。

2.操作具有传染性风险（如检测病原体抗体）的样本时，应在生物安全柜内进行，并采取相应的生物安全级别防护措施。

3.使用微量移液器时，注意避免喷溅。吸取和排放液体时，动作应轻柔。

4.处理酸（终止液）时，应佩戴耐酸手套，避免接触皮肤和眼睛。在通风良好的台面上操作。

5.操作结束后，彻底清洗双手。

（二）试剂安全

1.所有试剂标签清晰，取用前仔细阅读说明书，了解其性质（如腐蚀性、刺激性、易燃性）和安全操作要求。

2.底物溶液（TMB）对光敏感且可能具有刺激性，配制和储存需避光，操作时避免接触皮肤和眼睛。若不慎接触，应立即用大量流动清水冲洗。

3.终止液为强酸，具有强腐蚀性，操作时需特别小心，避免溅出。配制时应在通风橱中进行。

4.乙醇等有机溶剂具有一定的易燃性，使用时远离明火，确保实验区域通风良好。

5.试剂应妥善储存，避免混淆和污染。开封后的试剂根据其稳定性按说明书要求保存和使用。

（三）废弃物处理

1.实验产生的所有废弃物，包括使用过的吸头、移液器头、酶标板、废弃样本、离心管等，应分类收集到指定的废弃物容器中。

2.含有潜在生物风险的样本和试剂（如未灭活的临床样本、洗涤液等）必须经过高压蒸汽灭菌处理后才能作为普通医疗废物处理，或按实验室规定进行化学消毒。

3.废弃化学试剂（如洗涤液、底物液剩余部分、终止液等）不得直接倒入下水道。应按照实验室化学废弃物管理规定进行收集和处理，交由有资质的机构处理。

4.废弃酶标板通常需要高压灭菌后，方可按普通垃圾或化学废弃物处理，具体依据当地法规和实验室规定。

**六、记录与保存**

（一）记录要求

1.每次检测实验均需填写详细的实验记录表。记录内容应包括：

*实验日期和время

*实验员姓名和编号

*仪器设备名称和编号

*试剂名称、批号、有效期、操作浓度

*实验方案（如标准曲线范围、孵育条件等）

*样本信息（编号、来源、稀释倍数等）

*阴性对照、阳性对照、空白对照的OD值

*所有样本/标准品的原始OD值

*绘制标准曲线的参数（方程式、R²值）

*样本计算结果（浓度或相对含量）

*实验过程中遇到的问题及解决方法

2.记录应清晰、准确、及时，字迹工整或电子记录无误。

3.如使用自动化系统，需打印原始数据报告并存档。

（二）试剂保存

1.所有试剂（包括自配和商业试剂盒配套试剂）均需有清晰的标签，注明名称、浓度、配制/开瓶日期、有效期、操作说明（如是否需要平衡、平衡温度和时间）。

2.试剂应按其要求的储存条件（2-8℃、-20℃、-80℃等）储存。使用前检查试剂是否在有效期内，有无变色、沉淀、浑浊等异常现象。开封后的试剂使用量应记录，并按其稳定性要求尽快使用完毕或重新密封冷藏。

3.底物溶液等光敏感试剂应储存于棕色瓶中，并置于避光处。

4.废弃试剂或过期试剂应按照实验室规定进行安全处置。

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一、概述

免疫学抗体检测是利用抗原抗体特异性结合原理，通过检测样本中目标抗体的存在或含量，进行疾病诊断、健康评估或研究分析的重要技术。本规程旨在规范免疫学抗体检测的操作流程，确保检测结果的准确性和可靠性。操作人员需严格按照规程执行，熟悉相关仪器设备、试剂原理及安全注意事项。

二、仪器与试剂准备

（一）仪器设备

1.酶标仪

2.微量移液器（不同量程）

3.水浴锅

4.电动混匀器

5.冰箱（2-8℃）

6.超净工作台

（二）试剂与耗材

1.标准品/质控品

2.样本稀释液（pH7.4PBS缓冲液）

3.酶标抗体（辣根过氧化物酶标记）

4.底物溶液（TMB显色液）

5.终止液（2MH₂SO₄）

6.96孔酶标板

7.无菌吸头

三、操作步骤

（一）样本处理

1.样本采集：采集静脉血或组织样本，避免溶血。

2.处理方法：

(1)血清样本：室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清。

(2)组织样本：匀浆后加入蛋白酶K消化，提取总蛋白。

（二）加样步骤

1.配制样本：将样本用稀释液按1:5稀释，混匀。

2.加样操作：

(1)设定复孔，每孔加入100μL样本或标准品。

(2)设阴性对照（空白稀释液）、阳性对照（已知抗体标准）。

（三）孵育与反应

1.抗体孵育：

(1)加入50μL酶标抗体，37℃孵育60分钟。

(2)用稀释液洗涤3次，每次300μL，吸干。

2.显色反应：

(1)加入100μL底物溶液，避光孵育30分钟。

(2)加入50μL终止液，终止反应。

（四）结果检测

1.酶标仪检测：450nm波长读板，记录OD值。

2.数据分析：计算样本浓度，对比阳性对照确定结果。

四、质量控制

（一）质控要求

1.每批次检测必须包含阴性对照和阳性对照。

2.标准曲线R²值应≥0.98。

（二）常见问题排查

1.结果偏高：检查样本是否存在干扰物（如高甘油三酯）。

2.结果偏低：确认抗体浓度及孵育时间是否准确。

五、安全注意事项

（一）个人防护

1.佩戴手套、护目镜，实验服覆盖皮肤。

2.操作后用75%酒精消毒台面。

（二）废弃物处理

1.化学废弃物按实验室规定分类处理。

2.废弃吸头和酶标板统一收集。

六、记录与保存

（一）记录要求

1.记录样本编号、检测日期、操作人。

2.保存原始数据及结果分析报告。

（二）试剂保存

1.酶标抗体及底物需避光保存于2-8℃。

2.使用后未开封试剂可冷藏保存1个月。

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**一、概述**

免疫学抗体检测是利用抗原抗体之间高度特异性的结合反应，通过体外实验方法检测生物样本（如血清、血浆、组织液等）中特定抗体的存在、浓度或活性。该技术广泛应用于医学诊断（如传染病筛查、自身免疫性疾病检测）、生物研究（如药物研发、疫苗效果评估）、食品安全（如过敏原检测）等领域。抗体检测方法多样，常见的包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、胶体金免疫层析法（试纸条）等。本规程以酶联免疫吸附试验（ELISA）为例，详细阐述抗体检测的操作流程。本规程旨在为实验室操作人员提供标准化的操作指导，确保检测过程的规范性和检测结果的准确性、可靠性，减少操作误差和潜在风险。

**二、仪器与试剂准备**

（一）仪器设备

1.酶标仪：具备450nm滤光片，推荐使用双波长酶标仪（如450/600nm）以提高精度，需定期校准。配备可移动的吸液针头，确保读数一致。

2.微量移液器：配置不同量程（如1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL），需经过校准，并使用对应规格的无菌吸头。操作人员应熟悉其使用方法，特别是预吸、吹打、触壁等关键步骤。

3.水浴锅：温度范围可调（建议0-60℃），具有温度均匀性监测功能，配备智能控温系统。

4.电动混匀器/涡旋混合器：用于混匀样本、试剂和洗涤液，确保充分均匀。涡旋混合器适用于小体积快速混匀，需注意避免过度涡旋导致气泡或样品变性。

5.冰箱：用于保存低温要求试剂（2-8℃）和样本，确保温度稳定。

6.超净工作台/生物安全柜：提供无菌操作环境，防止样品污染。使用前需进行空间灭菌（如紫外灯照射30分钟，或使用循环风杀菌模式），并检查风速和过滤器状态。

7.电子天平：用于精确称量试剂（如洗涤液、稀释液），精度至少为±0.1mg。

8.移液枪架：便于规范操作和存放移液器。

9.实验台：建议使用耐腐蚀、易清洁的材料。

（二）试剂与耗材

1.样本稀释液：通常为磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4±0.1），需新鲜配制或使用商业试剂盒提供的即用型稀释液。使用前需确认无沉淀或污染。

2.酶标抗体（检测抗体）：即用于捕获样本中目标抗原或直接与样本中目标抗原结合的酶标抗体。需检查试剂说明书，了解其工作浓度、储存条件（通常为2-8℃或-20℃）和有效期。使用前需在室温或37℃水浴中适当复温（根据说明书要求，通常15-30分钟），并充分混匀。

3.标准品/质控品：标准品用于建立标准曲线，质控品用于监控批间和批内变异。标准品应具有已知浓度且在有效期内的证书。质控品应覆盖临床诊断或研究的相关范围。需按说明书要求稀释或直接使用。

4.抗原包被液：用于包被固相载体的溶液，通常是含0.05%Tween-20的PBS或包被缓冲液（根据抗体性质选择）。需新鲜配制或按说明书使用。

5.底物溶液（TMB显色液）：辣根过氧化物酶（HRP）的显色剂，通常是含有TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）和H₂O₂的溶液。需新鲜配制或使用试剂盒配套试剂，避免光照。显色液对光敏感，配制和储存需避光。

6.终止液：用于终止酶促反应，通常是2MH₂SO₄或浓盐酸。需现配现用，具有强酸性，操作时需小心。

7.96孔酶标板：聚苯乙烯材质，需具有低吸附性，建议使用预包被板或经处理（如用包被液封闭）的板。使用前检查板孔是否清洁、透明，无破损。

8.无菌吸头：根据不同加样体积选择合适规格（如200μL、100μL、50μL、10μL等），需保证无菌，建议使用一次性无菌吸头。

9.封闭液（可选）：如脱脂奶粉、BSA（牛血清白蛋白）溶液，用于阻断非特异性结合位点，减少背景干扰。通常为含0.05%Tween-20的PBS或封闭缓冲液。

10.洗涤液：通常为含0.05%Tween-20的PBS或洗涤缓冲液。需使用纯化水配制，确保无离子污染物。使用前需混匀。

**三、操作步骤**

（一）样本处理与准备

1.样本接收与标识：接收样本时核对样本标签信息与委托单是否一致，记录样本编号、接收时间。确保样本量充足（至少满足检测所需体积及浪费）。对样本进行清晰标识，防止混淆。

2.样本储存：未检测样本根据要求储存于2-8℃或-20℃冰箱，避免反复冻融。需记录冻融次数。

3.样本处理：

(1)血清/血浆样本：室温静置30分钟～1小时，使标本充分凝血（对于血浆样本）。3000rpm离心10分钟，小心吸取上清，避免吸到管底沉淀或组织碎屑。若样本为高脂血症，可能需进行脂血清除或稀释处理。

(2)组织样本：新鲜组织或冻存组织块用无菌生理盐水冲洗。根据组织类型选择合适的匀浆方法（如组织捣碎器、超声波细胞粉碎机），匀浆时可加入蛋白酶K（根据说明书浓度）进行组织蛋白消化。10000rpm离心20分钟，取上清液。必要时可通过透析或超滤去除大分子物质或蛋白酶。

(3)其他样本（如尿液、脑脊液等）：按相应样本类型说明书处理，必要时进行离心或过滤。

4.样本稀释：根据试剂盒说明书要求，用样本稀释液将样本进行适当稀释。例如，若要求样本稀释50倍，则取100μL样本加入含有400μL稀释液的离心管中，充分混匀。混匀可用涡旋混合器快速混匀或颠倒混匀10次以上。稀释后的样本需在规定时间内完成检测，避免长时间放置导致抗体活性变化。

（二）ELISA板准备与包被（以双抗体夹心法为例）

1.试剂平衡：所有试剂（稀释液、包被液、抗体、酶标抗体、洗涤液、底物液、终止液）在使用前均需在室温或37℃水浴中平衡15-30分钟，使其温度与反应体系一致，减少因温差带来的误差。

2.包被板处理：

(1)取出酶标板，检查板孔是否有破损或污渍。如有问题，应更换新板。

(2)用移液器吸取适量包被液（含抗原），加入每个孔中，每孔约100-200μL。注意加样速度均匀，避免产生气泡。

(3)将酶标板置于湿盒（底部垫有湿润纱布或保鲜膜）中，封口膜封好，放入37℃水浴箱或恒温箱孵育1-4小时（具体时间根据说明书和抗原稳定性确定）。孵育过程中保持湿度，防止板底液体蒸发。

3.洗涤：孵育结束后，小心吸弃板内液体（可倾斜板子，用吸水纸吸去边缘液体，但不要吸干孔内液体）。用洗板机或手工洗涤：

(1)向每个孔加入洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）约250μL，浸泡1-2分钟。

(2)弹出或吸弃洗涤液。重复此洗涤步骤5次。

(3)洗涤后，可在酶标仪上用空白孔调零（调零背景），确保后续读数准确。或直接吸干/吹干残余洗涤液（建议使用洗板机的吸水功能，避免气泡）。

（三）样本/标准品加样与孵育

1.加样样本/标准品：在洗涤后的酶标板上，用微量移液器依次加入样本稀释液（或标准品稀释液）和样本/标准品。每个样本/标准品设复孔（至少2孔）。建议按以下顺序加样：阴性对照、空白对照（仅稀释液）、低浓度标准品、中浓度标准品、高浓度标准品、样本1、样本2……。每个孔加入体积必须准确（通常是100μL）。

2.孵育：将加样后的酶标板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒温箱孵育1-2小时（具体时间根据说明书和抗体性质确定）。孵育过程中避免震动，确保抗体与样本/标准品充分结合。

（四）洗涤（封闭后）

1.吸弃孵育液：同包被后的洗涤步骤，小心吸弃孔内液体。

2.洗涤：向每个孔加入洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）约250μL，浸泡1-2分钟。

3.弹出或吸弃洗涤液。重复此洗涤步骤5次。

4.吸干/吹干残余洗涤液。此步洗涤对后续结果影响很大，需彻底。

（五）加酶标抗体

1.复温与混匀：取出酶标抗体，在室温或37℃水浴中平衡15-30分钟。充分混匀酶标抗体，确保HRP标记的抗体分布均匀。

2.加样：用微量移液器依次向每个孔中加入酶标抗体。每个样本/标准品设复孔。每孔加入体积必须准确（通常是100μL）。

3.孵育：将加样后的酶标板封好封口膜，放入37℃水浴箱或恒温箱孵育1小时左右（具体时间根据说明书和抗体性质确定）。孵育过程中避免震动。

（六）洗涤（酶标抗体孵育后）

1.吸弃孵育液：小心吸弃孔内液体。

2.洗涤：向每个孔加入洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）约250μL，浸泡1-2分钟。

3.弹出或吸弃洗涤液。重复此洗涤步骤5次。

4.吸干/吹干残余洗涤液。此步洗涤对于去除未结合的酶标抗体至关重要，需非常彻底，以降低背景值。

（七）加底物溶液显色

1.复温与混匀：取出底物溶液（TMB显色液），在室温或37℃水浴中平衡5-10分钟。**注意：底物溶液通常对光敏感，此步骤应在避光条件下进行或使用避光酶标板。**充分混匀底物溶液。

2.加样：用微量移液器依次向每个孔中加入底物溶液。每孔加入体积必须准确（通常是100μL）。**加完底物后，应立即放入避光环境中孵育。**

3.孵育：将加样后的酶标板放入37℃避光水浴箱孵育15-30分钟（具体时间根据说明书和底物稳定性确定）。孵育过程中避免震动和光线直射。显色程度与抗体浓度成正比，但需注意避免过度孵育导致颜色褪色。

（八）加终止液终止反应

1.吸弃底物液：小心吸弃孔内显色液（注意不要吸干）。

2.加终止液：用微量移液器依次向每个孔中加入终止液。每孔加入体积必须准确（通常是50-100μL，需根据终止液浓度和酶标仪读数范围调整）。终止液为强酸，加入时会产生气体，需缓慢加入并确保混合均匀。

3.静置：加入终止液后，混匀酶标板（轻轻摇晃或拍打），使颜色充分反应。然后静置几分钟，待颜色稳定。

（九）结果检测

1.立即读板：终止反应后，**应立即**使用酶标仪在450nm波长处读取OD值。对于双波长检测，同时读取450nm和600nm（或参考波长）的OD值，计算吸光度差值（450-600nm）以排除背景干扰。

2.记录数据：准确记录每个孔的OD值。同时记录酶标板上的样本/标准品位置。

3.处理数据：将原始OD值导入数据分析软件（如Excel、专业ELISA数据分析软件），根据标准品的浓度和OD值绘制标准曲线（常用四参数Logistic曲线或线性回归），计算样本的浓度或相对含量。

**四、质量控制**

（一）质控要求

1.每个实验都必须包含：

(1)阴性对照：不含目标抗体的样本稀释液或生理盐水，用于检测非特异性结合和背景信号。

(2)阳性对照：含有已知浓度目标抗体的标准品或质控品，用于确认检测系统工作正常，并评估灵敏度。

(3)样本复孔：每个样本至少做两个平行孔，计算平均值，以减少随机误差。若两个孔结果差异过大（如超过平均值的20%或说明书规定范围），需重新检测该样本。

2.标准曲线建立：使用至少3个浓度梯度（通常跨越3个数量级）的标准品绘制标准曲线。标准曲线应具有良好的线性关系，R²值（相关系数）通常要求≥0.98或根据说明书要求。

3.质控品检测：使用批内质控（同批样本检测）和批间质控（不同批样本或不同实验日检测）质控品。质控品结果应在预定的范围内（如±15%或±20%的靶值范围，具体参考质控品说明书）。质控结果失控时，需查找原因并重新检测。

4.空白对照检查：空白对照的OD值应较低，通常在0.1-0.2之间（根据仪器和试剂灵敏度调整），若空白值过高，提示洗涤不彻底或试剂/样本污染。

（二）常见问题排查与解决

1.**背景过高（所有孔OD值均偏高）**：

*检查洗涤是否彻底，洗涤液是否正确使用（含Tween-20）。

*检查酶标板是否清洁，有无油污或划痕。

*检查试剂是否污染（如酶标抗体、底物开盖时间过长）。

*检查样本是否含有高浓度非特异性物质（如高甘油三酯、高脂血，可能需要预处理或稀释）。

*检查操作过程有无非特异性结合（如封闭不充分或过度）。

2.**背景过低（所有孔OD值均偏低）**：

*检查底物溶液是否新鲜，储存条件是否正确。

*检查酶标抗体是否失效或储存不当。

*检查孵育时间是否不足或温度不适宜。

*检查样本稀释是否过度或加样体积不准确。

3.**标准曲线线性差（R²<0.98）**：

*检查标准品是否在有效期内，储存是否正确。

*检查标准品是否被污染或溶解不均匀。

*检查包被抗原浓度是否合适。

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