hESC-Exos对SiO₂粉尘诱导Beas-2B细胞活性损伤的保护作用

目录TOC\o"1-3"\u中文摘要 1Abstract 引言二氧化硅（SiO2）粉尘是职业性肺病（例如矽肺、肺纤维化）的主要致病因素。它通过引发呼吸道细胞的氧化应激、炎症反应和代谢紊乱，导致肺组织的不可逆损伤。研究显示，SiO2粉尘能够穿透肺泡屏障，并被支气管上皮细胞（如Beas-2B）吞噬REF_Ref19090\r\h[1]。在细胞内，SiO2产生活性氧（ROS），攻击细胞膜和线粒体，导致DNA链断裂和凋亡信号的激活。这些病理过程不仅影响细胞的生存能力，还促进了肺部疾病的进展。近年来，随着干细胞研究的深入，人类胚胎干细胞外泌体（hESC-Exos）因其潜在的治疗作用而备受关注。例如，彗星试验表明，即使是低剂量的SiO2也能显著增加中国仓鼠肺成纤维细胞（CHLF）的DNA迁移距离，且损伤程度与暴露时间和剂量呈正相关REF_Ref19257\r\h[2]。在这一过程中，羟自由基和钙离子扮演了关键角色REF_Ref19371\r\h[3]。此外，SiO2还能激活MAPK信号通路REF_Ref28204\r\h[4]REF_Ref28296\r\h[5]（如ERK1/2和MEK1/2的磷酸化），促进炎症因子的释放和纤维化基因的表达，从而加剧细胞恶性转化的风险REF_Ref19560\r\h[6]。因此，深入探究SiO2粉尘的致病机制，寻找有效的抗纤维化与抗炎策略，对于预防和治疗由SiO2粉尘引起的职业性肺病具有重要意义。人胚胎干细胞外泌体（hESC-Exos）因其独特的生物学特性而成为研究的焦点。外泌体富含miRNA、蛋白质和生长因子，能够通过多靶点调控细胞功能REF_Ref19090\r\h[1]。例如，M2巨噬细胞外泌体能够通过抑制中性粒细胞NETs来减轻脓毒症损伤REF_Ref20132\r\h[7]，而hESC-Exos在抗衰老和肺纤维化修复方面显示出显著的潜力。研究表明，hESC-Exos中的miR-17-5p可以靶向纤维化相关基因（如Thbs2），抑制胶原沉积；同时，其所携带的抗氧化酶（如SOD）能有效清除ROS，恢复线粒体功能REF_Ref19560\r\h[6]。此外，单细胞测序技术揭示，hESC-Exos能够通过调控转录组和表观遗传网络来促进细胞再生REF_Ref20605\r\h[8]，这为在复杂微环境下肺损伤的修复提供了新的思路。PI3K/AKT/mTOR信号通路在调控细胞氧化炎症损伤发生自噬起着关键的调控作用REF_Ref20736\r\h[12]，mTOR信号蛋白是细胞自噬的主要调节因子，激活PI3K/AKT/mTOR通路可调节细胞自噬蛋白LC3、p62的表达，从而抑制细胞发生自噬，减轻细胞炎症、氧化损伤，防止了疾病的发生和发展。本研究拟研究hESC-Exos通过miRNA-199-3a调控对SiO2粉尘REF_Ref31992\r\h[10]REF_Ref32028\r\h[11]对Beas-2B细胞毒性的保护保用，进一步探讨调控作用机制。为外显体miRNAs在SiNPsREF_Ref31754\r\h[9]引发肺毒性中的作用提供了新的视角，并为确定减轻或治疗sinps诱导的肺损伤的新靶点提供了科学基础。对象与方法一、研究对象1.1细胞培养和处理Beas-2B细胞来源于中国科学院细胞库。DMEM培养基培养（康宁公司，USA)中培养，培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。37℃、5%CO2恒温培养箱。1.2SiO2粉尘处理SiO2悬液制备：将无内毒素的结晶型二氧化硅（粒径≤5μm）用PBS配制成100mg/mL的悬液，超声分散后高压灭菌。2.仪器和试剂2.1仪器倒置显微镜（苏州景通仪器有限公司，型号：VMB300CF）；细胞培养箱（上海新苗，型号：WJ-160A-Ⅲ）；CFX96TMReal-TimeSystem(美国BIO-RAD公司)；BiotekEpoch2酶标仪(美国)；酶标仪（德铁，型号：HBS-1096A）；PowerPacTMHC高电流电泳仪（美国BIO-RAD公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，型号：BCM-1000A）；化学发光成像系统（上海培清科技有限公司）；IKAT10高速分散器（德国）；LABGICL-OSKLED数显圆周摇床（合肥兰杰柯科技有限公司）；高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）；LC-FA1004电子分析天平（湖南力辰仪器科技有限公司）。2.2试剂miRNA-199-3a-antagomir（上海吉玛基因）；CCK-8（DojindoKumamotoCompany,日本)；总蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醇测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)；还原型谷胱甘肽试剂盒（南京建成生物工程研究所）；山羊抗免IgGHRP（ImmunoWayBiotechnologyCompany美国）；三色预染蛋白Marker(10-250kDa)（上海雅酶生物医药科技有限公司）；CD63多克隆抗体（ImmunoWayBiotechnologyCompany美国）；TSG101多克隆抗体（ImmunoWayBiotechnologyCompany美国）；RabbitPolyAb（ImmunoWayBiotechnologyCompany美国）。二、研究方法1.细胞培养和处理Beas-2B细胞来源于中国科学院细胞库。DMEM培养基培养（康宁公司，USA)中培养，培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。37℃、5%CO2恒温培养箱。2.SiO2粉尘处理SiO2悬液制备：将无内毒素的结晶型二氧化硅（粒径≤5μm）用PBS配制成1-10mg/mL的悬液，超声分散后高压灭菌。3.hESC-Exos提取与处理外泌体提取：从hESC培养上清中通过超速离心法（100,000×g）提取外泌体，并通过TEM（透射电镜）和Westernblot（CD63、TSG101、Alix）验证外泌体特性。4.targetscan和GEO数据库生信预测网站筛选采用Targetscan(/vert_80/)和GEO（/geo/）网站富集分析。筛选标准设定为p＜0.05且q＜0.05。5.剂量与分组SiO2处理组：加SiO2(12.5、25、50μg/mL），处理培养24h。hESC-Exos干预组：SiO2（25μg/mL）干预18小时，再加入hESC-Exos（4.5x108μmol/mL）培育6h。miRNA-199-3aantagomir干预组：SiO2（25μg/mL）干预18小时，在分别加入miRNA-199-3aantagomir和hESC-Exos（4.5x108μmol/mL）培育6h。采用CCK-8法检测细胞活力为了评估细胞活力，将对数生长期的Beas-2B细胞接种于96孔板(1×104个细胞/孔)中，分四组，分别暴露于浓度分别为0.00µg/mL、6.25µg/mL、12.50µg/mL、25.00µg/mL和50.00µg/mL的SiO2颗粒混悬液中24h。每组6个重复。孵育结束时，每孔中加入10µLCCK-8溶液，孵育2-4h。荧光免疫酶标仪490nm波长处读取吸光度至少3次。细胞活力表示为相对存活率，以sio2处理组的吸光度与空白对照组的吸光度之比进行数据分析。6.ELISA法测定动Beas-2B细胞中炎症因子、氧化损伤因子6.1样本前处理：称取所需重量的组织于2ml离心管中，按照重量（g）比体积(mL)=9；1的比例加入相应体积的生理盐水，使用匀浆机打碎制备匀浆，块状过大不易打碎者，可用剪刀先行剪碎确保完全匀浆。使用离心机2500~3000转，离心10分钟，取上清即10%匀浆上清液。将10%组织匀浆上清用生理盐水稀释成不同浓度进行预实验。6.2操作步骤从4℃冰箱中取出所需微孔板，放至室温。在测定空白孔和测定孔中，加入20ul待测匀浆上清。在对照孔空白和对照孔中，加入20ul蒸馏水。在对照孔和测定孔中加入20ul酶工作液。在测定空白孔和对照空白孔中加入20ul酶稀释液。在四个孔中加入200ul底物应用液。混匀，37℃孵育20分钟，450nm处酶标仪读数检测分析。7.Westernblot分析将大鼠肺组织和收集的细胞样本在RIPA缓冲液（Beyotime,中国）中裂解，从细胞中提取总蛋白，并使用BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime）检测蛋白浓度。蛋白质经SDS分离后，转移至PVDF膜，封闭1小时后于4℃下与一抗孵育16小时：Bax(1：1000，A1933，ab克隆，中国），Bc1-2（1：1000，A19544，ab克隆）GAPDH（1：5000，AC002，ab克隆）。随后，将膜洗涤，并在37℃下与二级抗兔IgG（1：5000，A0208，Beyotime）或抗大鼠IgG（1：5000，A0216，Beyotime）孵育1小时。ECL试剂盒(BL520A，Biosharp，中国）检测相对条带。三、统计学处理使用SPSS22.0软件，FijiimageJ软件和GraphPadPrism8软件对数据录入与统计分析，数据以平均值x±SEM表示，统计学显著性采用单因素方差分析计算。结果SiO2粉尘颗粒在高倍光镜下的形态SiO2粉尘颗粒在高倍光镜下多为不规则形状，有棱角，一般呈无色透明或略带灰色。粒径不一，从几微米到几十微米都有，较小的颗粒可能接近光镜的分辨率极限，观察起来相对模糊，较大的颗粒则可以清晰地看到其轮廓。具有较强的折光性，在视野中较为容易被识别。图1SiO2粉尘颗粒在高倍光镜下的形态hESC-Exos的特征及鉴定对提取的hESC-Exos进行了形态和标志物验证，结果证实了提取产物符合Exosomes的典型特征。透射电镜（图1,A）观察到提取样品中存在大量球形或囊泡形态的纳米级结构，其粒径范围介于30-150nm之间。通Westernblot免疫印迹法（图1,B）对hESC-Exos提取物进行了分子水平的特征鉴定。结果显示，提取物表达CD9和TSG101外泌体特异性标志蛋白。AB图2hESC-Exos的特征targetscan和GEO数据库生信预测网站筛选结果通过targetscan和GEO数据库生信分析。蛋白mTORmRNA在129-136片段与miRNA-199-3a碱基互补配对高度结合。5'

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AUUGGUUACACGUC-UGAUGACA图3mTOR和miRNA-199-3a的结合位点预测结果不同浓度SiO₂粉尘对Beas-2B的细胞毒性空白组细胞形态梭形，细胞边界清晰，贴壁生长。细胞之间连接紧密，排列整齐，形成单层细胞膜。低剂量组细胞间连接变松散，细胞边界模糊，有些细胞表面可能出现颗粒状物质，这可能是SiO2粉尘颗粒被细胞摄取所致。中剂量组细胞生长速度减缓，细胞密度明显低于正常对照组，培养皿底部的细胞分布不均匀，出现局部细胞堆积或稀疏的现象。高剂量组细胞形态发生显著改变，大部分细胞皱缩，细胞边缘不规整，出现大量细胞碎片，许多细胞脱离培养皿底部悬浮在培养液中，这表明细胞受到了严重的损伤。随着SiO₂粉尘浓度的增加，Beas-2B细胞生长受到明显的抑制，细胞增殖速度明显减缓，细胞存活率和活性程剂量依赖性降低。见图4-5。空白组（SiO212.5μg/m）低剂量组（SiO212.5μg/mL）中剂量组（SiO225μg/mL）高剂量组（SiO250μg/mL）图4各组Beas-2B细胞形态图5各组细胞相对于对照组细胞的活性注：每组数据6次独立实验，并以平均值±SEM表示。与对照组相比，***P<0.0001。hESC-Exos通过miRNA-199-3a调控对Beas-2B细胞毒性产生了保护作用根据检测结果分析可得，SiO₂模型组中SOD和MDA较空白组对照组显著的升高（P<0.05），GSH含量降低（P＜0.01），表明SiO2干预后，Beas-2B细胞内产生了大量的氧自由基，发生氧化应激，产生氧化损伤。hESC-Exos干预后Beas-2B细胞内SOD，MDA较模型组降低（P＜0.05），GSH含量明显升高（P＜0.01），表明hESC-Exos对sio2所致Beas-2B细胞氧化损伤具有改善作用；miRNA-199-3aantagomir干预组较hESC-Exos干预组Beas-2B细胞内SOD，MDA含量升高，GSH含量降低（P＜0.01），表明miRNA-199-3aantagomir干预后，hESC-Exos对Beas-2B氧化损伤改善作用减弱。因此我们可以推测hESC-Exos是通过miRNA-199-3a调控减轻了SiO2粉尘所致Beas-2B细胞氧化损伤和炎症反应，抑制了细胞的凋亡。见图6、7。ABCDEF图6Beas-2B细胞中氧化和炎症因子因子表达情况图7Beas-2B细胞中凋亡蛋白表达情况讨论近年来，针对SiO₂诱导的细胞损伤的保护策略主要集中在使用抗氧化剂（如EGCG）或钙拮抗剂上，但这些单一靶点干预的局限性十分明显。例如，尽管EGCGREF_Ref32391\r\h[15]能够通过抑制caspase-9的表达来减少H2O2诱导的BV2细胞凋亡REF_Ref32502\r\h[16]，但其对纤维化进程的调控作用有限。其他粉尘（如镍精炼烟尘）的研究表明，Beas-2B细胞的能量代谢异常（例如Warburg效应的增强）可能进一步促进癌变，这提示了多维度保护机制的重要性。本研究通过设置不同浓度的SiO2干预Beas-2B，结果表明，随着染尘剂量的增高。Beas-2B细胞生长速度和密度明显变低，培养皿底部的细胞分布不均匀，呈现局部细胞堆积或稀疏的现象，高剂量组细胞形态细胞受到了严重的损伤REF_Ref227\r\h[20]REF_Ref354\r\h[17]REF_Ref423\r\h[18]REF_Ref616\r\h[19]，细胞皱缩，出现大量细胞碎片，许多细胞脱离培养皿底部悬浮在培养液中（图4-5）。这表明表明随着SiO2粉尘浓度的增加，Beas-2B细胞存活率和活性程剂量依赖性降低。人胚胎干细胞外泌体（hESC-Exos）因其独特的生物学特性而成为研究的焦点。外泌体富含miRNA、蛋白质和生长因子，能够通过多靶点调控细胞功能。hESC-Exos在多种疾病模型中展现出潜在的治疗作用，包括促进组织修复、抑制炎症反应和调节免疫应答等。在SiO2粉尘暴露导致的肺损伤中，hESC-Exos可能通过其携带的miRNA和蛋白质等生物活性分子，参与调控Beas-2B细胞的能量代谢、抗氧化应激和凋亡等过程，从而减轻了SiO2粉尘对细胞的毒性作用。本研究通过梯度高度离心获得hESC-Exos，透射电镜观察到提取样品中存在大量球形或囊泡形态的纳米级结构，其粒径范围介于30-150nm之间（图1,A）。通过Westernblot免疫印迹法对hESC-Exos提取物进行了分子水平的特征鉴定。结果显示表达CD9和TSG101外泌体特异性标志蛋白（图1,B）。有研究表明了M2巨噬细胞外泌体能够通过抑制中性粒细胞NETs来减轻脓毒症损伤，而hESC-Exos在抗衰老和肺纤维化修复方面显示出显著的潜力。hESC-Exos中的miR-17-5p可以靶向纤维化相关基因（如Thbs2），抑制胶原沉积；同时，其所携带的抗氧化酶（如SOD）能有效清除ROS，恢复线粒体功能。本文提出假设hESC-Exos是否通过miRNAs调控干预了SiO₂粉尘诱导Beas-2B细胞细胞凋亡毒性。本研究通过targetscan和GEO数据库生信分析。调控细胞凋亡蛋白mTORmRNA在129-136片段与miRNA-199-3a碱基互补配对高度结合。通过建立空白对照组、SiO₂干预组、hESC-Exos干预组、miRNA-199-3aantagomir干预组，研究其可能的调控靶点。根据本研究检测结果分析可得，在SiO2干预后，Beas-2B细胞内产生了大量的氧自由基，发生氧化应激，产生氧化损伤。hESC-Exos干预后对sio2所致Beas-2B细胞氧化损伤具有改善作用；miRNA-199-3aantagomir干预后，hESC-Exos对Beas-2B氧化损伤改善作用减弱（图6）。因此我们可以推测hESC-Exos是通过miRNA-199-3a调控减轻了SiO2粉尘所致Beas-2B细胞氧化损伤和炎症反应，抑制了细胞的凋亡。我们的研究为外显体miRNAs在SiNPs引发肺毒性中的作用提供了新的视角，并为确定减轻或治疗sinps诱导的肺损伤的新靶点提供了科学基础。这一研究方向不仅符合当前精准医疗和个体化治疗的发展趋势，也为解决SiO2粉尘引起的职业性肺病提供了新的思路和策略。

结论本研究通过一系列实验探讨了hESC-Exos对二氧化硅（SiO₂）粉尘诱导BEAS-2B细胞活性损伤的保护作用，得出了以下结论：本研究结果表明，SiO2粉尘刺激的BEAS-2B细胞的细胞活力出现剂量依赖性下降，并发生细胞凋亡。hESC-Exos通过miRNA-199-3a调控减轻了SiO2粉尘引起BEAS-2B细胞的的氧化应激，并减弱炎症反应，减少了细胞凋亡。参考文献余杰,毛丽君,赵金垣.二氧化硅通过肺泡巨噬细胞的识别反应启动肺内炎性损伤的机制[J].中国工业医学杂志,2015,28(4):265-269.余晨,曾昭玉,吴巍巍.二氧化硅对成纤维细胞和肺上皮细胞的DNA损伤作用[J].中国职业医学,2002,29(3):29-31.曹建彪.自由基与矽肺的发展[C]//中华预防医学会劳动卫生与职业病分会.第十三次全国劳动卫生与职业病学术会议论文汇编.中国山东省泰安市,2014:210-210.马子怡,丁琼桦,杜文,等.烟酰胺单核苷酸改善二氧化硅诱导小鼠肺损伤的转录组学研究[J].现代预防医学,2025,52(08):1476-1483.丁琼桦,马子怡,钱蕊,等.基质金属蛋白酶14在矽肺中的表达及其对上皮间充质转化的调控作用[J].现代预防医学,2025,52(04):629-635.王G.，谢W.，邓L.

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