HPLC法同时测定苍术中三种代表性成分的含量

HPLC法同时测定苍术中三种代表性成分的含量前言苍术为菊科植物茅苍术（Atractylodeslancea（Thunb.）DC.）或北苍术（Atractylodeschinensis（DC.）Koidz.）的干燥根茎，药用历史悠久，历代本草均有其记载REF_Ref5167\r\h[1]。其采收时间为春、秋二季，采挖后除去泥沙，晒干并撞去须根，最终制成药用饮片。苍术性温，味辛、苦，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目等功效，在中医临床中常用于治疗湿阻中焦、脘腹胀满、风湿痹痛及夜盲症等症REF_Ref21115\r\h[2]。现代研究表明，苍术的活性成分按其性质可分为挥发性有效成分和非挥发性有效成分两大类。挥发性成分主要包括以β-桉叶醇（β-eudesmol）、茅术醇（hinesol）和苍术酮（atractylon)为代表的单萜及倍半萜类化合物REF_Ref5298\r\h[3]；而非挥发性成分则包括以苍术素（atractylodin）为代表的聚乙烯炔类、以苍术苷A（atractylosideA）为代表的苷类，以及以白术内酯（atractylenolide）为代表的内酯类成分REF_Ref21148\r\h[4]。这些成分共同构成了苍术的药理活性物质基础，其中苍术素、苍术酮、β-桉叶醇等成分的药理作用尤为突出REF_Ref5432\r\h[5REF_Ref5435\r\h,6]。1苍术主要活性成分的药理作用苍术素的药理作用苍术素（atractylodin）是苍术中重要的聚乙烯炔类成分，具有抗炎、抗溃疡、调节胃肠功能及抗肿瘤等作用REF_Ref21168\r\h[7REF_Ref5484\r\h,8,REF_Ref23586\r\h9]。研究表明，苍术素可通过抑制胃酸分泌、增强胃黏膜屏障功能来发挥抗溃疡作用，同时还能调节肠道菌群平衡，改善胃肠动力障碍。此外，苍术素在体外实验中表现出对多种肿瘤细胞的抑制作用，其机制可能与ROS/Nrf2/HO-1通路有关REF_Ref26009\r\h[10]。苍术酮的药理作用苍术酮（atractylon）是一种倍半萜类化合物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎镇痛等活性REF_Ref21243\r\h[11,REF_Ref21262\r\h12,REF_Ref26074\r\h13]。在抗病毒方面，苍术酮对流感病毒、疱疹病毒等具有一定的抑制作用；在抗炎方面，其机制可能与调节Nrf2-NLRP3通路有关,从而达到缓解炎症反应的效果。β-桉叶醇的药理作用β-桉叶醇（β-eudesmol）是苍术挥发油中的主要成分之一，具有抗炎、镇静等作用REF_Ref26133\r\h[14,REF_Ref5634\r\h15]。实验研究表明，β-桉叶醇可通过调节中枢神经系统发挥镇静效果，同时还能抑制炎症介质的释放，减轻组织炎症反应。2苍术质量控制的研究现状近年来，随着中药现代化研究的深入，中药质量控制标准不断提高。苍术作为常用中药材，其质量评价主要依赖于对其活性成分的含量测定。目前，苍术成分的分析方法主要包括：高效液相色谱（HPLC）用于测定苍术素等非挥发性成分REF_Ref21524\r\h[16]；气相色谱（GC）用于挥发油成分（如β-桉叶醇、苍术酮）的分析；气相色谱-质谱联用（GC-MS）用于对复杂成分的定性与定量分析REF_Ref5723\r\h[17,REF_Ref5729\r\h18]。现有研究多集中于使用单一检测器或多种检测器联用对单一成分的测定REF_Ref5794\r\h[19REF_Ref5798\r\h,20,REF_Ref5804\r\h21]，对多成分协同作用的系统性分析较为缺乏REF_Ref21569\r\h[22]。由于苍术的药理作用往往是多种成分共同作用的结果，，仅测定单一成分难以全面反映苍术药材的整体质量，而不同成分的极性差异可能导致分离困难，需通过梯度洗脱和调整流动相比例调整实现基线分离REF_Ref5883\r\h[23]。因此，建立一种能够同时测定苍术中多种关键活性成分的分析方法，对于苍术的质量控制、标准化生产及临床应用具有重要意义。3研究的目的与意义基于上述背景，本研究将围绕色谱柱条件、提取方法、流动相梯度和检测波长等方面实施优化，建立一种高效、灵敏的高效液相色谱检测方法，实现苍术中苍术素、β-桉叶醇和苍术酮的同步检测。该方法的建立将有助于更准确地评估苍术药材的质量，为苍术的提取、炮制及制剂生产提供科学依据，以及有助于确保苍术及其制剂的有效性与安全性，推动其合理用药。因此本研究将对苍术的提取方法和色谱条件（如色谱柱类型、流动相比例、检测波长）进行系统优化，确保三种成分的基线分离，然后进行包括精密度、线性关系，稳定性、重复性以及加样回收的方法学验证，最后将该方法应用于34批次苍术样品的测定，以验证其实际应用价值。4仪器、试剂及样品信息4.1仪器仪器型号生产厂家高效液相色谱仪2695Waters高效液相色谱仪1260安捷伦万分之一电子分析天平BP221S赛多利斯公司十万分之一电子分析天平AX-205梅特勒公司超声波清洗器KQ-500DB昆山市超声仪器有限公司4.2试剂耗材及对照品色谱柱：资生堂MGⅡC18（5μm，4.6×250mm）、AgilentEclipseXDBC18（5μm，4.6×250）表实验所用主要试剂试剂规格纯度批号公司苍术素99.7%111924-202207中国食品药品检定研究院β-桉叶醇98.5%CAS号473-15-4R,22062106RMstandards苍术酮98.7%CAS号6989-21-5,R2404-1241RMstandards甲醇分析纯重庆川东化工有限公司乙腈色谱纯重庆川东化工有限公司磷酸分析纯重庆川东化工有限公司水纯化水4.3样品信息本次收集到的苍术样品34批，其中药材33批，来自内蒙古、黑龙江、辽宁、河北、湖北、陕西等地（具体表1所示）。下面将以20号苍术样本展开方法学研究试验。表134批苍术药材样品来源序号采挖地点采挖时间备注1辽宁新宾红庙子20232021播种2内蒙古扎兰屯2023.10.102020.05播种3吉林柳河凉水河子镇2024.102021.02.12播种4黑龙江齐齐哈尔市碾子山区2024.102020.05.10播种5内蒙古呼伦贝尔市扎兰屯市城南2024.10.012020.05.15播种6河北省承德市丰宁县2024春季野生7内蒙古赤峰市红山区2024春季野生8黑龙江哈尔滨道里区渔场村2024.102020.05.18播种9黑龙江齐齐哈尔市富拉尔基区长青乡2024.102022.05.01播种10内蒙古赤峰市2024.102021.04.06栽种两年苗11内蒙古呼伦贝尔市扎兰屯市小东沟2024.102019.05.10播种12陕西省铜川市宜君县2023秋季北苍术（野生）13河北省承德市平泉市2024春季家种14河北省承德市隆化县2024春季家种15湖北省利川市团堡镇2023秋季北苍术（野生）16湖北省利川市团堡镇2023秋季北苍术（家种）17陕西省商洛市镇安县2023秋季北苍术（家种）18河北省承德市隆化县2024.10北苍术（家种）19辽宁丹东市凤城市2023.09北苍术（家种）20河北省青龙县2023.1021内蒙古扎兰屯市成吉思汗镇2023.1022内蒙古扎赉特旗2024.0923河北省承德市2024.1024河北省承德市2024.1125内蒙古扎兰屯市2024.1126河北省凌源市2024.1027河北省凌源市2024.1028内蒙古扎兰屯市2024.1029内蒙古赤峰市2024.09三年生30辽宁省铁岭市西丰县三年生野生货31辽宁省铁岭市西丰县2024.09三年生32辽宁省铁岭市西丰县2023.09三年生33辽宁省凤城市2023.10三年生34内蒙古扎兰屯市成吉思汗镇2024.10饮片5实验方法5.1提取方法的选择5.1.1提取溶剂的选择考虑到三种成分之间的极性差异，选择使用50%甲醇和甲醇两种溶剂分别提取并进行含量检测，查阅相关资料后发现选择50%甲醇为溶剂时，检测出三种成分的色谱峰较小，最终选择甲醇为提取溶剂。5.1.2提取方式的选择由于苍术素热不稳定，因此最终选择超声为提取方式。5.1.3提取样品和溶剂的量的选择精密称定2份均0.5g的样品，分别加甲醇25mL和50mL，超声振荡45min，实验数据（结果见表2）显示两份样品的含量测定结果接近。结合生态环保和节约溶剂的需求，实验最终选择取样品0.5g，加甲醇25mL超声提取。。表2不同溶剂量所测三种成分含量提取溶剂（mL）取样量（g）含量（%）苍术素β-桉叶醇苍术酮250.51050.2620.3170.174500.51000.2620.3160.1745.1.4超声时间的选择以甲醇为溶剂，取20号样本三份并加甲醇25mL，按表中三种超声时间分别检测三种成分的含量，超声结果所示30min所测含量虽然比40min略小，但考虑到所测成分热稳定性较差且超声过程放热，最终选择超声30min。表不同超声时间所得三种成分含量超声时间（min）取样量（g）含量（%）苍术素Β-桉叶醇苍术酮150.50230.2490.3010.169300.50500.2610.3170.174450.50410.2620.3200.1785.2测定波长选择及峰纯度考察为使多组分高效分离且峰形理想，色谱条件设定为乙腈和0.1%磷酸溶液混合流动相，进行梯度洗脱。由于所测三者成分极性差异较大，借助DAD检测器在200～400nm区间进行波长扫描，查阅相关资料和文献后，在203nm、220nm和270nm三种不同检测波长进行检测。针对该三种波长对于三种成分的吸收强弱，为兼顾三者在同一条件测定，最终选择203nm为分析波长。试验样品检测后，三个峰的纯度阈值均大于999。5.3色谱条件的确定（避光操作）色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，按表中的规定进行梯度洗脱；流速设定为1.0ml/min；检测波长设为203nm。就β-桉叶醇峰计算而言，理论塔板数应不低于2500。表3梯度洗脱程序时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0～5040～9560～550～5295～405～6052～554060对照品溶液的制备分别取β-桉叶醇、苍术素、苍术酮对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL各含30μg、30μg、50μg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μL、供试品溶液5～10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。对照品及样品色谱图见图1、图2。图1混合对照品 图2样品5.4方法学考察5.4.1精密度试验精密吸取上述混合对照品溶液10µL，连续进样六次，记录各个峰的面积，计算得出β-桉叶醇、苍术素、苍术酮三种成分各自峰面积的RSD分别为1.8%、1.8%、1.5%，结果表明仪器的精密度良好。（结果见表4）表4精密度试验结果成分1次2次3次4次5次6次RSD(%)β-桉叶醇4312324312324312324312324312324312321.8苍术素2090414209041420904142090414209041420904141.8苍术酮9679249679249679249679249679249679241.55.4.2线性关系考察配制混合对照品溶液至相应浓度（β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的浓度分别为0.03194552μg/μL，0.04498464μg/μL，0.07311696μg/μL），分别吸取1μL、5μL、10μL、15μL、20μL注入液相色谱仪并依据峰面积与进样量，绘制标准曲线。根据下面图标所示β-桉叶醇、苍术素、苍术酮进样量分别在0.031946～0.63891μg、0.044985～0.899693μg、0.073117～1.462339μg的数字区间内线性关系良好（r2均大于0.998）。表5线性关系考察结果成分进样量（μg）峰面积成分进样量（μg）峰面积成分进样量（μg）峰面积β-桉叶醇0.03194643481苍术素0.044985321184苍术酮0.0731171340240.1597282430250.22492316614200.3655857318820.3194554879180.44984633385100.7311714833060.4791837283370.6747749795151.09675422124560.638919663210.89969366062051.4623392911478图3β-桉叶醇线性图图4苍术素线性图图5苍术酮线性图5.4.3重复性试验取20号苍术样品的粉末（过三号筛）6份，按上述色谱条件进行重复性实验，检测得出β-桉叶醇、苍术素、苍术酮的平均含量分别为0.32%、0.27%、0.18%，相对标准偏差依次为1.8%、1.8%、1.9%。结果呈现出方法重复性良好。（见表6）表6重复性试验结果成分序号取样量（g）含量（%）平均含量（%）RSD（%）β-桉叶醇10.51050.3170.321.820.51290.31930.52000.32640.51400.32050.51010.31560.52710.330苍术素10.51050.2590.271.820.51290.27230.52000.27040.51400.26450.51010.26660.52710.271苍术酮10.51050.1740.181.920.51290.17630.52000.17940.51400.17850.51010.17260.52710.1815.4.4稳定性试验取20号苍术样品的供试品溶液,对其进行在16小时内的阶段性进样，并计算得出16h内供试品溶液中β-桉叶醇、苍术素、苍术酮峰面积的RSD分别1.8%、1.3%、1.5%，表明供试品溶液在16h内的稳定性符合要求（见表7）。表7稳定性试验结果成分0h2h5h8h12h16hRSD(%)β-桉叶醇8623708623708623708623708623708623701.8苍术素3458590345859034585903458590345859034585901.3苍术酮6218986218986218986218986218986218981.55.4.5加样回收率试验精密称取0.25g过三号筛20号苍术样品的粉末六份，置6个锥形瓶中，精密加入三种对照品溶液各5ml（β-桉叶醇0.1407mg/mL、苍术酮0.0771mg/mL、苍术素对照品溶液（0.1125mg/mL），再精密加入甲醇10mL，按照供试品溶液制备流程制备成相应溶液注入液相色谱仪中，依法测定其含量,并按加样回收率=（测得量-样品含量）/加入量计算得出三种成分各自的加样回收率，试验结果分别见表8。β-桉叶醇、苍术素、苍术酮的回收率均值分别为105.2%、105.0%、106.1%且其相对标准偏差分别为1.9%、1.2%、1.6%。检测结果说明回收率合格。表8准确度（回收率）试验结果成分取样量（g）样品含量（mg）加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）β-桉叶醇0.25340.81880.70331.5466103.5105.21.90.25620.82790.70331.5513102.90.25310.81780.70331.5509104.20.25250.81590.70331.5614106.00.25520.82460.70331.5799107.40.25110.81140.70331.5667107.4苍术素0.25340.67610.56231.2611104.0105.11.20.25620.68360.56231.2731104.80.25310.67530.56231.2616104.30.25250.67370.56231.2685105.80.25520.68090.56231.2843107.30.25110.67000.56231.2564104.3苍术酮0.25340.44700.38530.8476104.0106.11.60.25620.45190.38530.8651107.20.25310.44650.38530.8601107.30.25250.44540.38530.8562106.60.25520.45020.38530.8506103.90.25110.44290.38530.8576107.65.4.6耐用性试验取20号苍术样品的粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，按上述供试品溶液制备方法制成相应溶液，依法测定，分别使用不同类型的高效液相色谱仪和色谱柱测定，结果表明：该方法耐用性良好（结果见表9）。表9方法耐用性结果比较色谱条件β-桉叶醇苍术素苍术酮色谱仪：Agilent1260色谱柱：AgilentEclipseXDBC180.32%0.29%0.19%色谱仪：Waters2695色谱柱：资生堂GⅡC180.32%0.27%0.18%5.4.7样品含量测定采用上述方法，对收集到的确定来源的33批苍术药材和1批苍术饮片（3批茅苍术、31批北苍术）进行含量测定。（具体见表10）

表10样品含量测定序号来源β-桉叶醇苍术素苍术酮苍术酮/苍术素1北苍术0.340.380.370.982北苍术0.360.420.150.353北苍术0.300.510.521.034北苍术0.850.480.110.235北苍术0.290.790.160.216北苍术0.620.550.280.507北苍术0.090.450.340.768北苍术3.100.130.251.889北苍术0.840.500.130.2610北苍术0.420.530.541.0311北苍术0.500.740.240.3212北苍术3.620.340.010.0313北苍术0.500.290.070.2514北苍术0.160.350.320.9215北苍术5.180.270.040.1516北苍术4.450.110.010.1417北苍术6.440.070.010.1018北苍术0.220.610.320.5219北苍术0.010.380.010.0220北苍术0.340.280.180.6621北苍术0.150.370.010.0222北苍术1.950.190.432.2923北苍术0.250.590.070.1224北苍术0.030.500.400.7925北苍术0.090.320.361.1126北苍术0.100.440.491.1327北苍术0.100.470.741.5728北苍术0.190.290.230.7929北苍术0.100.250.250.9930北苍术0.010.011.83153.3731北苍术0.550.320.280.8732北苍术0.010.010.8688.9633北苍术0.040.460.010.0234北苍术0.280.500.460.91结果显示，33批北苍术药材和1批苍术药材饮片中，23批的苍术素含量达到0.3%以上，符合《中国药典》入药标准。以下为具体结果分析：（1）产地与化学成分的关联性由表10可看出β-桉叶醇的含量较高值集中于湖北利川（4.45%～5.18%）、陕西镇安（6.44%）和黑龙江（0.84%～3.1%），这可能与该地区昼夜温差大、土壤富硒等矿物质有关。研究显示REF_Ref1546\r\h[24]，β-桉叶醇的合成受光照和矿物质影响显著。内蒙古、河北承德、青龙县等北方地区的苍术素含量较高（大多超过0.3%），符合《中国药典》标准（苍术素含量不少于0.3%），能部分反应出该地区苍术的质量较好，部分苍术素含量低于0.1%的样品，则提示我们注意该批次样品可能存在掺伪。（2）采收时间对活性成分的影响秋季采收样本（如序号12，15-17）β-桉叶醇（4.45%～6.44%）显著高于春季采收样本（如序号14，0.16%）。可能是因为秋季根茎营养回流促进次生代谢物积累REF_Ref1825\r\h[25]。（3）野生种与家种的代谢差异野生样本与家种样本的β-桉叶醇含量差异显著，可能是当地在进行播种种植过程中针对苍术药材的生长过程，适应性施肥促进了苍术活性物质的积累，而野生环境的不确定性胁迫抑制代谢产物合成REF_Ref1546\r\h[24]。而对于各样本中苍术酮的含量差异则可能是家种通过选育优化苍术酮含量以符合药用需求。家种样本中的β-桉叶醇含量波动范围较大，如黑龙江样本（序号8）达3.1%，而辽宁凤城（序号33）仅0.04%，可能与播种时间、管理措施（如灌溉、病虫害防治）差异有关REF_Ref652\r\h[26，REF_Ref19819\r\h27]。（4）伪品掺伪风险与鉴别辽宁西丰县样本（序号30、32）的苍术酮/苍术素比值（153.37、88.96）数据异常。推测可能是掺入关苍术所致（苍术酮含量高REF_Ref29966\r\h[28]），后续会继续研究。陕西镇安县样本与湖北利川的β-桉叶醇含量（序号17，6.44%；序号15，5.18%）远超其他样本（0.01%～3.62%），后续需排查是否混入茅苍术（β-桉叶醇含量较高REF_Ref29257\r\h[29]）。6讨论6.1方法选择与优化HPLC法因其高灵敏度、良好的重现性和高效分离能力，特别适用于中药多成分分析，故而采用HPLC法同时测定苍术中苍术素（atractylodin）、β-桉叶醇（β-eudesmol）和苍术酮（atractylone）的含量。通过优化色谱条件（如流动相比例、柱温