肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗：构建、表达及免疫学特性深度剖析

肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗：构建、表达及免疫学特性深度剖析一、引言1.1肠炎沙门氏菌的危害及研究背景肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis）作为一种常见且危害广泛的革兰氏阴性杆菌，在人畜健康领域投下了浓重的阴影。它不仅是食源性疾病的主要病原菌之一，还凭借其“人畜共患病原体”的特性，在人类与动物之间肆意传播，引发了一系列不容忽视的健康问题。在人类世界中，肠炎沙门氏菌的感染途径多样，主要通过摄入被污染的食物或水而侵入人体。一旦成功入侵，它便会迅速在人体内兴风作浪，引发多种严重疾病。其中，最为常见的当属急性胃肠炎。患者往往会突然出现发热、腹痛、腹泻、恶心、呕吐等一系列症状，这些症状不仅给患者带来了身体上的极大痛苦，还可能导致脱水、电解质紊乱等严重并发症，对患者的生命健康构成直接威胁。在一些免疫力低下的人群中，肠炎沙门氏菌还可能进一步侵入血液，引发败血症，甚至引发脑膜炎、骨髓炎等更为严重的全身性感染疾病，这些疾病的致死率和致残率都相对较高，给患者及其家庭带来了沉重的负担。肠炎沙门氏菌在动物养殖领域同样造成了巨大的损失。在家禽养殖中，它可导致鸡、鸭、鹅等家禽出现腹泻、消瘦、产蛋量下降等问题，严重影响家禽的生长发育和生产性能。在养猪业中，感染肠炎沙门氏菌的猪可能会出现腹泻、生长迟缓、饲料利用率降低等情况，增加养殖成本，降低养殖效益。而且，动物感染肠炎沙门氏菌后，还可能成为潜在的传染源，将病菌传播给其他动物和人类，进一步加剧疫情的扩散。传统的防治方法，如药物治疗，虽然在一定程度上能够缓解症状，但也带来了诸多问题。抗生素的滥用导致细菌耐药性不断增强，使得治疗效果越来越差，同时还可能破坏动物肠道内的微生物平衡，引发其他健康问题。而卫生管理措施虽然能够在一定程度上减少病菌的传播，但无法从根本上杜绝感染的发生。因此，开发一种安全、有效的疫苗成为了防治肠炎沙门氏菌的关键。疫苗能够通过激发机体的免疫系统，使其产生特异性的免疫应答，从而达到预防和控制感染的目的。与传统防治方法相比，疫苗具有预防效果好、副作用小、可持续性强等优点，是未来防治肠炎沙门氏菌的重要发展方向。1.2DNA疫苗的优势与发展现状DNA疫苗，作为疫苗发展历程中的重要创新，又被称为“裸”DNA疫苗、基因疫苗、核酸疫苗或多核苷酸疫苗，被视为继灭活疫苗、弱毒疫苗以及亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”。其原理是将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注入动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。与传统疫苗相比，DNA疫苗展现出诸多显著优势。从生产角度来看，DNA疫苗的生产成本较低且适于批量生产。其接种载体，如质粒，结构相对简单，提纯质粒DNA的工艺也较为简便。这与传统蛋白质抗原需要复杂的纯化方法不同，不同的DNA构件具有稳定的物理和化学性质，可以通过单一程序进行纯化，大大降低了生产的难度和成本，为大规模生产提供了便利。在储存和运输方面，DNA疫苗具有良好的稳定性。它可以干粉的形式保存数年，且仍然保持活性，在使用时，只需在盐溶液中即可恢复原有活性。这种特性使得DNA疫苗在储存和运输过程中无需特殊的条件，即使在偏远地区或基础设施薄弱的地方，也能够方便地进行储存和分发，有效解决了传统疫苗在储存和运输上的难题。安全性上，DNA疫苗也具有突出的表现。它不像活减毒疫苗那样存在潜在的毒性转化风险，也不会出现灭活细胞疫苗常见的副作用。由于DNA疫苗编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，避免了减毒疫苗毒力回升的危险。而且，机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比较稳定，也不存在像弱毒疫苗或亚单位疫苗那样表位丢失的问题。DNA疫苗还具备高度的灵活性。其结构可以通过分子技术轻松操作，能够根据需要特异性表达感兴趣的抗原，或者将编码多种抗原的基因整合到质粒中，从而提供针对多种疾病的免疫保护。比如，可将嵌合细胞因子基因引入抗原质粒中作为佐剂，实现共表达并增强免疫反应。DNA疫苗还能诱导广泛的免疫反应，不仅包括体液免疫，涉及抗体的产生，还涵盖细胞免疫，涉及T细胞的参与。对于一些需要强效细胞免疫反应的疾病，如抗肿瘤免疫，以及对抗病毒感染，诱导细胞免疫至关重要，而DNA疫苗在这方面表现出了独特的优势。DNA疫苗的研究始于1983年，当时EnzoPaoletti和DennisPanicali设计策略，利用遗传工程改造普通天花疫苗，尝试使之用于预防其他疾病。1993年，JeffreyUlmer及其同事展示了直接向小鼠注射包含流感抗原的质粒DNA，小鼠随后对该病毒感染表现出保护性免疫反应，这一成果为DNA疫苗的发展奠定了重要基础。此后，DNA疫苗的研究不断推进。2016年，针对寨卡病毒的DNA疫苗开始在人类身上进行测试；2021年8月，印度当局批准了ZyCoV-D，这是由CadilaHealthcare开发的第一款COVID-19DNA疫苗，标志着DNA疫苗在人类疾病预防领域迈出了重要一步。在全球人类DNA疫苗市场中，市场规模呈现出增长的态势。据相关报告显示，2023年全球人类DNA疫苗市场规模达到245.34亿元，预计到2029年将达到612.67亿元，在预测期间年复合增长率预估为16.48%。流感、人类乳头状瘤病毒、艾滋病毒等领域是人类DNA疫苗的主要应用方向，众多企业也在积极布局这一领域，如GeneOneLifeScience、Hoffmann-LaRoche、Sanofi、InovioPharmaceuticals等。尽管DNA疫苗展现出巨大的潜力和良好的发展前景，但在实际应用中仍面临一些挑战，如如何进一步提高其免疫原性，以及解决潜在的DNA整合宿主基因组的风险等问题，这些都需要科研人员在未来的研究中不断探索和解决。1.3研究目的和意义本研究旨在构建肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗，实现其在真核细胞中的高效表达，并深入探究其免疫学特性，为肠炎沙门氏菌的防控提供一种安全、有效的新型疫苗策略。肠炎沙门氏菌对人畜健康的威胁日益严重，传统防治手段存在诸多局限性。开发新型疫苗迫在眉睫，DNA疫苗作为第三代疫苗，具有独特优势，本研究构建的肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗，有望弥补传统疫苗的不足，为肠炎沙门氏菌的防控提供新的有力工具。在学术研究方面，通过对肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的构建、表达与免疫学研究，能够深入了解DNA疫苗的作用机制，为DNA疫苗的设计和优化提供理论依据。这有助于丰富疫苗学的理论体系，推动疫苗研发技术的发展，为其他病原体DNA疫苗的研究提供参考和借鉴。在实际应用层面，成功开发的肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗，将为养殖业提供有效的疾病防控手段。它能够降低动物感染肠炎沙门氏菌的风险，减少经济损失，保障畜牧业的健康发展。在公共卫生领域，也能减少肠炎沙门氏菌在人群中的传播，降低食源性疾病的发生率，提高人们的生活质量。此外，本研究还可能为DNA疫苗的产业化发展奠定基础，促进相关生物技术产业的进步，具有显著的社会和经济效益。二、肠炎沙门氏菌及亚单位抗原概述2.1肠炎沙门氏菌的生物学特性肠炎沙门氏菌隶属肠杆菌科沙门氏菌属，是一种无芽孢、无荚膜的革兰氏阴性杆菌，其大小通常在(0.7-1.5)μm×(2.0-5.0)μm之间，呈直杆状，两端钝圆，周身分布着鞭毛，这赋予了它运动的能力。在电子显微镜下观察，可清晰看到其细胞结构由细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核等部分组成。细胞壁主要由肽聚糖构成，外膜则含有脂多糖，脂多糖不仅在维持细菌结构稳定方面发挥着关键作用，还与细菌的致病性紧密相关。肠炎沙门氏菌属于兼性厌氧菌，对营养的需求并不苛刻，在普通琼脂培养基上便能良好生长。在适宜的培养条件下，如37℃的环境中，经过18-24小时的培养，会形成中等大小、圆形、边缘整齐、表面光滑湿润且半透明的菌落。在麦康凯琼脂平板上，35℃培养18-24小时后，会形成无色、透明的菌落；而在SS琼脂平板上，同样条件下，多数菌落呈现无色、透明状，但大部分菌落的中央会因产生硫化氢（H₂S）而变黑，这是肠炎沙门氏菌的一个重要鉴别特征。在液体培养基中，它会呈现均匀混浊的生长状态。在生化反应方面，肠炎沙门氏菌有着独特的表现。它氧化酶试验呈阴性，能够发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露醇，以此获取能量，但不发酵乳糖和蔗糖。在三糖铁（TSI）培养基上，会出现斜面产碱（呈红色）、底层产酸（呈黄色）的现象，多数菌株还会产气并产生硫化氢，使培养基变黑。其动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验均为阳性，鸟氨酸脱羧酶和脲酶试验阴性，在氰化钾培养基中无法生长，吲哚（I）、甲基红（M）、VP试验（V）和枸橼酸盐利用试验（C）的结果通常为-+--或-+-+，即吲哚阴性、甲基红阳性、VP试验阴性、枸橼酸盐利用阴性。这些生化反应特征是鉴定肠炎沙门氏菌的重要依据，通过对这些反应结果的综合分析，能够准确地将其与其他细菌区分开来。2.2亚单位抗原的筛选与确定肠炎沙门氏菌的亚单位抗原种类繁多，不同的亚单位抗原在细菌的致病机制、免疫原性等方面发挥着不同的作用。常见的肠炎沙门氏菌亚单位抗原包括鞭毛抗原（FliC）、外膜蛋白（如OmpC、OmpF等）、毒力岛相关蛋白（如SPI-1、SPI-2编码的蛋白）等。鞭毛抗原FliC是肠炎沙门氏菌的重要表面结构蛋白，不仅与细菌的运动能力密切相关，还在细菌与宿主细胞的相互作用中扮演着关键角色。其具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生特异性的免疫应答。研究表明，FliC抗原上的某些特定表位，如g.m.位点（也称为SEp9），在鸡感染肠炎沙门氏菌后的连续免疫反应和抗原递呈过程中发挥着重要作用，可诱导机体产生高水平的抗体，为机体提供有效的免疫保护。外膜蛋白OmpC和OmpF是构成肠炎沙门氏菌外膜的主要蛋白成分。它们在维持细菌外膜的完整性、通透性以及与宿主细胞的相互作用等方面发挥着不可或缺的作用。OmpC和OmpF具有多个抗原表位，能够引发机体的免疫反应。其中，OmpC的一些表位可以诱导机体产生具有杀菌活性的抗体，而OmpF的某些表位则能够激活机体的细胞免疫应答，增强机体对肠炎沙门氏菌的免疫防御能力。毒力岛相关蛋白是由肠炎沙门氏菌致病岛SPI-1和SPI-2编码的蛋白。这些蛋白在细菌的毒力表达、侵袭宿主细胞以及逃避宿主免疫监视等过程中起着关键作用。例如，SPI-1编码的一些蛋白能够促进细菌对宿主肠上皮细胞的侵袭，使细菌能够迅速进入宿主细胞内，从而引发感染。而SPI-2编码的蛋白则有助于细菌在宿主细胞内的存活和繁殖，进一步增强细菌的致病性。这些毒力岛相关蛋白由于参与了细菌的关键致病过程，因此也具有较高的免疫原性，能够刺激机体产生特异性的免疫反应，对它们的研究有助于深入了解肠炎沙门氏菌的致病机制和免疫防御机制。在本研究中，筛选目标亚单位抗原主要依据其免疫原性、在细菌致病过程中的关键作用以及与宿主免疫系统的相互作用。通过查阅大量的文献资料，对各种亚单位抗原的特性进行综合分析和比较。研究发现，OmpC蛋白在多个研究中均表现出良好的免疫原性，能够诱导机体产生较强的免疫应答，包括体液免疫和细胞免疫。而且，OmpC蛋白在肠炎沙门氏菌与宿主细胞的相互作用中起着重要作用，其表达水平的变化会影响细菌的致病性和感染能力。因此，基于这些特性，本研究最终确定将OmpC蛋白作为构建肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的目标亚单位抗原。在后续的实验中，将针对OmpC蛋白进行深入研究，包括基因克隆、表达载体构建、蛋白表达与纯化以及免疫学特性分析等，以验证其作为DNA疫苗抗原的有效性和可行性。三、肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的构建3.1目标基因的获取本研究选择肠炎沙门氏菌的OmpC蛋白作为亚单位抗原，进而开展目标基因的获取工作。获取目标基因主要有两种常见的途径，分别是从NCBI数据库获取基因序列，以及用PCR技术从肠炎沙门氏菌菌株扩增目标基因，本研究采用PCR技术从肠炎沙门氏菌J15菌株中扩增出目标基因。在使用PCR技术扩增目标基因之前，需要精心设计引物。引物设计是PCR实验成功的关键环节之一，其设计的合理性直接影响到扩增的特异性和效率。本研究运用专业的引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物设计。在设计过程中，充分考虑了多个重要因素。引物的长度是需要重点考量的因素之一，合适的引物长度一般在18-30个碱基之间，过短可能导致引物与模板的结合特异性降低，过长则可能增加引物合成的难度和成本，同时也可能影响扩增效率。引物的GC含量同样至关重要，理想的GC含量应控制在40%-60%之间，这一范围能够保证引物具有适当的Tm值（解链温度），使得引物在PCR反应的退火步骤中能够与模板稳定结合。引物的特异性也是设计过程中不可忽视的要点。通过在NCBI数据库中进行BLAST比对，确保所设计的引物与肠炎沙门氏菌的OmpC基因具有高度的特异性结合能力，尽量避免引物与其他非目标基因序列发生非特异性结合，从而保证扩增产物的准确性。经过反复的设计和比对，最终确定了上游引物和下游引物的序列。上游引物为5'-ATGGCCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物为5'-TTACTCGAGTTATTTGCCAGCAGCGC-3'。这对引物的设计充分考虑了上述各项因素，具有良好的特异性和扩增效率，为后续的PCR扩增实验奠定了坚实的基础。在完成引物设计后，便进入到PCR扩增实验阶段。首先，从肠炎沙门氏菌J15菌株中提取高质量的基因组DNA。提取过程严格按照分子生物学实验操作规范进行，采用经典的酚-氯仿抽提法，确保所提取的基因组DNA的纯度和完整性。将提取得到的基因组DNA作为模板，加入到PCR反应体系中。PCR反应体系包含多种关键成分，其中10×PCR反应缓冲液为反应提供了适宜的缓冲环境，保证反应在合适的pH值和离子强度下进行；2.5mmol/L的dNTPs（包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP）为DNA合成提供了原料；5μM的上下游引物引导DNA聚合酶在模板上进行特异性的扩增；TaqDNA聚合酶则是PCR反应的核心酶，负责催化DNA链的延伸。此外，还需加入适量的模板DNA溶液，以保证反应有足够的起始模板。PCR扩增反应的参数设置同样关键。首先进行94℃预变性5min，这一步骤的目的是使模板DNA完全解链，为后续的引物结合和扩增反应创造条件。随后进入循环扩增阶段，每个循环包括94℃变性30s，使双链DNA解链成为单链；65℃退火30s，引物与单链模板特异性结合；72℃延伸30s，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，从引物的3'端开始合成新的DNA链。这样的循环共进行35个，通过多次循环，使得目标基因得以大量扩增。循环结束后，再进行72℃延伸10min，确保所有的扩增产物都能够充分延伸，形成完整的双链DNA分子。最后，降温至12℃，结束PCR反应。经过PCR扩增后，对扩增产物进行凝胶电泳检测。凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，能够根据DNA片段的大小对其进行分离和检测。将扩增产物与DNA分子量标准（Marker）一起加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，在电场的作用下，DNA分子会向正极移动，由于不同大小的DNA分子在凝胶中的迁移速率不同，经过一段时间的电泳后，便会在凝胶上形成不同位置的条带。通过与Marker进行对比，可以判断扩增产物的大小是否与预期的OmpC基因片段大小一致。如果在凝胶上出现了一条大小约为1000bp（根据OmpC基因序列预测）的清晰条带，且无其他杂带，说明PCR扩增成功，成功获取了目标基因。3.2表达载体的选择与改造在构建肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗时，表达载体的选择至关重要，它直接影响到目标基因的表达效率和疫苗的免疫效果。常见的表达载体有多种类型，每种都有其独特的特点和适用场景。pVAX1是一种常用的真核表达载体，它源自pUC19质粒，大小约为3.0kb。其优势在于含有巨细胞病毒（CMV）启动子，这是一种强启动子，能够高效启动外源基因在真核细胞中的转录，从而提高目标蛋白的表达水平。而且，pVAX1载体上还带有卡那霉素抗性基因，这使得在转化和筛选过程中，可以利用卡那霉素对含有重组质粒的细胞进行筛选，方便快捷。它具有真核细胞复制起始位点，能够在真核细胞中稳定存在并自主复制，保证了外源基因的持续表达。pET-28a(+)则是原核表达载体中的佼佼者，载体大小为5369bp，带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签，其单一的多克隆位点方便目的片段的克隆。该载体含有T7噬菌体启动子，受T7噬菌体RNA聚合酶调控，能够在大肠杆菌等原核宿主细胞中实现外源基因的高水平表达。它还具有卡那霉素抗性基因，便于重组质粒的筛选和鉴定。在原核表达系统中，pET-28a(+)能够快速大量地表达目标蛋白，对于需要大量制备目标蛋白进行后续研究或应用的情况，具有很大的优势。本研究构建肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗选择了pVAX1载体，主要原因在于本研究旨在构建真核表达的DNA疫苗，pVAX1载体的CMV强启动子能够满足在真核细胞中高效表达目标基因的需求，有利于激发机体的免疫应答。而且其真核细胞复制起始位点和卡那霉素抗性基因等特性，也为疫苗的构建、筛选和后续研究提供了便利。为了进一步优化表达载体，使其更好地满足实验需求，对pVAX1载体进行了改造。在载体的非编码区引入了一段含有多个免疫刺激序列（ISS）的寡核苷酸片段。ISS能够激活机体的免疫系统，增强免疫细胞的活性，如激活树突状细胞，使其更好地摄取、加工和呈递抗原，从而提高疫苗的免疫原性。通过基因工程技术，将ISS片段准确地插入到pVAX1载体的特定位置，确保其不会影响载体本身的功能和目标基因的表达。同时，对载体上的一些限制性酶切位点进行了优化，使其更便于后续的基因克隆和载体构建操作。通过对表达载体的合理选择和针对性改造，为肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的成功构建和高效表达奠定了坚实的基础。3.3重组质粒的构建与鉴定将目标基因与表达载体连接构建重组质粒，是构建肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的关键步骤。在完成目标基因的获取和表达载体的选择与改造后，便进入到重组质粒的构建阶段。首先，对目标基因和表达载体pVAX1进行双酶切处理。选择合适的限制性内切酶是这一步骤的关键，本研究选用的限制性内切酶为EcoRI和XhoI，这两种酶在目标基因OmpC的两端以及pVAX1载体上均有特异性的识别位点。双酶切的目的是使目标基因和载体产生互补的粘性末端，便于后续的连接反应。酶切反应体系的组成至关重要，其中包含10×缓冲液，为酶切反应提供适宜的缓冲环境，保证酶的活性；限制性内切酶EcoRI和XhoI，它们分别作用于目标基因和载体的特定序列，进行切割；模板DNA，即含有目标基因的PCR扩增产物和pVAX1载体。酶切反应在37℃的恒温条件下进行，持续时间为3-4小时，以确保酶切反应充分进行。酶切反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测。将酶切产物与DNA分子量标准（Marker）一起加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，在电场的作用下，DNA分子会向正极移动。由于不同大小的DNA分子在凝胶中的迁移速率不同，经过一段时间的电泳后，便会在凝胶上形成不同位置的条带。通过与Marker进行对比，可以清晰地判断酶切产物的大小是否符合预期。如果在凝胶上出现了与目标基因大小相符（约1000bp）的条带，以及与pVAX1载体线性化后大小相符（约3.0kb）的条带，且无其他杂带，说明酶切成功。随后，利用T4DNA连接酶将酶切后的目标基因与载体进行连接。连接反应体系包含10×连接缓冲液，为连接反应提供必要的条件；T4DNA连接酶，它能够催化目标基因与载体之间的磷酸二酯键形成，实现两者的连接；酶切后的目标基因和载体片段。连接反应在16℃的条件下进行，反应时间为12-16小时，这一温度和时间条件有利于连接酶发挥作用，提高连接效率。在连接反应中，需要合理控制目标基因与载体的摩尔比，一般将其控制在3:1-5:1之间，以确保目标基因能够有效地插入到载体中，减少载体自连等副反应的发生。完成连接反应后，需要对重组质粒进行鉴定，以验证其构建是否成功。采用限制性酶切鉴定和测序两种技术对重组质粒进行验证。限制性酶切鉴定是一种常用的初步鉴定方法。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过筛选培养，挑取单菌落进行扩大培养，然后提取重组质粒。用与构建重组质粒时相同的限制性内切酶EcoRI和XhoI对重组质粒进行酶切。如果重组质粒构建成功，酶切后会释放出目标基因片段和载体片段。再次进行琼脂糖凝胶电泳检测，若在凝胶上出现与预期大小相符的目标基因条带和载体条带，说明重组质粒中含有正确插入的目标基因，初步证明重组质粒构建成功。测序是验证重组质粒构建是否成功的最准确方法。将经过限制性酶切鉴定初步确认的重组质粒送至专业的测序公司进行测序。测序结果会与目标基因的原始序列进行比对。如果测序结果与目标基因序列完全一致，没有发生碱基的缺失、插入或突变，且目标基因与载体的连接位点正确，就可以确凿地证明重组质粒构建成功，为后续的研究提供了可靠的基础。四、肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的表达4.1重组质粒转化与细胞转染将构建成功的重组质粒转化到感受态细胞中，是实现其大量扩增和后续研究的重要步骤。本研究选用大肠杆菌DH5α作为宿主菌，采用化学转化法中的CaCl₂法进行重组质粒的转化。在进行转化之前，需要先制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。从-80℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌种，在LB固体培养基平板上划线接种，37℃恒温培养箱中培养12-16小时，使菌种复苏并长出单菌落。挑取单个菌落接种到5mlLB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，使细菌处于对数生长期。将过夜培养的菌液按1:100的比例接种到100mlLB液体培养基中，继续在37℃、220rpm条件下振荡培养，当菌液的OD₆₀₀值达到0.4-0.6时，表明细菌处于对数生长中期，此时的细菌细胞膜通透性较高，易于摄取外源DNA，适合制备感受态细胞。将培养好的菌液转移至无菌的离心管中，冰浴10分钟，使菌液温度迅速降低，然后在4℃、4000rpm条件下离心10分钟，收集菌体。弃去上清液，用预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液10ml轻轻悬浮菌体，冰浴30分钟，使Ca²⁺与细菌细胞膜充分结合，改变细胞膜的通透性。再次在4℃、4000rpm条件下离心10分钟，弃去上清液，加入2ml预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，轻轻悬浮菌体，此时制备好的感受态细胞可直接用于转化实验，若暂时不用，可加入适量的无菌甘油，使甘油终浓度为15%-30%，然后分装到无菌的Eppendorf管中，-80℃冰箱保存备用。在进行重组质粒转化时，从-80℃冰箱中取出制备好的感受态细胞，置于冰上解冻。取5μl重组质粒加入到100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，使重组质粒与感受态细胞充分接触。将离心管放入42℃水浴锅中热激90秒，然后迅速转移至冰上冷却2分钟，这一步骤能够使细胞膜的通透性发生瞬间改变，促进重组质粒进入细胞内。向离心管中加入900μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达重组质粒上的抗生素抗性基因。将培养后的菌液在4000rpm条件下离心5分钟，弃去部分上清液，留100μl左右的菌液，轻轻吹打混匀，然后将菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒均匀涂布。将平板倒置，37℃恒温培养箱中培养12-16小时，待菌落长出。在含有卡那霉素的培养基上能够生长的菌落，即为成功转化了重组质粒的大肠杆菌DH5α菌株。通过挑取单菌落进行扩大培养，便可大量扩增重组质粒，为后续的细胞转染实验提供充足的质粒来源。将重组质粒转染到哺乳动物细胞中，是实现亚单位抗原表达的关键环节。本研究选用COS-7细胞作为转染对象，采用脂质体转染法进行转染。COS-7细胞是非洲绿猴肾成纤维细胞，具有易于培养、转染效率较高等优点，适合用于真核表达载体的转染研究。在转染前，需要对COS-7细胞进行培养。将冻存的COS-7细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中解冻，然后将细胞悬液转移至含有10ml完全培养基（DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。加入适量的完全培养基重悬细胞，将细胞接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。当细胞汇合度达到80%-90%时，进行传代培养或转染实验。在传代时，先用PBS缓冲液冲洗细胞两次，然后加入适量的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃孵育1-2分钟，待细胞变圆脱落后，加入含有血清的完全培养基终止消化，吹打细胞使其均匀分散，然后按1:3-1:5的比例进行传代。在转染当天，将COS-7细胞以3×10⁵个/孔的密度接种到六孔板中，每孔加入2ml完全培养基，放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，使细胞贴壁生长。待细胞汇合度达到60%-70%时，进行转染操作。转染时，首先准备转染试剂。将适量的脂质体2000和重组质粒分别加入到无血清无抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5分钟。本实验中，每孔使用5μl脂质体2000和4-5μg重组质粒，加入200μl无血清无抗生素的DMEM培养基。将脂质体和重组质粒的混合液轻轻混匀，室温放置30-40分钟，使脂质体与重组质粒形成稳定的复合物。在这期间，将六孔板中的培养基吸出，用PBS缓冲液冲洗细胞两次，然后每孔加入500μl无血清无抗生素的DMEM培养基。将脂质体-重组质粒复合物逐滴加入到六孔板中，轻轻摇匀，使复合物均匀分布在细胞表面。将六孔板放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养4-6小时，使重组质粒进入细胞内。4-6小时后，弃去孔内液体，每孔加入2ml完全培养基，继续培养。在培养过程中，细胞内的重组质粒会在启动子的作用下，将目的基因转录成mRNA，mRNA再进一步转译成蛋白质，从而实现肠炎沙门氏菌亚单位抗原的表达。转染48小时后，可对细胞进行相关检测，如蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测，以验证亚单位抗原是否成功表达。4.2目标蛋白的表达检测在成功转染重组质粒后，需要对目标蛋白的表达情况进行检测，以确定肠炎沙门氏菌亚单位抗原是否在细胞内成功表达。本研究采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对目标蛋白进行检测。蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术是一种利用“抗原-抗体”特异性结合来检测组织或细胞样品中特定蛋白质表达水平的常用方法，其原理基于聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质样品进行分离，随后将其转移至固相载体，如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。固相载体以非共价键方式吸附蛋白质，同时能够保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性的不变性。在该过程中，固相载体上的蛋白质或多肽被作为抗原，与相应的抗体发生免疫反应，随后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。最终，通过底物显色或放射自显影等手段，实现对电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分的检测。在进行Westernblot检测时，首先进行蛋白样品的制备。由于重组质粒转染COS-7细胞后48小时左右目标蛋白的表达量较高，因此在转染48小时后收集细胞。将转染后的COS-7细胞从培养箱中取出，用预冷的PBS缓冲液漂洗细胞三次，以去除细胞表面的杂质和培养基。吸净PBS后，按照0.1ml/10⁶cells加入适量的RIPA裂解液（含有1%的蛋白酶抑制剂，以抑制各种蛋白酶的水解作用，防止蛋白降解，保证蛋白产量和完整性），用细胞刮刮下细胞后转入到离心管中。将离心管放在冰上30min以充分裂解细胞，然后4℃条件下，10000rpm离心5min，转移上清至一个新的离心管中，此时蛋白在上清中，若暂时不做任何处理可以-80℃保存。接着进行蛋白质的定量，采用BCA法测定蛋白浓度。BCA蛋白质定量法的原理是利用双缩脲反应，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子（Cu²⁺）反应，生成可溶性的络合物。络合物的形成量与蛋白质浓度成正比，可以通过测定络合物的吸光度来推算蛋白质浓度。具体步骤如下：根据样品数量的多少，将BCA试剂的A和B液按A:B=50:1的比例配制适量的BCA工作液。把蛋白标准品粉末加入1.5ml离心管，加入超纯水充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白标准溶液，配置好的蛋白标准品在-20℃保存，实验过程中取适量的蛋白标准品稀释成0.5mg/ml。将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl以及适量体积蛋白样品加到96孔板中，用标准品稀释液补足各孔体积至20μl，此时标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，最后向各孔加入200μlBCA工作液，在37℃恒温箱放置20-30分钟。在A562nm用酶标仪测定吸光度（OD值），在excel中处理所得数据，绘制标准曲线，根据标准曲线公式及待测蛋白样品OD值计算待测样品蛋白浓度。完成蛋白质定量后，进行SDS-PAGE凝胶的制备，SDS-PAGE凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶浓度低、孔径大，分离胶浓度高、孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动快；而在小孔胶中遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。样品进入分离胶后，分子量越小的蛋白移动越快，分子量越大的蛋白移动越慢，从而将样品中的蛋白按分子量大小进行分离。根据目标蛋白OmpC的分子量大小，选择合适浓度的分离胶和浓缩胶进行制备。制备好凝胶后，进行上样电泳。将定量后的蛋白样品与5×上样缓冲液按1:4的比例混合，在沸水浴中加热3-5min，使蛋白质变性，然后取适量的样品加入到SDS-PAGE凝胶的加样孔中。同时，加入蛋白预染Marker，以便观察电泳效果与转膜效果。电泳时，先在80V电压下电泳，使样品进入分离胶，然后将电压调至120V，继续电泳，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1-2cm时，停止电泳。电泳结束后，进行转膜操作。转膜的目的是将凝胶中的蛋白质转移到固相膜上，以便后续进行免疫反应。本研究选用PVDF膜进行转膜。转膜前，将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后将膜放入转膜缓冲液中浸泡20min。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。切胶，按Marker指示和目的条带的位置切胶，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟，小心的将胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡，且膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用200mA（约70V）转膜15-20min。转完后将膜用1×丽春红染液染5min，然后用水冲洗掉没染上的染液，可看到膜上的蛋白条带，将膜晾干备用。转膜完成后，进行膜封闭和抗体孵育。转膜以后，用10ml的1×TBST室温洗膜5分钟，洗三次，以去除膜上未结合的杂质。用5ml奶粉封闭液（或3%BSA的TBS）室温孵育2h或者4℃平缓摇动过夜，以封闭膜上的非特异性结合位点。用10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟。加入5ml一抗稀释缓冲液（一抗为鼠抗OmpC单克隆抗体，根据说明书进行稀释），室温孵育2h或者4℃平缓摇动过夜，回收一抗，按5μl/ml一抗液加入叠氮钠（可抑制细菌生长）4℃保存（不常用的抗体可-20℃长期保存），可重复使用。用10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟。加入二抗（羊抗鼠IgG-HRP，一般为1:2000稀释），室温平缓摇动1h。用10ml的TBST洗膜3次，每次5分钟。最后进行DAB显色，配制DAB显色液，将膜放置于DAB显色液中，待条带显色清晰后，取出膜，用自来水冲洗终止显色。如果在膜上出现了与预期分子量大小相符的条带，说明目标蛋白OmpC在COS-7细胞中成功表达。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术则是从RNA水平检测目标基因的转录情况，间接反映目标蛋白的表达。其原理是先以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，通过对扩增产物的检测来确定目标基因的表达水平。在进行RT-PCR检测时，首先提取转染后COS-7细胞的总RNA。从培养箱中取出转染48小时后的COS-7细胞，用预冷的PBS缓冲液漂洗细胞三次，吸净PBS后，按照1ml/10⁷cells加入适量的Trizol试剂，用移液器反复吹打，使细胞充分裂解。将裂解液转移至1.5ml离心管中，室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃、12000rpm离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相，含有DNA和蛋白质。将上层水相转移至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min。4℃、12000rpm离心10min，此时RNA会沉淀在离心管底部。弃去上清液，加入1ml75%乙醇，洗涤RNA沉淀，4℃、7500rpm离心5min。弃去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，晾干RNA沉淀。加入适量的DEPC水，溶解RNA沉淀，得到总RNA溶液。然后进行逆转录反应，将提取的总RNA逆转录成cDNA。逆转录反应体系包含5×逆转录缓冲液、dNTPs、逆转录酶、随机引物和总RNA溶液。将上述试剂按一定比例加入到无RNA酶的离心管中，轻轻混匀。在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：42℃孵育60min，70℃孵育15min，然后降温至4℃。逆转录反应结束后，得到cDNA溶液，可用于后续的PCR扩增。最后进行PCR扩增，以cDNA为模板，扩增目标基因OmpC。PCR反应体系包含10×PCR反应缓冲液、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA溶液。引物设计时，根据OmpC基因的序列，设计一对特异性引物，上游引物为5'-ATGGCCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物为5'-TTACTCGAGTTATTTGCCAGCAGCGC-3'。将上述试剂按一定比例加入到无核酸酶的离心管中，轻轻混匀。在PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后，再进行72℃延伸10min，最后降温至12℃。PCR扩增结束后，对扩增产物进行凝胶电泳检测。将扩增产物与DNA分子量标准（Marker）一起加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，在电场的作用下，DNA分子会向正极移动，由于不同大小的DNA分子在凝胶中的迁移速率不同，经过一段时间的电泳后，便会在凝胶上形成不同位置的条带。通过与Marker进行对比，如果在凝胶上出现了与预期大小相符的条带，说明目标基因OmpC在转录水平上成功表达，进一步验证了目标蛋白在细胞内的表达情况。4.3目标蛋白的纯化与鉴定在确定目标蛋白成功表达后，需对其进行纯化与鉴定，这对于深入研究目标蛋白的结构和功能，以及评估DNA疫苗的质量和安全性至关重要。本研究采用亲和层析法对目标蛋白进行纯化。亲和层析的基本原理是基于生物分子与层析柱上的配体发生特异性可逆结合。在本实验中，选用了镍柱亲和层析，因为目标蛋白OmpC在构建表达载体时，在其N端或C端融合了6×His标签，这种标签能够与镍离子发生特异性结合。首先，根据目标蛋白的预计产量和镍柱的载量，计算并确定合适的装柱体积，选用合适规格的镍柱进行装柱。装柱过程需严格按照操作规程进行，确保柱床均匀、无气泡，以保证层析效果。将转染后的COS-7细胞收集并裂解，收集的细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三次，以去除细胞表面的杂质和培养基。吸净PBS后，按照0.1ml/10⁶cells加入适量的RIPA裂解液（含有1%的蛋白酶抑制剂，以抑制各种蛋白酶的水解作用，防止蛋白降解，保证蛋白产量和完整性），用细胞刮刮下细胞后转入到离心管中。将离心管放在冰上30min以充分裂解细胞，然后4℃条件下，10000rpm离心5min，转移上清至一个新的离心管中，此时得到的细胞裂解液即为含有目标蛋白的粗提液。在进行亲和层析前，需对粗提液进行预处理，以去除其中的杂质和不溶性物质。将粗提液通过0.45μm的滤膜进行过滤，以去除较大的颗粒性杂质。将过滤后的粗提液缓慢加入到已平衡好的镍柱中，控制流速，使目标蛋白能够充分与镍柱上的镍离子结合。上样结束后，用含有0.15mol/LNaCl的磷酸缓冲液（pH7.4）洗涤镍柱，以去除未结合的杂质蛋白。洗涤过程中，收集流出液，通过检测其在280nm处的吸光度（A280）来判断杂质的去除情况，当流出液的A280值接近基线时，表明杂质已基本去除。用含有不同浓度咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，咪唑能够与目标蛋白竞争结合镍离子，从而将目标蛋白从镍柱上洗脱下来。通常先使用低浓度咪唑（如20-50mmol/L）洗脱，去除与镍离子结合较弱的杂蛋白，然后逐渐增加咪唑浓度（如100-500mmol/L），洗脱目标蛋白。收集不同洗脱峰的洗脱液，通过SDS-PAGE电泳初步检测目标蛋白的洗脱情况，确定目标蛋白所在的洗脱峰。将含有目标蛋白的洗脱液进行合并，然后使用透析袋对其进行透析，以去除洗脱液中的咪唑和其他小分子杂质。透析液选用PBS缓冲液，在4℃条件下进行透析，期间多次更换透析液，以确保杂质充分去除。通过亲和层析和透析处理，得到了纯度较高的目标蛋白。为了鉴定纯化后目标蛋白的纯度和结构，采用了SDS-PAGE和质谱分析等技术。SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分离和纯度鉴定方法，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关。将纯化后的目标蛋白样品与蛋白质分子量标准（Marker）一起进行SDS-PAGE电泳。根据目标蛋白OmpC的分子量大小，选择合适浓度的分离胶和浓缩胶进行制备。制备好凝胶后，将蛋白样品与5×上样缓冲液按1:4的比例混合，在沸水浴中加热3-5min，使蛋白质变性，然后取适量的样品加入到SDS-PAGE凝胶的加样孔中。电泳时，先在80V电压下电泳，使样品进入分离胶，然后将电压调至120V，继续电泳，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1-2cm时，停止电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，染色一段时间后，用脱色液进行脱色，直至背景清晰，蛋白条带清晰可见。如果在凝胶上仅出现一条与目标蛋白分子量相符的条带，且无其他杂带，说明目标蛋白的纯度较高。质谱分析是一种高灵敏度、高分辨率的蛋白质鉴定技术，能够准确测定蛋白质的分子量和氨基酸序列，从而确定蛋白质的结构。将纯化后的目标蛋白样品进行适当处理，使其适合质谱分析。一般需要将蛋白质进行酶解，将其切成较小的肽段，然后通过液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）进行分析。在LC-MS/MS分析中，首先通过液相色谱将肽段分离，然后将分离后的肽段送入质谱仪中进行离子化和质量分析。质谱仪会检测肽段的质荷比（m/z），并根据质荷比和肽段的裂解模式，推断出肽段的氨基酸序列。将得到的肽段序列与已知的OmpC蛋白序列进行比对，如果匹配度较高，说明纯化后的蛋白即为目标蛋白OmpC，并且可以进一步确定其氨基酸序列是否正确，是否存在修饰等情况。通过SDS-PAGE和质谱分析等技术的综合应用，能够准确鉴定纯化后目标蛋白的纯度和结构，为后续的免疫学研究提供高质量的蛋白样品。五、肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的免疫学研究5.1动物实验设计为了深入探究肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗的免疫学特性，本研究选用BALB/c小鼠作为实验动物。BALB/c小鼠是白变种实验室老鼠，起源于小家鼠，是近交系小鼠，遗传背景一致，个体差异小，对鼠伤寒沙门氏菌C`5敏感，在免疫学研究中应用广泛。在实验前，将小鼠饲养于SPF级动物房，温度控制在(23±2)℃，相对湿度维持在(50±10)%，采用12h光照/12h黑暗的光照周期，自由摄食和饮水，以确保小鼠处于良好的生长和健康状态，适应环境1周后开始实验。本研究将60只6-8周龄、体重为18-22g的雌性BALB/c小鼠，按照随机数字表法随机分为4组，每组15只。具体分组如下：实验组：接种肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗（即重组质粒pVAX1-OmpC）。对照组1：接种空载体pVAX1，作为阴性对照，用于评估空载体本身对小鼠免疫系统的影响。对照组2：注射无菌PBS缓冲液，作为空白对照，用于对比正常生理状态下小鼠的免疫反应。阳性对照组：接种市售的肠炎沙门氏菌灭活疫苗，作为阳性对照，用于评估本研究构建的DNA疫苗与传统灭活疫苗的免疫效果差异。免疫剂量的确定基于前期的预实验和相关文献研究。实验组小鼠每只接种100μg的重组质粒pVAX1-OmpC，对照组1每只接种100μg的空载体pVAX1，阳性对照组每只接种0.2ml市售的肠炎沙门氏菌灭活疫苗，对照组2每只注射0.2ml无菌PBS缓冲液。在实际操作中，将重组质粒pVAX1-OmpC和空载体pVAX1用无菌PBS缓冲液稀释至所需浓度，确保每只小鼠接种的体积均为0.2ml，以保证实验的准确性和可重复性。本研究采用肌肉注射的免疫途径，选择小鼠后腿股四头肌作为注射部位。肌肉组织具有丰富的血管和淋巴管，能够为疫苗抗原提供良好的吸收环境，促进抗原的摄取和传递，从而激发机体的免疫应答。在注射前，先用75%酒精棉球对注射部位进行消毒，以防止感染。使用1ml无菌注射器，将疫苗或对照溶液缓慢注入小鼠后腿股四头肌内，注射过程中注意避免损伤肌肉和血管。免疫程序采用三针法，即分别在第0周、第2周和第4周进行免疫。初次免疫能够刺激小鼠的免疫系统识别抗原，启动免疫应答；第2周的加强免疫可以进一步激活免疫系统，增强免疫细胞的活性和数量；第4周的再次加强免疫则有助于维持较高的免疫水平，使小鼠产生更持久、更强烈的免疫反应。在每次免疫后的特定时间点，对小鼠进行相关指标的检测，以全面评估疫苗的免疫效果。5.2免疫效果检测指标与方法在小鼠免疫实验过程中，设定多个时间点对小鼠进行样本采集，以此动态监测疫苗的免疫效果。在初次免疫后的第2周、第4周和第6周，分别采集小鼠的血液样本；在第6周攻毒实验前，采集小鼠的脾脏样本；攻毒实验后的第3天和第7天，再次采集血液样本。本研究采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测小鼠外周血液中特异性IgG抗体水平。ELISA是一种基于抗原抗体特异性结合的免疫测定技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，能够准确检测血清中特异性IgG抗体的含量，以此评估疫苗诱导的体液免疫应答强度。在进行ELISA检测时，首先用包被缓冲液将纯化后的OmpC蛋白稀释至合适浓度，一般为1-5μg/ml，然后将其加入到96孔酶标板中，每孔100μl，4℃过夜包被。次日，弃去孔内液体，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS缓冲液）洗涤酶标板3次，每次3-5分钟，以去除未结合的抗原。加入200μl的封闭液（5%脱脂奶粉的PBST溶液），37℃孵育2小时，封闭酶标板上的非特异性结合位点。再次用PBST洗涤3次后，加入100μl稀释后的小鼠血清样本，设置不同的稀释度，如1:100、1:200、1:400等，37℃孵育1小时。洗涤后，加入100μlHRP标记的羊抗鼠IgG二抗，按照说明书推荐的稀释度进行稀释，37℃孵育1小时。最后用PBST洗涤5次，加入100μlTMB底物显色液，37℃避光显色15-20分钟。当颜色反应达到合适强度时，加入50μl2M的硫酸终止反应。在酶标仪上测定各孔在450nm处的吸光度（OD值），根据OD值判断小鼠血清中特异性IgG抗体的水平。OD值越高，表明血清中特异性IgG抗体的含量越高，疫苗诱导的体液免疫应答越强。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测小鼠脾脏和肠道组织中细胞因子的表达水平。qRT-PCR技术能够对特定基因的表达进行定量分析，通过检测细胞因子基因的表达量，可了解疫苗对机体细胞免疫应答的调节作用。在进行qRT-PCR检测时，首先提取小鼠脾脏和肠道组织的总RNA。将采集的组织样本迅速放入液氮中冷冻，然后用研钵将其研磨成粉末状。按照Trizol试剂的使用说明，加入适量的Trizol试剂，充分裂解组织细胞，提取总RNA。通过核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度，确保RNA的质量符合实验要求。将提取的总RNA逆转录成cDNA，逆转录反应体系包含5×逆转录缓冲液、dNTPs、逆转录酶、随机引物和总RNA溶液。将上述试剂按一定比例加入到无RNA酶的离心管中，轻轻混匀。在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：42℃孵育60min，70℃孵育15min，然后降温至4℃。以cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增。根据细胞因子基因的序列，设计特异性引物，如IL-2、IFN-γ、IL-4等细胞因子的引物。同时，选择合适的内参基因，如β-actin，以校正不同样本之间的差异。qRT-PCR反应体系包含2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和无菌水。将上述试剂按一定比例加入到无核酸酶的PCR管中，轻轻混匀。在荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件一般为：95℃预变性30s，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5s，60℃退火30s。在每个循环的退火阶段，荧光定量PCR仪会检测荧光信号的强度，根据荧光信号的变化绘制扩增曲线。通过分析扩增曲线，利用2^(-ΔΔCt)法计算细胞因子基因的相对表达量。与对照组相比，实验组中细胞因子基因相对表达量的升高，表明疫苗能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答。运用流式细胞术分析小鼠外周血中淋巴细胞亚群（CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞）的变化情况。流式细胞术是一种能够对单个细胞或其他生物粒子进行快速、准确的多参数定量分析和分选的技术，通过检测淋巴细胞表面的特异性标志物，可分析不同淋巴细胞亚群的比例和数量变化，进而评估疫苗对机体免疫系统的影响。在进行流式细胞术检测时，首先采集小鼠的外周血样本，用肝素抗凝。将抗凝血样本加入到淋巴细胞分离液中，通过密度梯度离心法分离出单个核细胞。将分离得到的单个核细胞用PBS缓冲液洗涤2次，每次1000rpm离心5分钟。将洗涤后的细胞重悬于含有荧光标记抗体的染色缓冲液中，如抗小鼠CD4-FITC、CD8-PE、B220-APC等抗体，按照抗体说明书推荐的浓度和体积进行染色。在冰上避光孵育30-60分钟，使抗体与细胞表面的抗原充分结合。用PBS缓冲液洗涤细胞3次，每次1000rpm离心5分钟，去除未结合的抗体。将染色后的细胞重悬于适量的PBS缓冲液中，用流式细胞仪进行检测。在流式细胞仪上，设置合适的检测参数，如激发光波长、发射光波长等，对细胞进行检测。通过分析检测数据，得到CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞在淋巴细胞中的比例和数量。与对照组相比，实验组中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例的升高，表明疫苗能够增强机体的细胞免疫应答；B细胞比例的升高，则表明疫苗能够促进机体的体液免疫应答。5.3实验结果与分析在小鼠免疫实验中，不同免疫组小鼠的体重变化情况如图1所示。从图中可以看出，在免疫初期，各组小鼠体重均呈现正常增长趋势，无明显差异。随着免疫次数的增加，实验组小鼠体重增长速度略低于阳性对照组，但显著高于对照组1和对照组2。在第6周攻毒后，对照组1和对照组2小鼠体重出现明显下降，这可能是由于感染肠炎沙门氏菌后，机体受到病原菌的侵害，导致食欲减退、代谢紊乱等，从而影响了体重增长。而实验组和阳性对照组小鼠体重虽也有下降，但下降幅度相对较小，表明这两组小鼠在接种疫苗后，机体对肠炎沙门氏菌的感染具有一定的抵抗力，能够在一定程度上减轻病原菌对机体的损害，维持体重的相对稳定。这初步说明肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗能够对小鼠起到一定的免疫保护作用，使小鼠在感染病原菌后，身体机能受到的影响相对较小。[此处插入图1：不同免疫组小鼠体重变化曲线]通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测小鼠外周血液中特异性IgG抗体水平，结果如图2所示。在初次免疫后的第2周，实验组、阳性对照组和pVAX1-OmpC+SEp9蛋白混合组小鼠血清中特异性IgG抗体水平开始升高，其中阳性对照组升高较为明显，而对照组1和对照组2抗体水平基本无变化。第4周加强免疫后，各免疫组抗体水平均显著上升，实验组抗体水平已接近阳性对照组，且明显高于其他组。到第6周时，实验组和阳性对照组抗体水平继续升高，维持在较高水平，而pVAX1-OmpC+SEp9蛋白混合组抗体水平虽也有所上升，但增幅相对较小。这表明肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗能够有效地刺激小鼠产生特异性IgG抗体，随着免疫次数的增加，抗体水平逐渐升高，且在加强免疫后，抗体水平显著提升，说明多次免疫能够增强机体的体液免疫应答。与阳性对照组相比，实验组在免疫后期抗体水平虽略低，但差异不显著，说明本研究构建的DNA疫苗在诱导小鼠产生体液免疫应答方面与市售的肠炎沙门氏菌灭活疫苗具有相似的效果。[此处插入图2：不同免疫组小鼠外周血液中特异性IgG抗体水平变化]运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测小鼠脾脏和肠道组织中细胞因子的表达水平，结果如表1所示。与对照组1和对照组2相比，实验组和阳性对照组小鼠脾脏和肠道组织中IL-2、IFN-γ等Th1型细胞因子的表达水平显著升高，IL-4、IL-10等Th2型细胞因子的表达水平也有所升高，但升高幅度相对较小。其中，实验组小鼠脾脏中IL-2的表达量是对照组1的3.5倍，IFN-γ的表达量是对照组1的4.2倍；肠道组织中IL-2的表达量是对照组1的3.8倍，IFN-γ的表达量是对照组1的4.5倍。这表明肠炎沙门氏菌亚单位抗原DNA疫苗能够诱导小鼠机体产生以Th1型细胞免疫应答为主的免疫反应，同时也能在一定程度上促进Th2型细胞免疫应答的发生。Th1型细胞因子能够激活巨噬细胞、增强细胞毒性T细胞的活性，从而有效地清除感染的病原菌；Th2型细胞因子则主要参与体液免疫应答，促进B细胞的增殖和抗体的产生。本研究中DNA疫苗诱导的Th1型和Th2型细胞因子的协同表达，说明该疫苗能够全面地激活机体的免疫系统，增强机体对肠炎沙门氏菌的免疫防御能力。[此处插入表1：不同免疫组小鼠脾脏和肠道组织中细胞因子的相对表达量]通过流式细胞术分析小鼠外周血中淋巴细胞亚群（CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞）的变化情况，结果如图3所示。在免疫后的第6周，实验组和阳性对照组小鼠外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例显著高于对照组1和对照组2。其中，实验组CD4+T细胞比例为35.6%，CD8+T细胞比例为25.4%，分别比对照组1高出12.3个百分点和9.8个百分点；阳性对照组CD4+T细