NDVF基因和IBDVVP2基因二联疫苗的制备

。为解决掉这一限制，研究者发现采用早期启动子可显著提升外源蛋白的产量REF_Ref22000\r\h[18]。现如今基因工程领域有四大表达系统，杆状病毒-昆虫细胞表达系统（BEVS）因其独特优势占据重要地位REF_Ref23555\r\h[19]。此系统不仅能够实现多种蛋白的共同表达，还能完成复杂的翻译后修饰过程，这些特性使其成为真核表达研究中的重要工具REF_Ref23617\r\h[20]。本研究创新性地构建了双表达载体系统：一方面利用杆状病毒特有的强效pPolH启动子驱动GP64SP和VSV-GED等膜表面调控元件的表达；另一方面在病毒转导哺乳动物细胞后，通过CMV启动子激活外源基因的表达模块REF_Ref21953\r\h[12]。这种双系统设计通过大量实验验证，为新型疫苗研发提供了可靠的技术支持。相较于别的真核宿主表达系统，杆状病毒系统可让外源基因获得高水平的表达，可插入大片段的外源基因，安全程度较为可观，能高效转录大片段靶基因，且外源蛋白产量能占据宿主昆虫细胞总蛋白的50%，并展现出良好的生物活性和免疫原性，操作简便REF_Ref21896\r\h[17]。1.3.2杆状病毒表达系统在禽类疫苗中的应用随着杆状病毒研究的持续深入，其应用场景正不断拓展。在哺乳动物面临多种病毒与疾病威胁的背景下，杆状病毒表达系统于疫苗研发、基因治疗等领域的重要性日益剧增。与其他表达系统相比较来看，该系统展现出显著特性：不仅能够有效插入大片段外源基因，还可对翻译产物进行精准修饰，且不会对宿主细胞产生毒性，同时具备安全性及功能性REF_Ref23617\r\h[20]。杆状病毒重组活载体疫苗是基因工程技术的创新成果。它以改造后的杆状病毒为载体，精准表达特定免疫活性因子，巧妙融合了DNA疫苗与传统活载体疫苗的优势。一方面，可大量合成单一抗原，迅速激发局部免疫反应，为接种动物提供免疫防护，且能有效规避体内预存抗体的干扰；另一方面，具备多基因共表达能力，可同步预防多种疾病。此外，该疫苗诱导产生的抗体具有高度特异性，仅针对目标抗原蛋白。当病毒发生抗原变异时，科研人员能够基于变异特征，快速开发针对性疫苗，极大提升了疫苗研发的灵活性与适应性。由此可见，杆状病毒重组活载体疫苗在实际应用中展现出独特的技术优势与广阔的发展前景REF_Ref23790\r\h[21]。本研究开发了一种基于杆状病毒载体的新型疫苗，成功实现NDV-F和IBDV-VP2抗原的高效共表达。该疫苗系统通过优化病毒扩增工艺，在Sf9昆虫细胞中获得高滴度的重组病毒。该重组病毒能有效感染禽类细胞，并在细胞内高水平表达目标抗原蛋白。验证出重组杆状病毒疫苗可高效的将外源抗原基因传递到家禽细胞中，刺激机体产生体液免疫及细胞免疫应答。为防控NDV和IBDV混合感染提供了新的解决方案。2.材料与方法2.1试验材料2.1.1供试材料Sf9（Spodopterafrugiperda）昆虫细胞：来源于黑龙江大学微生物重点实验室的冻存样本，主要用于杆状病毒的制备及扩增培养。2.1.2供试菌种和质粒表2-1供试菌株序号菌株名称菌株用途菌株来源1E.coliDH5α质粒转化宿主菌株黑龙江大学微生物重点实验室提供2E.coliDH10αBacBEVS转移载体转化宿主菌株黑龙江大学微生物重点实验室提供2.1.3扩增引物借助Primer5引物设计软件开展工作进程，使引物和模板完全互补到位，Tm值以60.0℃左右，偏差±5.0℃为宜，找Invitrogen公司完成引物合成，用灭菌双蒸水把引物配成100μmol/L的母液，存于-80℃冷冻系统中，浓度为10μmol/L，放在-20℃冷冻环境保存。表2-2引物序列引物序列5′-3′酶切位点扩增片段F-upATCCTCGAGATGGGCTCCAGACCTTCTACCXhoI扩增F基因F-down-linkercccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccATGATGATGATGATGATGCATTTTTGTAGTGGCTCTCATC--扩增F基因VP2-up-linkercgggcggtggtgggtcgggtgggggcggatctATGACAAACCTGCAAGATCAAAC--扩增Fs基因VP2-downGCGGTACCTCAATGATGATGATGATGATGTTACCTTATGGCCCGGATTATSalI扩增Fs基因2.1.4主要仪器设备表2-3主要仪器设备序号仪器名称型号生产厂家1超速冷冻离心机R-40Sorvall2PCR仪ABI9700美国基因有限公司3凝胶成像系统AlphalmagerHP英国AlphaInnotech公司4超纯水纯化系统PURELABUltra威立雅水处理技术（上海）有限公司5电热恒温培养箱DNP9082上海精宏实验设备有限公司6电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140上海精宏实验设备有限公司7空气浴摇床HZQ-C哈尔滨市东明医疗仪器厂8PHMeterFE20梅特勒一托利多公司9电热恒温水浴锅DK-S24上海精宏实验设备有限公司10低温水浴Typ011-3004ThermoElectroncoporation11生物安全柜HFsafe1500/C上海立申科学仪器有限公司12水平电泳槽DYY-III-3A北京六一仪器厂13电泳仪DYY-III-8B北京六一仪器厂14蒸汽压力灭菌锅mLS-3780日本三洋电子有限公司2.1.5主要分子生物学及生化试剂2.1.5.1工具酶从Sigma公司购入经DNase处理的RNA酶，XhoI和SalI这两个限制性内切酶，还有T4DNALigase、TaqDNA聚合酶都来自Fermentas有限公司，PrimerSTARTMDNAPolymerase与高保真DNAPolymerase则是从TaKaRa公司采购的。2.1.5.2试剂盒质粒抽提和胶回收试剂盒从华舜生物试剂公司购买。2.1.5.4生化试剂试剂来源：实验所需的琼脂糖、蛋白胨以及酵母提取物皆购自OXOID公司；上海生物工程有限公司的EDTA、SDS和氯仿是实验采用的；Amp至X-gal系列试剂是从TaKaRa公司采购的；实验用的Tris-Base和Glucose来自上海生物工程有限公司。2.1.6主要缓冲液及试剂配制2.1.6.1常用贮存液的配制采用X-gal（20毫克/毫升）显色底物和IPTG（200毫克/毫升）诱导剂，配合20×SSC（柠檬酸钠缓冲液）和TB基础液。2.1.6.2抗生素类抗生素名称浓度称取量溶解溶剂分装体积保存条件氨苄青霉素（AMP)100mg/mL1g灭菌ddH2O10mL-20℃保存卡那霉素（Kan）50mg/mL500mg灭菌ddH2O10mL-20℃保存四环素（Tet）10mg/mL100mg无水乙醇10mL避光-20℃保存庆大霉素（Gen）40mg/mL1mL医用注射液灭菌ddH2O1mL-20℃保存2.1.6.3质粒抽提相关溶液（1）溶液I：把10毫摩尔每升乙二胺四乙酸加入含50毫摩尔每升葡萄糖的Tris-Cl缓冲液里，经121摄氏度高压灭菌15分钟，冷却后4摄氏度储存备用。（2）溶液II（新鲜配制）：把1mL0.2mol/L的NaOH溶液和5mL1%的SDS溶液混合，再用ddH₂O把总体积调节为50mL。（3）溶液III：将4克醋酸钾与11.5毫升乙酸混合，接着用28.5毫升双蒸水溶解，最后冷藏在4℃环境备用。2.2试验方法2.2.1重组转移载体的构建2.2.1.1具有基因F-VP2重组转移质粒的构建A.载体pT-F、pT-VP2的鉴定利用F-up、F-down这对引物，拿本实验室留存的pT-F/VP2质粒模板做PCR扩增检测，表2-6是PCR程序参数，而PCR反应体系在表2-4列出。（1）经核实没问题后，把F-up/F-down-linker跟VP2-up-linker/VP2-down用作扩增引物，通过聚合酶链式反应取得F和VP2基因，体系的具体组分见表2-4，按照表2-5的PCR程序来完成扩增。表2-4PCR扩增F和VP2反应体系组分加入体积终浓度5×PrimerSTARTMBuffer(Mg2+plus)25μL1×dNTPMixture(10mM)4μL0.2mmol/μLUpstreamprimer1μL0.2mmol/μLDownstreamprimer1μL0.2mmol/μLpT-F,pT-VP23μL--PrimerSTARTMDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL0.5U/μLddH2OUpto50μL--表2-5PCR扩增F和VP2反应程序步骤时间温度循环数预变性4min94℃1变性30sec94℃退火30sec55℃30延伸1kb/min72℃终延伸10min72℃1经1%琼脂糖凝胶电泳验证达标的PCR产物被回收，随后依照GelExtractionMiniKit说明处理。（2）采用一步法SOE-PCR技术，将胶回收产物F与VP2两个片段进行融合，最终产物命名为“F-VP2”。在PCR管中加入以下融合PCR反应液，如表2-6，其中F与VP2俩个片段互为引物和模板进行退火和延伸，以F-up和VP2-down为两端的终引物进行扩增。表2-6SOE-PCR反应体系SOE-PCR反应体系组分加入体积终浓度5×PrimerSTARTMBuffer（Mg2+plus）10μL1×dNTPMixture（各2.5mM）4μL各0.2mmol/μLUpstreamprimer（F-up,10μM）1μL0.2pmol/μLDownstreamprimer（VP2-down,10μM）1μL0.2pmol/μLTemplate1（F）1.5μL（37ng）两个片段摩尔比为1：1Template2（VP2）4μL（266ng）PrimerSTARTMDNAPolymerase（2.5U/μL）0.5μL0.5U/μLddH2OUpto50μL--利用加“A”反应处理PCR产物的F-VP2片段，反应混合液配方以表2-7为准，反应流程按照表2-8。表2-7PCR扩增产物F-VP2末端加“A”反应体系药品加入体积终浓度10×Taqbutter2.5μL1×dNTPMixture(10mM)2μL0.8mMGelextrationproducts20μL--Taqenzyme(2.5U/μL)0.5μL1.25UddH2OUpto25μL表2-8PCR扩增产物F-VP2加“A”反应程序步骤时间温度循环数加A10min72℃1开展1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的PCR条带，切下该条带后，按GelExt-ractionMiniKit标准流程完成片段回收。（4）进行TA克隆实验，将pMD18-T载体与纯化后的F-VP2目标片段于16℃连接过夜，参考表格2-9确定反应混合比例，随后把构建好的pT-F-VP2载体导入DH5α大肠杆菌感受态细胞。表2-9F-VP2片段与pMD18-T载体连接反应体系药品加入体积10×T4DNALigasebutter1μLpGM-TVector1μLGelextrationproducts7μLT4DNALigase1μLddH2OUpto10μL（5）PCR验证把筛选的白色阳性菌落接入到3mLLB培养基内，160rpm振荡培养16小时，然后按标准碱裂解流程提取质粒，以分离的质粒DNA为模板，选取F-up/VP2-down这对引物进行扩增，进行聚合酶链式反应，检查目的片段是否整合进目标，表2-10和表2-11列出了PCR反应的体系组成和操作流程。表2-10质粒pT-F-VP2PCR反应体系药品加入体积终浓度10×TaqBuffer(Mg2+plus))1μL1×dNTPMixture(10mM)0.8μL0.8mmol/μLUpstreamprimer(10mM)0.2μL0.2pmol/μLDownstreamprimer0.2μL0.2pmol/μLRecombiantplasmid2μL--TaqDNApolymerase(2.5U/μL)0.2μL0.5U/μLddH2OUpto10μL--表2-11质粒pT-F-VP2PCR反应程序步骤时间温度循环数预变性4min94℃1变性30sec94℃退火30sec55℃30延伸1kb/min72℃终延伸10min72℃1（6）酶切鉴定将PCR阳性重组质粒用XhoI和SalI双酶切处理，37℃下放置3小时孵育，随后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选得到携带目标片段的pT-F-VP2阳性克隆，双酶切反应体系于表2-13中展示。表2-12质粒pT-F-VP2双酶切反应体系（XhoI/SalI）成分体积10×HBuffer1μLrecombinantplasmid2μLXhoI(15U/μL)0.5μLSalI(15U/μL)0.5μLddH2OUpto10μL（7）把阳性筛选质粒委托给博仕生物测序平台进行DNA测序，借助NCBIBLAST程序来做序列分析，确定所克隆基因是否是靶标F-VP2，将测序匹配的阳性重组质粒称为“pT-F-VP2”。B.重组转移质粒pLMI-F-VP2的构建对pT-F-VP2重组质粒和pLMI原始质粒，同时采用XhoI和SalI两种限制酶进行酶切，之后借助连接酶将F-VP2基因与pLMI质粒相连，由此得到重组质粒pL-MI-F-VP2。对pT-F-VP2和pLMI载体开展XhoI/SalI双酶切，在37℃水浴3小时，按表2-13的酶切反应条件操作。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，直接用试剂盒回收目的条带，将F-VP2酶切产物与pLMI线性化载体在16℃下进行过夜连接反应，连接体系参照表2-14。表2-13质粒pT-F-VP2和pLMI双酶切反应体系（XhoI/SalI）成分体积10×HBuffer5μLRecombinantplasmid10μLXhoI(15U/μL)2.5μLSalI(15U/μL)2.5μLddH2O50μL表2-14质粒pT-F-VP2和pLMI连接反应体系连接反应体系成分体积10×ligationBuffer1μL目的片段4μL(40ng)线性质粒载体1μL(10ng)T4DNALigase1μLddH2OUpto10μL把构建产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞当中，在37℃下进行3小时的复苏培养，用含AmpL（50μg/mL）和Gen（7μg/mL）的LB平板对菌液进行梯度涂抹，挑选出阳性白色菌落，接入3mLLB培养基，160rpm摇床振荡16小时，随后提取质粒DNA用于后续的实验研究。拿F-up和F-down引物进行PCR验证，筛选得到阳性重组子pLMI-F-VP2，按表2-11配置好PCR体系，程序执行参照表2-12，对重组质粒实施XhoI/SalI双酶切操作，相关参数记录在表2-15，阳性重组质粒载体都被命名为pLMI-F-VP2。提取质粒DNA用于后续的实验。以F-up和F-down为引物进行PCR验证，筛选阳性重组质粒pLMI-F-VP2，PCR反应体系和反应程序见表2-11、表2-12；XhoI/SalI双酶切重组质粒，如表2-15。阳性重组质粒载体分别命名为“pLMI-F-VP2”。表2-15质粒pLMI-F-VP2酶切反应体系（XhoI/SalI）成分体积10×HBuffer1μLRecorecombinantplasmid2μLXhoI(15U/μL)0.5μLSalI(15U/μL)0.5μLddH2OUpto10μL2.2.2重组杆状病毒穿梭载体BacmidDNA的获得分别利用重组载体pLMI-F-VP2转座E.coliDH10Bac感受态细胞，以获得重组的杆状病毒穿梭载体rBac-LMI-F-VP2。2.2.2.1重组转移质粒的转座将重组质粒pLMI-F-VP2分别加入到E.coliDH10Bac感受态细胞中。37℃培养48h，之后后放4℃冰箱至可见明显的蓝、白单菌落。2.2.2.2重组杆状病毒穿梭质粒（Bacmid）的鉴定选取100ng的Bacmid-LMI-F-VP2重组质粒DNA当作模板，用M13-47和F-up组合成扩增引物，看看5000bp处有没有预期条带，然后用F-up和VP2-down组成引物对，确认3100bp处是否有目的条带，以此来验证Bacmid-LMI-F-VP2的重组完整性，PCR实验体系按照表2-16配置，反应参数按照表2-17设定，经过双重检验，此重组杆状病毒穿梭质粒被叫做rBac-LMI-F-VP2。表2-16Bacmid-LMI-F-VP2穿梭质粒PCR反应体系药品加入体积终浓度10×TapBuffer(Mg2+plus)1μL1×dNTPMixture(10mM)0.8μL0.8pmol/μLUpstreamprimer(10μM)0.2μL0.2pmol/μLDownstreamprimer(10μM)0.2μL0.2pmol/μLBacmidDNA2μL--TapDNAPolymerase(2.5U/μL)0.2μL0.5U/μLddH2OUpto10μL--表2-17Bacmid-LMI-F-VP2穿梭质粒PCR反应程序步骤时间温度循环数预变性4min94℃1变性30sec94℃退火30sec55℃30延伸1kb/min72℃终延伸10min72℃13.结果3.1重组转移载体的构建3.1.1重组转移载体pLM-F-VP2的构建3.1.1.1pT-F和pT-VP2的鉴定选用上游引物F-up和下游引物F-down，把pT-F当作模板开展PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳分析，在1662bp处能看到明显的目标DNA条带，实验结果如图3-1，选VP2-up和VP2-down这组引物，将pT-VP2作为模板完成PCR，1%琼脂糖凝胶电泳分析显示1338bp处有明显靶标条带，实验结果如图3-2，将筛选验证后的阳性克隆交给Invitrogen公司进行DNA测序。2000bp1000bpM2000bp1000bpM1M12000bp1000bp图3-1F基因的PCR结果.图3-1F基因的PCR结果.M.DNAMarkerDL2000;M.DNAMarkerDL2000;Lane1.PCRproductofF.图3-2VP2基因的PCR结果.M.DNAMarkerDL2000;M.DNAMarkerDL2000;Lane1.PCRproductofVP2.3.1.2片段F和VP2的融合利用SOE-PCR扩增片段F和VP2后，用F-up/VP2-down引物体系开展PCR验证，通过1%琼脂糖凝胶电泳观察，结果显示产物条带在3100bp左右清晰可见，和预期片段大小相符，检测结果如图3-3所示。5000bp2500bp5000bp2500bpM1图3-3F-VP2SOE-PCR(F-up/VP2-down)鉴定结果.M.DNAMarkerDL15000;Lane1.F-VP2基因的PCR产物.3.1.3重组子pT-F-VP2的鉴定将胶回收产物进行加“A”反应，随后与pMD18-T载体连接并转化至E.iDH5α感受态细胞，接着提取质粒，采用1%琼脂糖凝胶做电泳实验，筛选在凝胶里移动慢的质粒，分别用PCR（F-up/VP2-down、F-up/F-down-linker、VP2-up-linker/VP2-down）以及XhoI+SalI双酶切法来检验。扩增实验证实情况如下，扩增产物在大概3100bp、1662bp、1338bp的范围呈现特异性条带，其结果见图3-4，酶切结果为双条带，条带大小和T载体（2692bp）、F-VP2（3100bp）的预计相符合，检测结果如图3-5，检验合格的阳性克隆送至Invitrogen公司测序，证实连接已经完成，随后于-20℃冷冻留待后续实验使用。M12M122000bp1000bM12M122000bp1000bp5000bp2500bpba图3-4pT-F-VP2PCR鉴定结果.a：(F-up/VP2-down)M.DNAMarkerDL15000;Lane1-2.pT-F-VP2的PCR产物.b:(F-up/F-downlinker、VP2-uplinker/VP2-down).M.DNAMarkerDL15000;Lane1-2.F和VP2基因的PCR产物.M125000bpM125000bp2500bp图3-5pT-F-VP2的XhoI和SalI双酶切鉴定结果.M.DNAMarker15000;Lane1-2.XhoI和SalI双酶切pT-F-VP2结果.3.1.4重组转移载体pLMI-F-VP2的构建和鉴定选用XhoI/Sal对pLMI和pT-F-VP2质粒做双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，能看到pT-F-VP2双酶切后有两处条带，大小和pMD18-T载体对应；而pLMI载体只有一条带，和线性化载体理论大小相符，检测结果见图3-6。2500bp5000bp75002500bp5000bp7500bpM12M1图3-6pLMI和pT-F-VP2的图3-6pLMI和pT-F-VP2的XhoI和SalI双酶切鉴定结果.a：M.DNAMarkerDL15000;Lane1.XhoI和SalI双酶切pLMI结果.b：M.DNAMarkerDL15000;Lane1-2.XhoI和SalI双酶切pT-F-VP2结果.对pLMI载体使用XhoI/SalI进行双酶切，然后将其和F-VP2片段连接并转化，借助E.coliDH5α感受态细胞来转化重组质粒，根据蓝白斑颜色的不同筛选阳性克隆，经过菌液PCR扩增检测，成功得到3100bp目的片段的扩增，对pLMI-F-VP2重组质粒做双酶切鉴定，电泳图谱中能清楚看到两条大小和线性化载体对应的预期条带。（图3-8）M1M12500bp500M1M12500bp5000bp7000bp5000bp2500bp图3-8pLMI-F-VP2的XhoI和图3-8pLMI-F-VP2的XhoI和SalI酶切结果.M.DNAMarkerDL15000;Fig.3-8TheidentificationresultofpLMI-F-VP2.M.DNAMarkerDL15000;Lane1.TheresultsofpLMI-F-VP2digestedwithXhoIandSalI.图3-7pLMI-F-VP2的PCR鉴定结果.M.DNAMarkerDL15000;Fig.3-7ThePCRresultofpLMI-F.M.DNAMarkerDL15000;Lane1.PCRproductofpLMI-F-VP2.3.2重组杆状病毒穿梭载体的鉴定开展针对转化pLMI-F-VP2重组载体的E.iDH10Bac感受态细胞的蓝白斑筛选，挑取白色单菌落放到3mLLB液体培养基中，于37℃培养12-16小时进行增殖，用碱裂解途径获取BacmidDNA供后续实验使用。3.2.1重组穿梭转移载体的鉴定3.2.1.1重组穿梭转移载体rBac-LMI-F的鉴定使用rBac-LMI-F-VP2作为模板进行PCR鉴定：采用F-up/VP2-down引物对扩增出3100bp特异性条带（图3-9）；使用M13-47/F-up引物对获得5000bp扩增产物。上述结果证实F-VP2目的基因已成功整合至杆状病毒基因组中（图3-10）。M1M125000bpM15000bp2500bp图3-9重组杆状病毒rBac-LMI-F-VP2图3-10重组杆状病毒rBac-LMI-F-VP2的PCR的PCR结果（F-up/VP2-down）.结果（M13-47/F-up）M.DNAMarkerDL2000;M.DNAMarkerDL15000;Lane1.rBac-LMI-F-VP2的PCR产物.Lane1-2.rBac-LMI-F-VP2的PCR产物.结论本研究通过基因工程技术成功构建了含有F-VP2抗原基因的重组杆状病毒二联疫苗表达系统。本研究开发的重组杆状病毒二联疫苗不仅能实现抗原基因的高效表达，还能显著增强鸡体的免疫保护效果，为禽类病毒性疾病的防控提供了新的疫苗候选株。参考文献KumarS,KoulM.Newcastlediseas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